Biochimica Parte 1

La biochimica: ripasso chimica organica

E' lo studio della chimica dei processi della vita. Descrive in termini molecolari le strutture, i meccanismi e i processi chimici delle cellule.

Protagonisti del corso

• Cellule (procariotiche ed eucariotiche)
• Macromolecole ossia molecole con dimensioni maggiori di 5000 Dalton (acidi nucleici, proteine, oligosaccaridi, lipidi)
• Precursori (nucleotidi, aminoacidi, monosaccaridi, acidi grassi)
• Metaboliti (piccole molecole di trasformazione dei precursori)

Ripasso

1. Ripassa il tetraedro del Carbonio

2. Rappresentazioni di un aminoacido: l'alanina

3. Tipologie di gruppo chimico:

• A. Differenze tra carbonile (aldeide e chetone) e carbossile
• B. Tra gruppo amminico e amidico
• C. Differenza tra estere e etere
• D. Tioestere (RC=OSR)
• E. Differenza tra sulfidrile (RSH) e disolfuro (RSSR)
• F. Anidride (due acidi carbossilici RC=OOC=OR), fosfoanidride e anidride mista (acido carbossilico e fosforico detta anche acil fosfato)

Acetil-coenzima A

Si notano nella sua formula di struttura un tioestere, 2 ammidi, ossidrile, una fosfoanidride, imidazolo, ammina e un fosforile. Quindi appunto quei gruppi chimici compongono le molecole più complesse.

Interazioni chimiche

Legami chimici (N.B. 1 KJ = 4,17 Kcal)

• Legami covalenti: il più comune è il legame singolo C-C di lunghezza 1.54 A (0.154 nm), energia 355 KJ/mole (85 Kcal/mole)
• Legami non covalenti: sono più deboli dei covalenti
  • a. Interazioni elettrostatiche: interazione basata sulle cariche nette che le molecole possiedono (energia 5.8 KJ/mole e da qui si nota la enorme differenza ed essa è molto più debole ossia ci vuole meno energia per rompere il legame di quanto non ne serve per un legame covalente)
  • b. Legami o ponti idrogeno: atomi sono diversamente elettronegativi (tendenza ad attrarre gli e- verso il nucleo). Esempio N: donatore di H; O: accettare di H. La loro energia varia da 4-20 KJ/mole
  • c. Interazioni di van der Waals: la nube di e- non è sempre presente uniformemente intorno all'atomo e questo fa sì che si crei nell'atomo una sorta di dipolo. Se nelle vicinanze arriva un atomo ugualmente polarizzato la porzione dell'atomo può attirare l'altro atomo e man mano che si avvicina questa parziale carica crea una forza di attrazione o repulsione. Ma c'è un particolare raggio in cui la forza è massima e se la superano allora prevarrà la repulsione, se è meno l'attrazione. Questo è il raggio di van der Waals. Questa interazione ha una energia tra 2-4 KJ/mole. Ma si possono formare diversi legami in una molecola e anche se uno ha poca energia la somma di tutti i legami è grande e contribuiscono alla stabilità tridimensionale della molecola.
  • d. Interazioni idrofobiche: permettono a molecole idrofobiche di avvicinarsi ad altre molecole aventi caratteristiche idrofobiche. Questo perché tutto quello che avviene in biochimica è in ambiente acquoso.

Acqua

È la componente principale delle cellule. Tutte le caratteristiche strutturali e funzionali delle cellule sono adattate alle proprietà fisiche e chimiche dell'acqua. Le molecole di acqua e i prodotti della sua ionizzazione (H⁺ e OH^-) influenzano molto la struttura, reattività e le proprietà di tutti i costituenti cellulari.

Angolo di legame di 104.5° e la sua peculiarità è che si comporta da dipolo (carica positiva sull'H e carica negativa sull'O). La prima molecola con la quale fa ponte H è proprio l'acqua e ogni molecola di acqua può fare 4 legami idrogeno creando una struttura cristallina rigida presente allo stato solido. A temperatura ambiente e quindi allo stato liquido (dato che il ponte H ha poca energia) il legame H e l'acqua sono labili ossia continuano a rompersi e riformarsi e qui abbiamo al massimo 3 legami H.

Nelle molecole organiche come zucchero, glucosio ecc. anche se non hanno cariche nette (sono polari) diventano solubili in acqua perché tipicamente i gruppi polari (OH) fanno ponte H con l'acqua e quindi sono gruppi idrofilici. Le molecole non polari in acqua tendono a interagire tra di loro così da ridurre le parti esposte all'acqua (interazione idrofobica). Anche i gas sono in ambiente acquoso e la loro presenza dipende dalla polarità. Ad esempio l'O₂ e la CO₂ nel metabolismo ed entrambi NON sono polari e quindi non è solubile. L'ammoniaca invece è polare e quindi solubile.

