Biochimica cellulare

Biochimica cellulare prima parte

Sintesi, organizzazione, folding e degradazione delle proteine

Sintesi proteica

Le proteine sono macromolecole polimeriche costituite da amminoacidi. Le ritroviamo in capelli, unghie, cervello, sangue, muscoli sotto forma di recettori, proteine di membrana, messaggeri cellulari, anticorpi… La traduzione prevede la cooperazione di macromolecole e complessi sopramolecolari: ribosomi, mRNA, tRNA, aminoacil-tRNA sintetasi, energia (ATP e GTP) e fattori proteici.

Il codice genetico è costituito da 64 triplette denominate codoni. Poiché i nucleotidi sono solo 4 e gli amminoacidi 20, non è possibile una corrispondenza diretta “uno a uno” tra nucleotidi e amminoacidi. Per specificare un singolo amminoacido è necessario quindi un gruppo di più basi (codone). È in tal modo possibile avere 4³=64. Di queste, 61 sono codificanti per amminoacidi ed altre 3 codificano per codoni di terminazione, di stop. Il codice genetico è degenerato, solo Met e Trp hanno un solo codone mentre, ad esempio, Arg, Ser e Leu sono specificati da 6 diversi codoni (differiscono soltanto a livello del terzo nucleotide). Le triplette UAG, UAA e UGA sono codoni di stop mentre AUG è il codone di inizio della catena polipeptidica.

Sono possibili 3 cornici di lettura. Se mi sposto di un singolo nucleotide (frameshift), cambia completamente il frame (la cornice di lettura). Il codone non riconosce direttamente l’amminoacido corrispondente; a farlo è un RNA transfer o tRNA (costituito da circa 80 nucleotidi). Ha l’aspetto di un quadrifoglio e una conformazione a L con tratti a doppia elica, tratti a singola elica e tre loops, su uno dei quali c’è l’anticodone di basi complementari al codone dell’mRNA.

I nucleotidi speciali presenti nel tRNA determinano l’acquisizione di una struttura tridimensionale complessa ma funzionale ad L capovolta. La regione al 3’ ha sempre una sequenza consenso CCA ed è il ribosio di quest’adenina che si lega all’amminoacido giusto. Quanto è grande un tRNA? Solitamente oscilla fra gli 83-90 amminoacidi. Nonostante siano piccolini, sono altamente specifici per il riconoscimento del loro amminoacido.

Il tRNA è considerato un adattatore che riconosce sia lo specifico codone che l’amminoacido corrispondente. Quindi, lega quest’ultimo e lo accompagna nella catena in via di sintesi durante la sintesi proteica. L’anticodone è complementare al codone ed è situato esattamente nella regione opposta al sito di riconoscimento dell’amminoacido. Fondamentalmente, il tRNA si carica preventivamente l’amminoacido e poi si avvicina al codone.

Nella cellula avvengono numerose reazioni di attivazione degli amminoacidi e di caricamento dei tRNA, che verranno richiamati in funzione dei codoni presenti sull’mRNA durante la sintesi proteica. Il codice genetico è degenerato (ridondante), ovvero possono esistere codoni codificanti per lo stesso amminoacido. Esistono più tRNA nella cellula: quanti? Alcuni tRNA possono riconoscere vari codoni, in quanto contengono nell’anticodone una base inconsueta, l’ipoxantina, in grado di formare legami idrogeno con U, C e A.

Tuttavia, esistono tRNA per ogni codone e di riflesso per ogni anticodone presente sul tRNA (sono circa 64). Nonostante sia termodinamicamente favorita, la reazione di caricamento del tRNA necessita dell’enzima aminoacil-tRNA sintetasi. Per intervenire, è fondamentale che l’amminoacido sia stato preventivamente attivato. L’attivazione costa energia, pertanto la sintesi proteica è molto dispendiosa. Difatti, molto spesso la cellula risponde agli stress proprio riducendo la sintesi proteica (se la cellula si rende conto di non essere in grado di superare lo stress, va in apoptosi).

