Biochimica, risposte alle domande d'esame secondo semestre

SEQUENZE DI REAZIONE IN CUI SI PRODUCE NADH?

QUALI ENZIMI POTRESTE USARE PER UNA DETERMINAZIONE ENZIMATICA DI ETANOLO CON METODI SPETTROFOTOMETRICI?

COSA SI INTENDE PER DETERMINAZIONE ENZIMATICA "DEAD POINT"?

A sinistra vediamo il metodo (usato anche da noi in laboratorio) per vedere quanto glucosio c'è in un sistema, usando la prima l'esochinasi per convertire un qualsiasi zucchero in uno zucchero fosfato (in questo caso Glu6P) e poi un enzima specifico che ossida solo il glucosio (Glu6Pdeidrogenasi, ossida il carbonio in 1 del glucosio fosforilato in 6).

L'ossidante è la forma fosforilata del NAD, l'NADP. Usiamo l'NADPH (o il NADH) come strumento analitico, perché NADP e NADPH hanno due diversi spettri di assorbimento. La forma ossidata NAD non assorbe nel vicino UV (340nm), mentre la forma ridotta NADH ha un'estinzione molare piuttosto intensa. Il vantaggio di tipo pratico è che la lunghezza d'onda di 340nm è solo nel vicino ultravioletto.

permettendoci di usare vetreria di plastica, che assorbe la luce a lunghezza d'onda inferiori. Quindi dove si può si vanno ad utilizzare enzimi che usano una delle due forme del NAD. Se riducono vedremo un aumento dell'assorbimento della luce, se ossidano vedremo una diminuzione nella capacità della soluzione di assorbire la luce.

Guardiamo ora come fare un dosaggio dell'etanolo. In questo caso sfruttiamo l'alcol deidrogenasi, che usando il solito NAD ossida l'alcol ad acetaldeide. Il problema è che questa reazione è vicina all'equilibrio, quindi la conversione di etanolo ad acetaldeide non è completa e la lettura che noi facciamo misurando NADH potrebbe essere sbagliata. Come facciamo a rendere completa la trasformazione? Aggiungiamo qualcosa che sposti l'equilibrio, l'idrazina. L'idrazina reagisce con le aldeidi, quindi si porta via l'acetaldeide prodotta in questa reazione, spostando l'equilibrio.

verso la completa ossidazione dell'etanolo (altro esempio didead point, faccio andare l'enzima fino a quando tutto il suo substrato è consumato). A questo punto la quantità di NADH che si è formato è funzione della quantità di etanolo presente nel campione da analizzare. Il dosaggio si può fare anche senza spettrofotometro, usando PES e MTT che ci permettono di capire la quantità di etanolo presente in base all'intensità del colore che si ottiene. 12) UN TRATTAMENTO PORTA ALL'INATTIVAZIONE DEL 70% DELL'ENZIMA IN 5 MIN. STIMATE IL t1/2 DELLA REAZIONE DI INATTIVAZIONE. QUALE DI QUESTI ENZIMI È PIÙ TERMOSTABILE: A, B, C L'equazione è quella di un decadimento del 1° ordine. Nell'immagine i calcoli sono errati, perché sapendo che al tempo t l'attività è ridotta del 70%, significa che A t è il 30% cioè 0,3. Quindi avremmo: k' = -(ln

