Bioingegneria cellulare e dei tessuti

Bioingegneria cellulare e dei tessuti

Lezione 2: Definizione di bioreattori

Un bioreattore è lo spazio progettato in cui avvengono le reazioni biologiche. Quindi, il bioreattore è essenzialmente un risultato ingegneristico e la sua progettazione ha costituito una sfida per i bioingegneri. Il bioreattore crea e fornisce l'ambiente ideale perché la reazione biologica si realizzi in condizioni operative precise (ad esempio pH, temperatura, pressione, fornitura di nutrienti e rimozione dei rifiuti, per fare in modo che). Questo avviene attraverso l'uso di sensori, ad esempio per il controllo di pH e temperatura, per garantire il prodotto finito. È indispensabile garantire la sterilità: le cellule non devono entrare in contatto con organismi, batteri o funghi che ne causano la morte.

Esempio: stiamo implementando un processo biologico, quindi cellule nel reattore; il pH va mantenuto pari a 7. Se il sensore rileva un calo, dovuto alla produzione di un metabolita, il controllore emette una base in quantità tale da ristabilire il pH desiderato, e similarmente avviene se il pH dovesse salire.

Un po' di storia

Il bioreattore è un apparato storico noto fin dall'antichità. Le antiche culture sono state in grado di risolvere le sfide del design della bioingegneria per scopi pratici come la produzione di vino e birra da mera esperienza e osservazioni.

Milestones storiche

Il contributo sinergico tra biologia e ingegneria a questa ricerca è stato sostanziale e ha portato a importanti miglioramenti industriali come la riduzione dei tempi di sviluppo del processo in un'ampia varietà di bio-processi. L'istruzione e la formazione di nuovi bioingegneri hanno sviluppato un pensiero di ingegneria biochimica che ha avuto un impatto sull'industria con nuove prospettive in cui l'ambito della biologia è stato fuso nel quadro ingegneristico di ideazione, progettazione e gestione dei processi industriali. Le ascese della biotecnologia del ventesimo secolo hanno creato una spinta per il progresso della progettazione dei bioreattori.

Esempi di bioreattori: differenti strategie di agitazione

Ci possono essere varie strategie: possiamo avere ad esempio un recipiente in cui la miscelazione avviene per via meccanica, il miscelatore al centro va ad agitare il liquido all’interno. Questo tipo di bioreattore è ampiamente usato perché è molto versatile, consente una buona operatività e una buona funzionalità. Tuttavia, necessita di una componente meccanica all’interno che comporta un aumento della complessità perché va controllata la reazione chimica.

Altri due bioreattori: 1) Fonda l’agitazione sulle bolle, in questo caso vengono utilizzati per reazioni multi-fasiche; non ha componenti meccaniche all’interno e fornisce un minore apporto di ossigeno. 2) Va ad agitare le cellule reagenti sfruttando la gravità, non vi è alcuna componente meccanica e va utilizzato per determinate reazioni.

Tendenze recenti nella progettazione e nel funzionamento dei bioreattori

L'accesso a computer per calcoli complessi ha consentito calcoli precedentemente troppo impegnativi da eseguire e prevedere. In questo modo, il lavoro di progettazione può essere svolto in tempi molto ridotti e con minori sforzi cerebrali, al fine di chiarire reti metaboliche, dinamiche dei fluidi e modelli cinetici più complessi della cellula. Inoltre, l'accesso a un'elettronica più compatta e stabile, grazie alla disponibilità di tecniche di fabbricazione miniaturizzate nell'industria elettronica e del software, ha facilitato il trasferimento di segnali nell'ambiente microelettronico dei bioreattori. Le capacità dei programmi software e l'implementazione dell'elaborazione dei dati sono aumentate considerevolmente e sostanzialmente migliorate.

CDIO Concept: concetto sviluppato dall’MIT, uno degli approcci studiato per procedere all’implementazione del bioreattore. Si compone di 4 fasi: concezione, progettazione, implementazione e operatività. Si basa su un rinnovamento della formazione dell’ingegneria innovandosi dall’ingegneria convenzionale. Concezione; si parte da un’idea di business, valutazione dei bisogni della comunità e del mercato di riferimento.