Ionizzazione dell'acqua

L'acqua tende a dissociarsi in un protone e in un ossidrile (H₂O → H⁺ + OH^-) in ambiente acquoso. La ionizzazione è controllata da una costante di equilibrio (Keq) ossia la concentrazione dei prodotti e substrati è uguale. Keq = [H⁺][OH^-] = 10^-14 M². Noi sappiamo che nell'acqua pura abbiamo 55.5 moli di H₂O che è uguale alla Keq chiamato anche Kw = 55.5 mol x Keq (1.8 x 10^-16 M) = 10^-14 M². Se aumenta la concentrazione di H⁺ deve diminuire quella di OH^-.

Si preferisce usare il pH = -log[H⁺] per esprimere l'energia di ionizzazione dell'acqua e monitorare la concentrazione degli H⁺. Se la concentrazione di H⁺ aumenta il pH diminuisce. Il contrario per calcolare il pOH. Nella cellula le variazioni vanno da 7.4 pH a 7.2 pH.

Nella cellula anche l'acido debole si dissocia: il più comune è l'acido acetico CH₃COOH → CH₃COO^- + H⁺. Qui la Keq si chiama Ka = Si stabilisce che il valore di pH al quale un acido è metà ionizzato e metà no è uguale al valore del pKa. L'ammoniaca ha pKa = 9.25 e quindi sarà più presente il valore di NH₄⁺.

Le proteine

Sono le specie di macromolecole più abbondanti nelle cellule e le più espressive della funzione cellulare e sono le macromolecole che operano più di tutte nella cellula. Insomma sono gli operatori pratici delle funzioni della cellula. Il tipo di proteina è stabilito sulla base delle informazioni genetiche: codice genetico.

Sono composte da precursori ossia gli aminoacidi. Infatti esse si considerano polimeri di aminoacidi legati in forma lineare (polimero lineare di aminoacidi).

Aminoacidi

Sono caratterizzati da un C (indicato come C alfa) a cui è legato un gruppo carbossilico, aminico, atomo di H e un gruppo variabile (R) o chiamato anche catena laterale. Tutti sono composti così tranne uno: glicina. Un C a cui sono legati 4 sostituenti diversi si chiama carbonio chirale. Esiste un modo di disporre i sostituenti in modo tale che non sia più sovrapponibile a un altro e per questo si chiama stereoisomero: due di essi sono diversi perché rappresentano 2 immagini speculari l'uno dell'altro. Se cambio la disposizione per esempio solo il gruppo aminico allora posso sovrapporlo all'altro facendo opportune rotazioni. Quindi se sono speculari uno all'altro allora essi sono diversi. Questi sono detti anche enantiomeri.

Per distinguerli sappiamo che i due enantiomeri sono in grado di ruotare differente il piano della luce polarizzata (L - Levogiro; D - destrogiro). Per capire se sono L o D si prende un aminoacido (es. L-alanina) si dispone il COO^- e il CH₃ in quel modo (uno più lontano da noi e uno più vicino a noi) e se il gruppo aminico è a sinistra allora sarà chiamato L (Levogiro); se invece è a destra allora sarà D (Destrogiro). Nelle proteine c'è solo una forma (o L o D).

Negli aminoacidi il COOH è un acido e NH₂ è una base e se vado a vedere i pKa dei due (rispettivamente pKa - NH₂ = circa 9.4; pKa - COOH = circa 2.2) capisco che gli acidi carbossilici cambiano il pH a seconda dell'ambiente in cui si trova. Nella cellula avremo sempre un COOH in forma ionizzata e idem per l'NH₂. Infatti gli aminoacidi si definiscono zwitterioni (ossia hanno una carica positiva e una negativa) a pH fisiologico. Ma ciò che distingue un aminoacido dall'altro è la catena laterale R.

Nomenclatura atomi di un aminoacido

Per identificare gli atomi usiamo le lettere greche. Notiamo che sul 2 abbiamo un C chirale avente come catena laterale tutta quella. Una volta identificato il C alfa poi si prosegue con il Carbonio beta ecc. Possiamo usare anche i numeri ma stavolta il numero 1 è il Carbonio carbossilico e il Carbonio alfa è il 2 ecc.

Gli aminoacidi precursori delle proteine sono solo 20 (numero dovuto perché durante la sintesi proteica il codice genetico usa solo questi). Notiamo che il pKa del COOH e dell'NH₂ cambia a seconda dell'aminoacido.

