Biologia animale 3

Nucleo

Parliamo di cellule eucariotiche in quanto nei procarioti non c'è. È un organello che occupa il 10% del volume della cellula, costituito da una doppia membrana: involucro nucleare.

Attività del nucleo

Avvengono processi fondamentali per la vita della cellula. Contiene i cromosomi e li suddivide durante la divisione cellulare; duplica il DNA, trasporta fattori di regolazione e prodotti dei geni tramite i pori nucleari; avvengono sintesi e maturazione degli RNA e assembla le subunità ribosomiali; organizza duplicazione.

È in comunicazione con il citoplasma attraverso i pori nucleari attraverso i quali possono uscire le molecole. Durante l'evoluzione della cellula essa ha sentito il bisogno di confinare il nucleo per proteggere il suo patrimonio genetico dalle forze generate dal citoplasma. (già parlato dell'involucro nucleare).

Involucro nucleare

L'involucro nucleare ha una struttura complessa che consiste di due membrane: interna ed esterna che è in comunicazione con il reticolo endoplasmatico rugoso. Le due membrane agiscono da barriera e sono unite a livello dei pori nucleari, gli unici canali attraverso i quali piccole molecole polari e macromolecole sono in grado di passare attraverso l'involucro. Piccole molecole e proteine con massa inferiore a 20-40 kd attraversano il poro con diametro 9 nm per diffusione facilitata. La maggior parte delle proteine e l'RNA passano per trasporto attivo quindi con consumo di energia.

Lamina nucleare

Sottostante la membrana interna si trova la lamina nucleare, un reticolo fibroso che fornisce supporto strutturale al nucleo ed è formata da proteine dette lamine.

Poro nucleare

Struttura simile ad una ruota costituito da anelli paralleli, ognuno costituito da otto subunità che delimitano il bordo della ruota. Otto raggi connettono i due anelli e si estendono fino al trasportatore centrale nel mezzo della ruota. Il trasportatore può essere considerato come una struttura a diaframma che si apre e chiude per permettere il passaggio di particelle con differenti dimensioni. Mette in comunicazione il citosol con il nucleoplasma.

Trasporto attivo

Le proteine sono sintetizzate solo nel citoplasma. Nel nucleo servono le proteine basti pensare a tutti gli enzimi che servono nella duplicazione o le proteine adibite all’impaccamento del DNA. Le proteine che entrano nel nucleo presentano segnali (sequenze di amminoacidi) di localizzazione nucleare (NLS) per la loro traslocazione (Lys-Arg e Lys-Lys-Lys-Lys).

Ciclo di importazione ed esportazione

• Ciclo di importazione: La sequenza NLS fa in modo che la proteina importina si leghi alla proteina che deve entrare “cargo”. L’importina può passare attraverso il trasportatore trascinando con sé la proteina cargo. All’interno del nucleo interviene una proteina Ran-GTP che si lega all’importina inducendo il rilascio della proteina cargo. Il complesso Ran-GTP-importina è ritrasportato nel citosol dove l’idrolisi del GTP a GDP è accompagnata dal rilascio dell’importina.
• Ciclo di esportazione: Nel caso dell’esportazione il cargo principale è rappresentato dall’RNA che viene prodotto con segnali di esportazione NES. La proteina Ran-GTP si lega all’esportina all’interno del nucleo, promuovendone il legame con il cargo, rappresentato da un complesso ribonucleoproteico. Il complesso esportina-cargo-Ran-GTP viene esportato attraverso il poro nucleare nel citosol dove l’esportina e il suo cargo sono rilasciate da Ran in un processo accompagnato dall’idrolisi di GTP a GDP. Quindi l’esportina ritorna nel nucleo dove può ricominciare il ciclo di esportazione.

Entrambi i cicli sono guidati da gradiente di concentrazione della proteina Ran-GTP. Il Ran-GDP all’esterno deve rientrare nel nucleo per essere riconvertito a Ran-GTP. Il Ran-GTP deve essere alto nel nucleo perché promuove la dissociazione proteina-importina. È mantenuto dalla presenza di un GEF (fattore di scambio dei nucleotidi guanilici) nel nucleo e di un GAP (fattore attivante la GTPasi) nel citosol.