Tendenze nelle aziende farmaceutiche

Process Analytical Technology (PAT): un sistema per progettare, analizzare e controllare i processi di produzione, sulla base di misurazioni continue nel tempo (cioè durante le fasi del processo) degli attributi critici di qualità e prestazione di materie prime, intermedi e processi, al fine di garantire una qualità accettabile del prodotto finale. Sulla conclusione del processo devono essere rintracciabili tutti i checkpoint di qualità, quindi è necessario avere delle materie prime conformi con le certificazioni, che tutti i processi intermedi forniscano le prestazioni attese per avere alla fine una qualità accettabile per la messa sul mercato.

Il termine "Analitico" include: approccio chimico, fisico, microbiologico, matematico e di analisi del rischio condotto in modo integrato. Quality by Design (QbD) per garantire l'accettabilità della qualità del prodotto finale al termine del processo industriale.

Sviluppo e produzione di nuovi bioprodotti

Ancora oggi l’industria farmaceutica e biotecnologica deve affrontare delle sfide, tra le quali:

• Trasferire l’idea del prodotto in un processo produttivo
• Avere un’idea di come implementarlo in una filiera produttiva
• Introdurre il prodotto nel sistema produttivo su larga scala, con conseguente immissione nel mercato globale

Un altro approccio pensato per costruire il design di un bioreattore è il Conceptual Design Methodology, studiando di volta in volta come rendere più semplice un progetto di bioreattore, mantenendo inalterate le prestazioni, fino ad arrivare al miglior design.

Lezione 3: Tipologia di bioreattori

I reattori ideali

I reattori ideali sono di tre tipi:

• Reattore discontinuo completamente miscelato (Batch)
• Reattore continuo completamente miscelato (Completely Stirred Tank Reactor, CSTR)
• Reattore continuo con flusso a pistone (Plug Flow Reactor, PFR), configurazione completamente differente

Principali differenze tra i reattori ideali

Differenza tra Batch e CSTR: elemento tempo. Il reattore Batch è un reattore discontinuo le cui reazioni chimiche e termiche che avvengono al suo interno sono spazialmente uniformi, di conseguenza tutto quello che accade nel reattore Batch accade in un determinato intervallo di tempo. Questo avviene perché il reattore è completamente miscelato. Noi inseriamo i reagenti in ingresso, essi si consumano per ottenere i prodotti e in un determinato istante di tempo in ogni punto la concentrazione della prima specie sarà identica.

Il reattore CSTR è un reattore continuo in cui ogni punto del reattore è caratterizzato dallo stesso valore delle variabili caratteristiche (temperatura, concentrazione, densità, viscosità, ecc.). Pertanto, in questo reattore, il fluido uscente avrà le stesse caratteristiche del fluido interno al reattore stesso. Una volta che la quantità viene consumata, viene subito ripristinata.

Il reattore PFR è caratterizzato da un moto ordinato del fluido attraverso il reattore, in modo tale che nessun elemento infinitesimo di fluido possa rimescolarsi con nessun altro elemento lungo l’asse di avanzamento della materia. L’unico mescolamento è quello normale rispetto all’asse del reattore.

Il Bioreattore Batch

Consiste in un recipiente in cui vengono introdotti dei reagenti attraverso un canale e l’uscita consente di raccogliere i prodotti. Quando usiamo il reattore Batch, il recipiente deve raggiungere determinate condizioni di temperatura e di pressione desiderate per una particolare reazione. Una volta che inseriamo i reagenti, sappiamo che per un tempo t conosciuto il bioreattore va tenuto chiuso in modo che solo dopo il tempo t si possa raccogliere quanto ottenuto dalla reazione. L’apparecchiatura è caratterizzata dal volume del recipiente, maggiore del volume della reazione, una superficie attraverso cui avvengono gli scambi di calore (spesso le reazioni chimiche portano ad un rilascio del calore, per fare in modo che il liquido non subisca variazioni notevoli di temperatura ci serviamo della superficie esterna che aiuta a mantenere costante la temperatura facendo passare del liquido refrigerante), inoltre è presente un agitatore meccanico che facilita il mescolamento dei reagenti.