Si possono differenziare in:

• Non polari, alifatici
• Aromatici
• Polari
• Aventi carica elettrica positiva
• Aventi carica elettrica negativa

1. Aminoacidi non polari, alifatici gruppo R

La glicina non è chirale. La valina, la leucina e la isoleucina sono gli unici aventi catena laterale ramificata. La metionina ha uno zolfo nella sua catena laterale legato al carbonio gamma e delta. C'è anche la Prolina: la catena laterale ciclizza col gruppo aminico.

2. Aminoacidi con catena laterale aromatica, gruppo R

La tirosina è polare perché ha il gruppo ossidrile. La fenilalanina è idrofobica. Il triptofano è polare. Il Triptofano assorbe la luce a 280 nm. Ossia prendo una soluzione che contiene triptofano e faccio passare luce a lunghezza d'onda crescente, la luce viene assorbita formando uno spettro della luce a diverse lunghezze d'onda. Questo è importante perché si può rilevare in soluzione la presenza e quanto c'è un aminoacido in soluzione. Tutto questo racchiuso nella Spettrofotometria. È una lampada che emette luce ad ampio spettro di lunghezze d'onde e il monocromatore che ha il funzione di far entrare diverse lunghezze d'onda e far uscire solo una certa lunghezza d'onda stabiliti chiamata luce incidente e fatta passare nella provetta contenente un certo aminoacido. Parte della luce viene assorbita e parte no e quella non assorbita viene trasmessa oltre la provetta e raccolta da un rilevatore collegata ad essa. Da questo si ricava l'assorbanza (quantità di luce incidente assorbito dal composto in provetta) attraverso la Legge di Lambert-Beer. La loro equazione mette in relazione l'assorbanza con la concentrazione del soluto che assorbe la luce. l = lunghezza del cammino ottico ossia la lunghezza della soluzione attraversata dalla luce, c = concentrazione del soluto, epsilon = coefficiente di estinzione molare specifico per ogni composto che assorbe luce.

3. Aminoacidi la cui catena laterale è carica positivamente

L'Istidina non ha carica sulla catena laterale. Il pH dell'N è relativamente più basso rispetto agli altri ed è nel range del pH fisiologico e per questo bastano piccole variazioni di pH o dell'intorno tale da far variare il pH e si può protonare. Normalmente se non accadono variazioni rimane neutro.

4. Aminoacidi la cui catena laterale ha carica negativa

5. Aminoacidi la cui catena laterale contiene gruppi polari

Quindi alla fine abbiamo 3 aminoacidi con il gruppo OH sulla catena laterale: Tirosina, Serina, Treonina. Quindi alla fine abbiamo 2 aminoacidi con il gruppo S sulla catena laterale: Cisteina: si possono facilmente ossidare (descritto dopo) Metionina. L'ossidazione delle cisteine forma un ponte disolfuro. Questa permette di formare legami covalenti tra due cisteine. La Glutammina non ha la carica. Ossidazione delle Cisteine. Avviene quando sono o in soluzione o quando sono inserite nelle proteine.

Aminoacidi particolari

Esistono solo all'interno delle proteine tramite modificazioni di un aminoacido. La idrossiprolina e lisina sono presenti nella matrice extracellulare. La metillisina nel tessuto muscolare. Il carbossiglutammato è comune nelle proteine ad esempio nei fattori della coagulazione. La desmosina è una fusione di 4 molecole di lisina. Presente nella Elastina che è sempre nella matrice extracellulare. La selenocisteina è particolare perché si forma prima dell'inserimento nella catena polipeptidica. Importanti nelle proteine che impediscono danni di natura ossidativa. Quindi notare il Selenio (Se). Ricordare che tutti gli aminoacidi servono alla cellula non solo per formare le proteine (glicina e glutammato hanno funzioni da neurotrasmettitori). Infatti per esempio il GABA che deriva dal glutammato perde carbossilazione; l'Istamina, la Tiroxina per formare le catecolamine (derivano dalla fusione di 2 tirosine e modificate da iodio), la Dopamina (neurotrasmettitore eccitativo).

Caratteristiche chimiche degli aminoacidi

Lo stato di ionizzazione del gruppo aminico e del carbossilico dipende dal pH ed esiste un valore per cui l'aminoacido è ionizzato al 50% (al pH fisiologico abbiamo la forma zwitterionica ossia il gruppo carbossilico è ionizzato e il gruppo aminico è protonato ma la carica netta è 0). Il processo di ionizzazione e protonazione inizia a pH bassi e prosegue aumentando il pH. Sono fenomeni che avvengono di continuo. Il valore del pH chiamato punto isoelettrico è il pH nella quale le cariche elettriche hanno valore 0. Anche se è un valore vicinissimo c'è una piccola parte che è carica (positiva o negativa dipende se è più acido o basico). Esso cambia da aminoacido all'altro ma se gli aminoacidi hanno l'R ionizzabile il calcolo del punto isoelettrico è difficile da calcolare. Esempio il glutammato.