Nucleolo

Il nucleolo è una regione distesa di rilevanti dimensioni dove avviene la formazione dei ribosomi. Nella regione organizzatrice del nucleolo sono situati i geni che codificano per l’RNA ribosomiale. L’rRNA prodotto dalla trascrizione e le proteine ribosomiali (che provengono dal citoplasma) vengono impiegati per la sintesi delle subunità ribosomiali che in tale fase sono definiti preribosomi poi passano nel citoplasma dove avviene la formazione del ribosoma. Negli eucarioti 4 r-RNA, 3 sintetizzati nel nucleolo e 1 il più piccolo da un’altra parte. Ai r-RNA si legano già delle proteine che matureranno nel citosol.

DNA

Il DNA è costituito da 2 filamenti antiparalleli e complementari che si avvolgono a formare una doppia elica destrorsa. Solo così le basi si trovano di fronte e possono interagire con legame a idrogeno in modo complementare purina-pirimidina (2 per A-T e 3 per C-G).

Quando fu scoperto questo modello suggeriva il meccanismo con cui le cellule potevano replicare il loro patrimonio genetico. Prima della divisione cellulare i due filamenti della doppia elica si separano in modo da fungere ognuno da stampo di un nuovo filamento complementare. Gli scheletri dei due filamenti (costituiti da uno zucchero e un gruppo fosfato alternati) sono separati tra loro da una distanza di 1.1 nm e questo spazio è occupato da una purina e una pirimidina. Ogni coppia di basi giace su un piano orizzontale più o meno perpendicolare all’asse maggiore della molecola.

Il modo in cui i due filamenti sono avvolti crea due solchi, uno maggiore e uno minore. Antiparallelo: i legami fosfodiesterici che uniscono il carbonio 5’ di un nucleotide al carbonio 3’ dell’altro nucleotide hanno orientamento opposto nei due filamenti. Partendo dall’alto il filamento di sinistra ha orientamento 5’->3’, il filamento di destra ha orientamento 3’->5’. Importante sia per la replicazione che duplicazione. Ogni giro completo di elica include 10-11 paia di basi.

Cromatina e cromosoma

Il nucleo contiene la cromatina: materiale nucleare, insieme di tutte le molecole di DNA che stanno nel nucleo con tutte le proteine associate che possono essere istoniche o non istoniche (coesine e condensine).

Istoni: gruppo di proteine relativamente piccole e basiche il cui elevato numero di arginina e lisina li rende carichi positivamente. L’interazione fra gli istoni e il DNA che è carico negativamente è stabilizzata da legami ionici. Il DNA grazie ai due tipi di proteine si compatta in vari livelli. Il DNA è più decondensato nell’interfase del ciclo cellulare e si condensa nella mitosi in cromosomi.

Cromosoma: prima della duplicazione è una singola molecola di DNA. Strutture individuali in cui è divisa la cromatina. Dopo la duplicazione un cromosoma è formato da due molecole di DNA identiche tra loro detti cromatidi fratelli uniti saldamente dal centromero. Il termine cromosoma si riferisce più precisamente al cromosoma metafasico con caratteristica forma a X. Quando le due molecole raggiungono massimo livello di condensazione e sono associate alle proteine il cromosoma è detto metafasico. In tutte le altre fasi del ciclo cellulare più che di cromosomi si parla di cromatina perché le molecole di DNA non sono distinguibili in quanto formano un unico groviglio.

Compattamento del DNA

Se prendo una molecola di DNA che sta nel nucleo non in fase di mitosi il DNA è lasso. Poi inizia a compattarsi secondo diversi livelli. Alla fine quando la cellula si avvicina alla fase della mitosi ogni cromosoma si rappresenta a X. Formato da due cromatidi fratelli. Essi sono identici e uniti a livello del centromero. Il fatto che siano ben compatti comporta che si stacchino bene per andare in due nuclei diversi. Il grado di compattamento varia in corrispondenza alla fase della vita della cellula. Compattando DNA facciamo sì che ci stiano nello spazio ristretto del nucleo. Il DNA è più lasso interfase quando la cellula deve ingrandirsi e quindi produrre tante proteine per tutti gli organuli. La RNA polimerasi deve poter leggere tutte le sue info.