Il Bioreattore Batch: Caratteristiche

• Ideale per reazioni in fase liquida, sconsigliato per reazioni in fase gassosa perché le variazioni di pressione troppo elevate non sono compatibili con questa struttura
• Può essere utilizzato su scala di laboratorio e su scala industriale
• Molto diffuso nelle industrie farmaceutiche

Bilancio di Materia

E-U=A+T
E= quantità in entrata
U= quantità in uscita
A= quantità accumulata
T= quantità trasformata

In un reattore Batch: E=0; U=0; T=-A

Quantità trasformata: La quantità trasformata [moli/t] è data da [moli/t] (specie inserita, trasformata nel tempo) = velocità di trasformazione della specie A [moli/V*t]
V = volume utile nel reattore (quantità di fluido presente nel reattore dopo il caricamento) [V]

Quantità accumulata Δ: La quantità accumulata [moli/t] in un dato intervallo è uguale a
N = numero di moli della specie A [moli] = numero di moli della specie A all’istante iniziale [moli]
N0 = C × V
C = concentrazione della specie A [moli/t]
Il volume è costante, cambia la concentrazione della specie A.

Quindi, tornando al bilancio di materia, otterremo che la materia trasformata = - materia accumulata.

Assunzioni

• Volume costante
• Temperatura costante
• Volume ben mescolato (sta a indicare che fino ad un determinato istante di tempo la specie A ha la stessa concentrazione in ogni punto del bioreattore)

Dividiamo per il volume del reattore V:
Δ→0

Per posso approssimare il rapporto incrementale con la sua derivata integrando ottengo: ,(per esplicitare le variabili)

Interpretazione geometrica

Cinetica di ordine zero: r è costante.

Cinetica di primo ordine: r=kC. La velocità cinetica non è più costante ma dipende dalla concentrazione della specie A, k è la costante cinetica della reazione di primo ordine ed è espressa in [s^-1].

Quindi l’equazione di bilancio: Posso scriverla come integrando ottengo applicando l’esponenziale ottengo la concentrazione finale.

Tempo di Dimezzamento

Tempo che consente al bioreattore di ottenere la metà della concentrazione iniziale, si calcola per valutare le prestazioni del bioreattore.

Produzione di insulina ricombinante

L’insulina è un ormone proteico prodotto da importanti cellule del pancreas, chiamate beta, che si trovano nelle isole di Langherans. Questo ormone è indispensabile per regolare il metabolismo del glucosio dell’intero organismo. Quando ci nutriamo, scatta un meccanismo metabolico che rilascia insulina per abbassare la concentrazione di glucosio nel sangue.

Gli individui affetti da diabete non producono questa proteina (o perlomeno non in quantità sufficiente). Quindi l’insulina viene loro somministrata quotidianamente attraverso una somministrazione esogena. Occorrevano grandi quantità di tale farmaco che, prima della scoperta dell’ingegneria genetica, veniva estratto dal pancreas di suini o bovini. Non essendo identica a quella umana, l'insulina di origine animale provocava nei pazienti numerosi fenomeni di intolleranza o reazioni allergiche, causando seri danni al fegato, alla vista e a volte anche la morte.

L’insulina umana è stata una delle prime proteine ad essere prodotte con la tecnica del DNA ricombinante, inserendo il gene umano in alcuni organismi unicellulari, come Escherichia coli, ottenendo così grandi quantità di insulina perfettamente identica a quella prodotta dagli esseri umani, senza nessun problema di reazioni avverse. L’introduzione sul mercato di questo farmaco ha sicuramente costituito un notevole miglioramento delle aspettative di vita di tutti i diabetici. Venne realizzata per la prima volta nel 1977 dagli scienziati statunitensi Herbert Boyer e Stanley Cohen. La sua commercializzazione avvenne a partire dal 1982 con il nome Humulin. Fu il primo brevetto depositato per un farmaco ottenuto con le tecniche dell’ingegneria genetica e approvato dalla FDA. L’insulina umana è formata da due catene proteiche: catena A (21 amminoacidi) e B (30 amminoacidi) unite tra loro mediante due ponti disolfuro. Inizialmente viene prodotta come proinsulina, con la presenza di un’ulteriore catena C, ma questa non ha alcun ruolo nella funzione dell’ormone. L’insulina è attiva quando viene sottoposta ad enzimi proteasi che spezzano la catena di proinsulina, separando la catena A+B unite attraverso ponti disolfuro, perciò la catena C non partecipa all’azione finale dell’insulina.