1. (0,3))/5= 0,24-1mint = ln(2)/k’= 0,693/0,24= 2,88 min1/2
2. Questi calcoli sono corretti, anche perché dai calcoli del prof. viene fuori che il tempo di dimezzamento (quando abbiamo ancora il 50% di attività) è maggiore del tempo in cui abbiamo solo il 30% di attività.
3. Qual è l’enzima più termostabile? A, B, C
4. ENZIMA A: Per avere k’ da t devo fare 1/2-1ln(2)/t =0,693/2=0,346 min1/2
5. Se avvengono 0,346 eventi al minuto, logicamente in un'ora ne avverranno 60 volte, quindi 0,346x60= 20,69
6. Usando gli stessi calcoli capiamo come ottenere gli altri numeri. Evidentemente l’enzima C è il più resistente, se calcoliamo il suo tempo di dimezzamento in giorni otteniamo: 1,8 giorni = 43,3217 ore.
7. PERCHE’ L’AGGIUNTA DI ENZIMI CHE IDROLIZZANO POLISACARIDI PORTA AD UN’ACCRESCIUTA SHELF-LIFE DEI PRODOTTI DA FORNO?
8. PERCHE’ L’IDROLISI DI POLISACCARIDI PUÒ MIGLIORARE LA RESA IN OLIO DA DRUPE?
9. Due

Sono i motivi che consentono agli enzimi con attività idrolitica nei confronti dei polisaccaridi di avere questa funzione anti-staling (antiraffermimento). Il primo è l'attività amilolitica classica. Questa attività si traduce in un rallentatore di affermimento perché il raffermimento è causato principalmente dal fenomeno noto come retrogradazione dell'amido. Più l'amido sarà idrolizzato e più sarà difficile che questo ricristallizzi con la retrogradazione. Molti degli enzimi coinvolti in questa azione anti-staling non sono amilolitici, ma agiscono su altri polisaccaridi presenti nei vegetali (glucani, pentosani, cellulosa, emicellulosa). Contribuiscono all'antistaling, perché se io taglio questi composti, miglioro la loro capacità di legare l'acqua, quindi questi composti, una volta tagliati, funzionano da sistema tampone nel rallentare la migrazione dell'acqua dalle molecole proteiche.

all'amido e viceversa. Quindi avremo tempi di cottura più lunghi, ma tempi di transito dell'acqua dall'amido alle proteine nel processo di raffermimento, molto più lunghi.

Il taglio di tutti questi polisaccaridi non amido ci porta dei vantaggi in qualsiasi processo in cui vogliamo estrarre qualcosa da una matrice vegetale (essenze di arancia, bergamotto, coloranti da barbabietole, olio). Nel caso dell'olio di oliva possiamo usare questi enzimi nel momento in cui facciamo una sospensione acquosa per cercare di estrarre altro olio dalla pasta già spremuta di olive. Il problema è che molte goccioline di grasso rimangono intrappolate in quella specie di rete che vediamo in figura formata da tutti quei tipi di polisaccaridi non amido. Se taglio i polimeri che creano la rete, ho la possibilità di liberare le goccioline di olio intrappolate senza usare solventi, senza usare niente di chimico. La resa in olio può aumentare del 10-15%.

Un modo assolutamente legale e sicuro, devo solamente essere sicuro che non siano presenti delle lipasi.

14) QUAL È LA FRAZIONE DI LIGANDO ASSOCIATA AD UNA PROTEINA, DATA UNA Kd PARI A 1Mm e una concentrazione di ligando e proteina entrambi pari a 2Mm?

15) QUALI TIPI DI LEGAMI CHIMICI SI POSSONO FORMARE TRA UNA PROTEINA E UN AC. GRASSO? I tipi di legami possibili sono sostanzialmente due. I legami di tipo covalente (ci interessano poco come alimentaristi) solitamente li troviamo quando si trovano ancorati alla membrana, ac. miristico e oleico. Le interazioni di carattere idrofobico sono i legami che interessano a noi alimentaristi. Legami tra regioni idrofobici delle proteine e coda idrocarburica degli ac. grassi. Come vediamo questo tipo di interazione non è esclusiva degli ac. grassi, ma come vediamo dall'immagine in basso a sinistra, anche farmaci, metalli e altre sostanze. L'interazione idrofobica con ac. grassi è presente anche in altre proteine di trasporto.

Ad esempio la BLG. Nel materiale alimentare, l'interazione prevalente è l'interazione di tipo idrofobico. In sistemi biologici troviamo anche legami covalenti che consentono il legame di proteine alla membrana.