Gli aminoacidi si legano a formare peptidi

Le proteine sono formate da polimerizzazione di aminoacidi. Il peptide è una polimerizzazione in forma lineare e se è lungo è chiamato oligopeptide. Se aumentano oltre i 40 si chiama polipeptide e se sono ancora più lunghe si chiamano proteine. Gli aminoacidi si legano insieme per reazione tra il gruppo carbossilico in alfa di un aminoacido e il gruppo aminico in alfa di un altro aminoacido formando un legame peptidico (unico nel suo genere dato che sono legati a C in alfa). Due aminoacidi legati insieme formano un dipeptide il quale a sua volta avremo un gruppo carbossilico in alfa libero e allora si può legare formando un tripeptide ecc. Sono 5 aminoacidi e quelli in giallo sono legami peptidici. Quelli in rosso sono le catene R (partendo da sx: serina, glicina, tirosina, alanina, leucina). Dobbiamo sempre avere un gruppo carbossilico libero da una parte e un gruppo aminico libero dall'altra. Queste due estremità si chiamano estremità amminoterminale e carbossiterminale. Per convenzione gli aminoacidi si legano dalla direzione amminoterminale. Quindi in una proteina per esempio ma anche nei polipeptidi l'estremità amminoterminale è il n°1. Se l'aminoacido è inserito in una catena polipeptidica (o proteine) si chiama residuo aminoacidico. Notiamo che centralmente abbiamo una ripetizione di un C alfa, un C occupato nel legame peptidico, un NH e un altro C alfa ecc. Questo si chiama scheletro del polipeptide e rimane uguale per tutte le proteine. Ciò che cambia sono le catene laterali degli aminoacidi che differenziano i polipeptidi ma anche la carica o la polarità. Anche se una proteina ha 1000 aminoacidi con diverse cariche, alcuni protonati altri ionizzati esiste un pH in cui la somma di tutte le cariche presenti è 0. Il numero di residui influenza il peso molecolare della proteina. Alcune proteine sono composte da una sola catena polipeptidica oppure da diverse. Queste catene possono essere legati insieme tramite legami covalenti da residui di cisteina ossidandosi formando ponti disolfuro. L'esempio più classico è l'insulina, un ormone che regola il metabolismo energetico formato da 2 catene polipeptidiche tenute insieme appunto da ponti disolfuro.

Purificazione di una proteina

Ci sono 2 informazioni importanti: quali sono gli aminoacidi che lo compongono e come si ripiegano. Ma per riconoscere ciò io devo avere una proteina, da sola e purificata.

• 1. Per purificare si parte da un campione biologico di partenza con lisi delle cellule attraverso omogenizzazione (metodo meccanico), detergenti che sciolgono la membrana (la solubilizzano), ultrasuoni (metodo meccanico), lisi ipotonica la quale sfrutta il fatto che le cellule devono sempre essere tenute in ambiente isotonico (cosa fatta in fisiologia nell'esempio dei globuli rossi).
• 2. Da qui si ottiene l'estratto grezzo che è il punto di partenza per isolare e purificare la proteina che ci interessa. In questo processo si scartano quelle che non ci interessano finché ne rimane solo una.
• 3. Dopodiché facciamo un frazionamento subcellulare. Ma se abbiamo fatto la lisi ipotonica abbiamo tutti i componenti cellulari ma che possono essere eliminati attraverso centrifugazione la quale accelera il processo di sedimentazione. Questi precipitano prima poiché sono più pesanti (come nuclei e mitocondri, pezzi grossi di membrana plasmatica). Aumentano la forza di gravità della centrifugazione possiamo ricavare sul fondo i pezzi più grossi della cellula così eliminando cose che non servono.
• 4. Dopo abbiamo la dialisi che consente di eliminare sali, soluti e piccole molecole organiche. Si pone il campione all'interno di un sacchetto di plastica trasparente apposito tarato e forato. Da questi fori passano SOLO piccole molecole. Questi sacchetti sono di diverse dimensioni fino al limite di esclusione (tot dalton). Abbiamo detto questo sacchetto contenente proteine ecc in soluzione acquosa e attraverso i pori possono passare le molecole nel sacchetto in soluzione fino a che non abbiamo un equilibrio. L'acqua entra ma anche i solubili escono. Dopo tiro fuori il sacchetto e rime...