Biologia animale 3

PROBLEMA DEL SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA A MONTE DELLA FORCELLA

Lo srotolamento del DNA a livello della forcella induce un superavvolgimento a monte della

forcella stessa. Dovrebbe esserci una rapida rotazione dell’elica di DNA necessaria a

contrastare il fenomeno, ma non riesce. Interviene un enzima TOPOISOMERASI (tipo I e II

in relazione a quanti filamenti tagliano) come la DNA GIRASI (per i procarioti) che taglia i

superavvolgimenti positivi (avvolgimenti destrosi, nella stessa direzione in cui la doppia elica è

già avvolta) creando punti di rotazione per poi ricucirli. La topoisomerasi I non richiede ATP a

differenza della II. La topoisomerasi nella sua catena amminoacidica presenta con gruppo OH

con il quale rompe il legame fosfodiestere a livello del super avvolgimento. Il legame con il suo

OH e il fosfato del nucleoide rompe uno dei due filamenti.

Senza le topoisomerasi il DNA non può replicarsi, per questo sono stati usati inibitori delle

topoisomerasi come droghe anti-cancro per fermare la proliferazione delle cellule maligne;

purtroppo questi inibitori possono fermare anche la divisione di cellule normali; possono essere

colpite alcune cellule (cellule dei capelli, midollo osseo) che necessitano di dividersi

continuamente, ciò spiega effetti collaterali quali la perdita dei capelli o anemia.

FEDELTA’ DI REPLICAZIONE: L’accuratezza della replicazione del DNA è fondamentale per

la corretta trasmissione dell’informazione genetica. Valutando la frequenza di basi male

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appaiate in una varietà di geni, si stima che il DNA polimerasi inserisca un errore ogni 10^9 basi

ma solo il 25% DEL GENOMA UMANO HA UNA FUNZIONE. La DNA polimerasi è in grado di

discriminare appaiamenti corretti da appaiamenti non corretti.

SINTESI DELLE PROTEINE- TRASCRIZIONE GENICA (Passaggi 1 e 2 DNA->RNA)

Flusso di informazioni in una cellula eucariotica: il DNA dei cromosomi, localizzato nel nucleo,

contiene l’intero corredo cromosomico di informazioni genetiche. 1)I siti selezionati nel DNA

sono trascritti (Gene= frammento di DNA in fase di trascrizione) nei pre-mRNA che a loro volta

2) sono maturati a RNA messaggeri. 3)Gli RNA messaggeri sono trasportati fuori dal nucleo nel

citoplasma, 4)dove vengono tradotti in polipeptidi dai ribosomi che scorrono lungo l’mRNA.

5)Dopo la traduzione, il polipeptide si ripiega nella sua conformazione

nativa.

L’RNA è un unico filamento di nucleotidi legati da legame fosfodiestere

e aventi come zucchero il ribosio. Presenta un’estremità 5’ e una 3’.

Le basi azotate sono: adenina, guanina, uracile (invece della timina),

citosina. Presenta differenti strutture secondarie possibili grazie a

legami idrogeno tra le basi azotate complementari appartenenti alla

stessa molecola.

La trascrizione avviene grazie alla RNA POLIMERASI (1 nei procarioti, 3

negli eucarioti + quella mitocondriale) che lavora in direzione 5’->3’ e

trascrive quindi il filamento di DNA 3’->5’, al quale sarà complementare e

sarà uguale al filamento di DNA 5’->3’. La RNA polimerasi si posiziona sul

filamento di DNA dove inizia il gene e funge lei stessa da elicasi (apre i

due filamenti di DNA); in questo processo non sussiste il problema di

superavvolgimento dell’elica perché RNA e DNA rimangono legati per un

breve tratto ma poi il filamento di DNA trascritto può legarsi

nuovamente all’altro filamento ed avvolgersi ad elica (la bolla non si allarga come nella

duplicazione). La RNA polimerasi è dotata di attività elicasica. L’RNA polimerasi catalizza la

formazione di un legame fosfodiesterico legando l’estremità libera 3’ dell’ultimo nucleotide della

catena nascente con il fosfato del nuovo nucleotide, la cui base è complementare a quella del

nucleotide della catena del DNA stampo. La fine del gene è segnalata alla RNA polimerasi da

una sequenza di nucleotidi ripetuti che termina la sintesi di RNA e causa il rilascio del pre-

mRNA neosintetizzata. Il DNA deve contenere, oltre

all’informazione genetica per una data

proteina, anche dei segnali che indichino

dove questa informazione inizia e finisce,

cioè dove inizia e finisce anche la

trascrizione.

Anteriormente al SITO DI INIZIO si ha un SEGMENTO PROMOTORE chiamato SEGNALE

DI INIZIO; l’RNA polimerasi non è in grado di legarsi direttamente al sito d’inizio. Anche il

sito promotore fa parte del gene; più precisamente quindi il segmento che viene trascritto non

coincide interamente con il gene ma è chiamato unità di trascrizione del gene, la quale assieme

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al sito promotore costituisce il gene. mRNA sintetizzato in direzione 5’->3’, il filamento stampo

è letto in 3’->5’. PROMOTORE (regione di controllo)=sequenza di nucleotidi che sta a monte al

sito di inizio trascrizione. Consente l’attacco dell’RNA polimerasi e di fattori che facilitano

l’inizio della trascrizione. Il sito di attacco dell’RNA polimerasi è su uno dei due filamenti. Se il

nucleotide di inizio è il numero +1, il promotore si trova a -35/-20 nucleotidi.

La sequenza del promotore è riconosciuta dalle PROTEINE FATTORI DI TRASCRIZIONE

(TF) che nei procarioti è uno solo e si chiama fattore σ sigma; negli eucarioti diverse sono le

proteine che intervengono a promuovere il legame fra RNA polimerasi II con il promotore.