Livelli di compattamento del DNA

• 1° livello di compattamento: “Collana di perle” - La compattazione del DNA nei cromosomi avviene grazie agli istoni e alle proteine non istoniche. DNA + proteine = cromatina. Istoni: piccole proteine basiche con carica positiva che costituiscono la struttura portante della cromatina. Il nucleosoma rappresenta l’unità di cromatina: 2 coppie di 4 istoni (8 proteine istoniche 2 H2A, 2 H2B, 2 H3 e 2 H4) formano un core istonico attorno al quale si avvolge la doppia elica di DNA per due volte (146 coppie di basi). L’istone H1 stabilizza il DNA in entrata e in uscita dal nucleosoma. I nucleosomi sono collegati da DNA linker.
• 2° livello di compattamento: “Solenoide” - La collana di perle si avvolge a solenoide che contiene da 6 a 8 nucleosomi per giro e forma domini ad ansa che si addensano ulteriormente nei cromosomi. Intervengono istoni H1 per stabilizzare avvolgimenti della spirale.
• 3° livello di compattamento: “Super solenoide” - La spirale del solenoide forma delle anse.
• 4° livello di compattamento: Cromosoma metafasico - È il massimo grado di compattamento, si forma nella mitosi. Formato da due cromatidi fratelli e uniti a livello del centromero. I cromatidi fratelli sono filamenti di DNA di cui uno è la replica dell’altro.

Durante l’interfase la maggior parte dei cromosomi si dimostra scarsamente visibile in quanto decondensati, formano un unico groviglio. I cromosomi hanno strutture diverse analizzando il cariotipo a seconda della posizione del centromero: metacentrico il centromero è messo a metà, i due bracci sono detti P e Q in quanto non hanno proprio la stessa lunghezza; submetacentrico quando il centromero è più spostato verso un’estremità, acrocentrico quando i due cromatidi si uniscono alle due estremità Y. I bracci P si riducono a satellite e stalk. Il satellite è sempre compatto e non viene mai trascritto. Le parti terminanti sono dette telomeri.

Ciclo cellulare

Interfase

• G1: fase di accrescimento e sintesi proteica
• S: replicazione del DNA
• G2: sintesi di proteine necessarie perché avvenga la mitosi, intervallo necessario perché la cellula controlli che il DNA si è replicato correttamente

Mitosi e citocinesi

La cromatina è una struttura altamente dinamica, con possibili livelli di organizzazione che riflettono la sua attività.

Interfase:

• GAP 1: tanto DNA trascritto in RNA tradotto in proteina. Il DNA è lasso decondensato.
• Fase S: DNA ancora lasso, i cromosomi sono duplicati.
• GAP 2: DNA inizia a compattarsi in preparazione della mitosi per formare i cromatidi fratelli.

La cromatina è decondensata e distribuita in tutto il nucleo sotto forma di eucromatina, essa è attivamente espressa cioè trascrivibile. In piccola quantità può essere condensata sotto forma di eterocromatina in quei segmenti che non vengono tradotti (es zona satellite del cromosoma Y). Se questi segmenti sono contenuti in tutte le cellule si dice eterocromatina costitutiva e non sono mai trascritte. Alcune zone di cromatina possono essere condensate in alcune cellule ma in altre no si dice eterocromatina facoltativa e varia secondo l’attività trascrizionale del tipo cellulare. Queste zone che rimangono condensate sono trascrizionalmente inattive. Mitosi: la cromatina è tutta compattata: eterocromatina.

Nella profase (prima fase della mitosi) si hanno i cromosomi metafasici, massimo livello di compattamento.

Esempio di eterocromatina facoltativa

Gattina calico. Nelle femmine di mammifero, compreso l’uomo, uno dei due cromosomi X viene inattivato per conversione in eterocromatina (corpo di Barr) all’inizio dello sviluppo. È un processo embrionale casuale: l’X di derivazione paterna e quello di derivazione materna hanno uguali possibilità di venire inattivati in qualsiasi cellula. La formazione del corpo di Barr è dovuta all'azione della regione Xic, X inactivation centre. Se è attiva il cromosoma viene inattivato. Una volta che si è stabilita la struttura condensata della cromatina di un cromosoma X, qualche processo sconosciuto fa ereditare fedelmente la struttura durante le replicazioni successive del DNA. L’X condensato viene riattivato durante la formazione delle cellule germinali.