16) IN CHE MODO LE TRASFORMAZIONI SUBITE DALLA MATERIA PRIMA POSSONO CONDIZIONARE LA FORMAZIONE DI PEPTIDI BIOATTIVI? PERCHÉ UNA PROTEINA ASSUME STRUTTURE DIVERSE SE DENATURATA AD UN'INTERFACCIA LIQUIDO-LIQUIDO PIUTTOSTO CHE SOLIDO-LIQUIDO? Esempio piscina con acqua o senza (liquido o solido). Nell'acqua penetriamo, nel solido no. Se ho una fase oleosa le porzioni idrofobiche della proteina penetrano nella gocciolina d'olio. Se ho una superficie idrofobica solida, queste porzioni non possono penetrare, rimanendo attaccate alla superficie. Dall'analisi degli spettri di fluorescenza vediamo che le modificazioni strutturali sono diverse. Queste differenze causano una differenza quando queste proteine sono esposte a una proteasi. In base a come la

La proteina è denaturata (solido o liquido) avremo dei prodotti di idrolisi differenti (quindi anche presenza o assenza di peptidi bioattivi). La BLG in acqua rimane in parte indigerita. Sulle diverse forme di proteina denaturata, la stessa proteasi agisce in modo diverso (guardiamo i tracciati dell'analisi dei prodotti di digestione). I tracciati sono diversi tra loro perché le strutture delle proteine sono diverse: ciascuna tipologia di trattamento porta una forma di proteina denaturata diversa e queste differenze si riflettono nei differenti prodotti (peptidi bioattivi o no). La proteina adesa ad un solido ha meno siti di taglio esposti, motivo per cui vediamo ancora un po' di BLG indigerita. Se invece la BLG è incorporata nella gocciolina d'olio è stata ben "srotolata" e quindi vedo che è stata frammentata in una serie di peptidi. Vediamo anche che non c'è più quella "punta" di BLG indigerita dopo.

65 min. La posizione della curva della fluorescenza, dipende dalla polarità dell'ambiente in cui si trova il triptofano: bassa polarità, bassa lunghezza d'onda, alta polarità, alta lunghezza d'onda (verso il rosso). L'intensità della fluorescenza (quanto è alta la curva) dipende dalla presenza o meno di gruppi quancianti. I frammenti generati da BLG adsorbita su NP sono 10 volte più immunoreattivi della BLG nativa (1 ug/ml di peptidi da BLG adsorbita su NP sono immunoreattivi quanto 10 ug/ml di BLG nativa).

17) LEGA PIÙ ACQUA UNA PROTEINA CON 20 GLU E 80 ASN OPPURE UNA CON 20 ASN E 80 GLU? L'asparagina non ha carica, il glutammato sì (carico negativamente). Da queste informazioni capiamo che la proteina che lega più acqua è quella con più carica, quella con 80 GLU.

18) QUALI CARATTERISTICHE COMPOSITIVE FANNO SÌ CHE LE GLIADINE SIANO SOLUBILI SOLO IN ALCOLI? Queste proteine sono colme di proline e AA idrofobici.

le probabilità che sia solubile in acqua sono basse. Ho bisogno di un solvente apolare che sia in grado di solubilizzare queste proteine tenute insieme da interazioni idrofobiche. Per solubilizzare queste proteine devo diminuire la spinta idrofobica che spinge sulla proteina. Posso usare degli alcoli (etanolo o isopropanolo) o distruggere la struttura dell'acqua usando i caotropi (urea, cloruro di guanidina o la combinazione di temperatura e detergenti). In queste condizioni io riesco a far venir meno la spinta entropica dell'acqua che appiccica tra di loro le molecole. 19) CHE COSA RENDE DIVERSE UNA FARINA DA PANE DA UNA FARINA DA BISCOTTI? QUALI FAMIGLIE DI PROTEINE SONO PRESENTI IN QUESTE DUE TIPOLOGIE DI FARINE?