Trascrizione nei procarioti: 1-riconoscimento del promotore (fattore sigma + RNA polimerasi),

2-trascrizione, 3-termine della trascrizione (sito di terminazione), 4-distacco dell’RNA

polimerasi.

Trascrizione negli eucarioti: negli eucarioti le RNA polimerasi si dividono in:

- pol I: trascrive gli rRNA (RNA ribosomiali), tranne il più piccolo, ovvero il 5S.

- pol II: trascrive gli mRNA e alcuni snRNA

- pol III: trascrive i tRNA, l’RNA 5S, e alcuni snRNA

- pol mitocondriale: trascrive RNA mitocondriali

TRASCRIZIONE GENICA RNA POLIMERASI II NEGLI

EUCARIOTI

La trascrizione negli eucarioti ha inizio mediante il

riconoscimento da parte di fattori di trascrizione del

promotore (costituito da TATA BOX): TFIID, TFIIA, TFIIB.

(TF fattore di trascrizione, polimerasi che aiutano, lettera

che identifica il particolare fattore).

TFIID si lega direttamente alla TATA BOX. La sua capacità

di legare le sequenze promotrici gli è conferita dalla sua

subunità TATA-binding protein TBP. Successivamente si

associato gli altri fattori TFIIA e TFIIB. Viene reclutata

l’RNA polimerasi II legata a fattori proteici e al fattore

TFIIF ed i fattori TFIIE e TFIIH che si associa al

promotore. TFIIH è una CHINASI che fosforila la polimerasi

II con consumo di un ATP, attivandola dando inizio alla

trascrizione. Il TFIIH è l’unico con attività enzimatica

elicasica.

I vari TF coinvolti costituiscono un COMPLESSO chiamato

BASALE/DI PRE-INIZIO. 70

In seguito alla trascrizione genica attuata da parte dell’RNA polimerasi II si genera un

trascritto primario pre-mRNA che prima della traslocazione dal nucleo al citoplasma è

sottoposto a MATURAZIONE: trasformazioni chimiche che lo portano a essere m-RNA maturo:

Processi che aumentano la stabilità dell’mRNA:

- Aggiunta di un cappuccio all’estremità 5’-> viene legata una molecola di 7-metilguanosina

(guanosina metilata in posizione 7 dell’anello purinico e che è orientato opposto rispetto agli

altri nucleotidi per il legame che forma) tramite un legame 5’->5’ (e non3’->5’ come ci si potrebbe

aspettare). Tale cappuccio è importante perché esso verrà riconosciuto dalla subunità minore

dei ribosomi per dare via alla sintesi proteica. Inoltre aumenta la stabilità del messaggero

perché le esonucleasi citoplasmatiche non riconoscono il legame 5’-5’ e quindi non c’è rischio che

possano degradare la molecola di RNA.

-Aggiunta di una coda di poliA all’estremità 3’->taglio di 10-35 nucleotidi a valle della sequenza

AAUAAA e aggiunta di 50-250 nucleotidi con base Adenina da parte della poliA-polimerasi che

catalizza l’aggiunta di sequenze poli-A all’RNA senza richiedere un DNA stampo. La coda

protegge l’mRNA dall’attacco delle nucleasi.

Processi di rimozione di sequenze non codificanti:

-splicing degli introni: il DNA è costituito da esoni

(sequenze che codificano) e introni (sequenze che non

codificano); questi ultimi vengono tagliati dal pre-mRNA.

Ciò avviene perché a livello degli introni si forma un cappio

che in prossimità della fine ha un nucleotide con base

Adenina che con il proprio OH rompe il legame fra l’ultimo

nucleotide dell’esone e il primo dell’introne e si lega a

quest’ultimo. A sua volta l’OH dell’ultimo nucleotide

dell’esone rompe il legame fra l’ultimo nucleotide

dell’introne e il primo dell’esone successivo: si slega il

cappio costituito dall’introne che avrà all’estremità un OH

in 3’. Si uniscono quindi l’ultimo e il primo nucleotide del

primo e del secondo esone grazie all’aiuto di una ligasi.

Lo splicing è attivato dallo SPLICINGSOMA, un insieme

di piccole particelle nucleari formate da piccole molecole

di RNA e proteine snRNA (small nuclear ribonucleopritein

particles) nel quale l’attività enzimatica è supportata non 71

dalle proteine ma dalle molecole di RNA (ribozimi= RNA ad attività catalitica).

Nei procarioti non vi è la distinzione in esoni ed

introni e l’m-RNA viene trascritto già maturo -> non

va incontro ad aggiunta di cappuccio e code e

soprattutto allo splicing. L’m-RNA dei procarioti è

invece chiamato POLICISTRONICO perché ogni gene

codifica per più proteine, generalmente enzimi

coinvolti nella medesima via metabolica, intermediate

da UTR.

L’m-RNA degli eucarioti è chiamato

MONOCISTRONICO perché ogni gene codifica per

una sola proteina. Durante la sintesi proteica, non

tutto l’m-RNA viene tradotto in proteina ma

solamente la parte intermedia perché le sequenze

all’estremità 5’ e all’estremità 3’ non sono codificanti (sequenze UTR: untraslated regions).

-Splicing alternativo: in due cellule differenti, con differenti specificità nello stesso gene le

sequenze considerate introni ed esoni non coincidono-> si avranno quindi proteine differenti

derivanti dalla medesima sequenza di DNA e quindi dallo stesso trascritto primario che danno

origine alle isoforme proteiche diverse.

TRASCRIZIONE GENICA DA PARTE DELLA RNA POLIMERASI I

La RNA polimerasi I sintetizza gli R-RNA (ribosomiali). I geni ribosomiali s