Nel gatto calico, un allele per il colore nero del pelo è su un cromosoma X, un allele per il colore arancione è sull’altro cromosoma X. Colore del pelo a macchie nere e arancioni è sicuramente femmina. Questo ha due cromosomi X uno paterno e uno materno con due geni del colore. Uno dei due cromosomi X è sempre altamente condensato in eterocromatina, quindi inattivo detto corpo di Barr. Gruppi di cellule hanno attivato il cromosoma X materno, altre quello paterno. Il gatto è stato clonato: carbon copy, pur avendo lo stesso patrimonio genetico, non presenta la colorazione a tartaruga a dimostrazione che la disattivazione di un cromosoma X è casuale. Ipotesi della Compensazione del dosaggio: la X ha già tanti geni il secondo viene disattivato. Nel maschio ho un cromosoma Y acrocentrico con pochi geni e necessita di uno X.

Genoma e cariotipo

Il contenuto di DNA nelle cellule di una specie animale è mantenuto costante.

• Genoma: insieme di tutti i cromosomi che stanno in un individuo, quindi è l’insieme di tutti i geni di un individuo. I batteri hanno una singola molecola di DNA mentre in una cellula animale vi sono 46 cromosomi.
• Cariotipo: rappresentazione ordinata del corredo cromosomico di un individuo. Nell’uomo 23 coppie di cromosomi a unico filamento: 22 di autosomi e una coppia di cromosomi a unico filamento sessuali. La dimensione del genoma non è correlata con la scala di evoluzione dell’individuo. Il cariotipo di una cellula è dato dal numero e dalla morfologia dei suoi cromosomi.

Analisi del cariotipo

• Prelievo di sangue
• Centrifugazione per ottenere globuli bianchi
• Stimolazione alla mitosi delle cellule
• Blocco delle cellule in fase mitotica con colchicina
• Le cellule vengono fatte scoppiare immergendole in una soluzione per lisi osmotica. Messe quindi in una soluzione ipotonica.
• La piastra metafasica viene isolata. I cromosomi condensati possono essere separati
• I cromosomi vengono colorati col metodo del ‘banding’ nel quale assumono una colorazione a bande o fasce colorate.
• Bandeggio cromosomico: Dei coloranti specifici riconoscono delle sequenze di nucleotidi nei vari cromosomi e consentono di individuare i bracci p e q, bande e sottobande in base al grado di condensazione dei cromosomi mitotici. La colorazione più conosciuta è la Giesma che riconosce regione ricche di AT.
• Dopo la colorazione si osservano al microscopio un’alternanza tra bande G-positive scure, G-negative chiare. Esiste anche il cariotipo a fluorescenza. I cromosomi trattati con nucleotidi che riconoscono i loro complementari e sono legati a una o più molecole fluorescenti. Le coppie di cromosomi omologhi sono identificate ricercando cromosomi della stessa dimensione e colore.
• La piastra metafasica viene fotografata.

Ogni coppia di cromosomi (cromosomi omologhi) contiene un cromosoma di origine paterna e un cromosoma di origine materna. Ciò avviene in tutti gli organismi a riproduzione sessuata. I cromosomi sono presenti in (23) coppie di singoli filamenti nelle cellule somatiche (tutte le cellule di un organismo tranne i gameti che hanno metà del corredo cromosomico quindi hanno 23 cromosomi a singolo filamento/cromatidi) e i membri di una coppia sono i cromosomi omologhi. Se una cellula contiene 2 cromosomi di ogni tipo, (cioè 23 coppie di cromosomi) si dice che possiede un corredo cromosomico diploide; se invece è presente un cromosoma di ogni coppia di omologhi, si dice che il corredo è aploide (caso dei gameti). Nell’uomo il numero diploide è 46 cromosomi, 23 coppie di omologhi.