Tecnologia del DNA Ricombinante

Esistono dei particolari enzimi di restrizione presenti all’interno di alcuni batteri che tagliano il singolo o il doppio filamento in specifici punti. Si è pensato di sfruttare gli enzimi di questi batteri per produrre geni di interesse. Il primo passo del clonaggio genico è quello di isolare il DNA che contiene il gene desiderato (nel nostro caso il gene desiderato è quello dell’insulina e la cellula da cui vogliamo estrarlo è quella umana). Si utilizzano gli enzimi di restrizione per tagliare il gene dell’insulina in punti univoci e il frammento presenterà delle estremità coesive che permettono di incorporarlo nel patrimonio genetico del batterio che lo ospiterà, attraverso un enzima detto DNA-ligasi.

Ottenuto questo nuovo plasmide ricombinante (plasmide originale ricombinato col gene di interesse), lo inseriamo nell’Escherichia coli, che lo ingloba e inizia a produrre n copie del plasmide. L’Escherichia coli non riesce a produrre la proinsulina perché non è in grado di fare il processo di scissione tra i complessi A+B e la catena C, produce solo o la catena A o la catena B. Allora si introduce la sequenza della catena A, la sequenza della catena B, e in maniera sintetica (post-produzione), sempre attraverso ponti disolfuro, si uniscono.

Produzione di Insulina Ricombinante

Il plasmide ricombinante viene posto a contatto con il batterio, che ingloba il plasmide ricombinante. Ognuno di questi organismi unicellulari viene messo in un fermentatore che consente una coltivazione su larga scala. I batteri proliferano e producono enormi quantità o della catena A o della catena B. Dopo un tempo t, il prodotto viene raccolto e processato per ottenere la struttura desiderata.

Lezione 4: Il Bioreattore CSTR

Reattore continuo completamente miscelato

La caratteristica principale è che presenta un funzionamento continuo, i reagenti vengono introdotti continuamente, a differenza del Batch. Abbiamo un serbatoio degli input, canali che consentono il flusso dei reagenti nel bioreattore, che devono essere separati visto che vengono introdotti in maniera continua. Presenta un agitatore meccanico e infine è presente un’uscita da cui viene raccolto il prodotto della reazione. Come già detto, la concentrazione in uscita è pari a quella in ingresso, si dice che lavoriamo in condizioni di stazionarietà. La densità è costante, ciò significa che la portata volumetrica in ingresso è uguale a quella in uscita.

Caratteristiche

• Un ingresso per ogni specie reagente
• Non ho accumulo (stato stazionario), lo deduco dal fatto che ogni volta che una specie si consuma viene subito ripristinata
• Continuo e perfettamente mescolato
• Ideale per reazioni in fase liquida come il Batch
• Temperatura, concentrazione sono uguali in ogni punto
• Ideale per reazioni che prevedono tempi lunghi (continuo)

Bilancio di Materia

E-U=A+T
E= quantità in entrata
U= quantità in uscita
A= quantità accumulata
T= quantità trasformata

In un reattore CSTR: A=0; E-U=T
(Stato stazionario: non abbiamo un accumulo)

Quantità in entrata: La quantità in entrata [moli/t] è data da F =v × C_A0 [moli/t]
v = portata volumetrica in ingresso al reattore [V/t]
C_A0 = concentrazione della specie A in entrata [moli/V]

Quantità in uscita: La densità è costante, quindi lo è anche la portata volumetrica. Questo dato è utile quando devo determinare la quantità in uscita. La quantità in uscita [moli/t] è data da F =v × C_A [moli/t] (uguale a quella di ingresso)
v = portata volumetrica in ingresso al reattore [V/t]
C_A = concentrazione della specie A in uscita [moli/V]

Quantità trasformata: La quantità trasformata [moli/t] è data da r_A × V [moli/t]
r_A = velocità di trasformazione della specie A [moli/V*t]
V = volume di fluido presente nel reattore [V]