L’attivazione dell’amminoacido porta alla formazione di un amminoacido reattivo denominato amminoacil-AMP (adenilato) che successivamente reagisce con il tRNA.

amminoacido + tRNA + ATP ➝ amminoacil-tRNA + AMP + PPi

Esistono due classi di aminoacil-tRNA sintetasi: quelli di classe 1 sono più compatti, monomerici e catalizzano il caricamento dell’amminoacido sull’OH nel 2’ del ribosio dell’adenina del tRNA; quelli di classe 2 catalizzano il caricamento nel 3’. Come fa il tRNA a legare l’amminoacido giusto? Come fa a controllare che effettivamente sia quello giusto?

Il legame del giusto amminoacido è guidato da una conformazione ospitale, ovvero si crea un perfetto adattamento dell’amminoacido giusto che deve essere caricato. Basta solo questo? No. Perché? È stato osservato che il tRNA su cui viene caricato l’amminoacido è soggetto ad un controllo che verifica se l’amminoacido caricato sia quello corretto. Per fare ciò, l’aminoacil-tRNA sintetasi, oltre ad avere un sito attivo con cui lega il substrato e lo ha trasformato, deve avere anche un’altra regione che consente di fare questo check. Tale regione si trova ad una distanza molto ridotta dal sito attivo, così l’enzima riesce a fare catalisi e proof-reading in maniera quasi immediata; in questo modo la frequenza di errore è ridotta.

Sebbene in molti testi vengano descritti come organelli, i ribosomi non possono essere classificati come tali perché i primi sono compartimenti cellulari rivestiti da membrana. È più corretto descrivere i ribosomi come delle strutture intracellulari di natura ribonucleoproteica. Esistono differenze fra ribosomi procariotici ed eucariotici: fondamentalmente quelli eucarioti sono più complessi. Sono composti da rRNA e proteine; l’rRNA viene prodotto nel nucleo, mentre le proteine nel citosol, quindi l’assemblaggio dei ribosomi è piuttosto complesso. Evidenze hanno dimostrato che vengono assemblati nel nucleo, quindi le proteine vengono sintetizzate nel citosol e poi reclutate all’interno del nucleo. Parte del ribosoma è cataliticamente attiva, cioè gli rRNA dei ribosomi hanno attività catalitica (ribozimi). Quindi i ribosomi non solo sono delle strutture che facilitano l’assemblaggio della catena polipeptidica ma intervengono attivamente.

Fra mRNA procariotici ed eucariotici ci sono enormi differenze: ad esempio, quando il primo viene trascritto è anche quasi contemporaneamente tradotto e non contiene sequenze non tradotte, come gli introni. Il secondo, ha tutta una serie di caratteristiche distintive, la maggior parte delle quali sono necessarie per aumentare la stabilità dell’RNA prodotto (la trascrizione avviene nel nucleo mentre la sintesi proteica nel citosol, quindi l’mRNA deve essere protetto dalle ribonucleasi). Inoltre, l’mRNA eucariotico subisce lo splicing classico o alternativo, modifiche (capping al 5’ e aggiunta di una coda di poli A al 3’), editing… quindi non è semplicemente il prodotto della trascrizione nucleare di un pezzettino di gene ma il risultato di tutta una serie di processi che lo condurranno ad essere il definitivo oggetto che andrà incontro alla sintesi proteica.

Il processo di sintesi proteica è un concerto di avvenimenti volti ad un unico scopo: tradurre l’informazione del genoma in amminoacidi che poi contribuiranno a formare una proteina, la quale a sua volta può svolgere svariate funzioni.

Il capping consiste nell’aggiunta del residuo di 7-metilguanosina all’estremità 5’, cui consente il giusto allineamento dell’RNA messaggero al ribosoma e soprattutto lo protegge dall’attacco dalle ribonucleasi. L’aggiunta della catena di poli-adenine ha invece come funzione principale la stabilità del trascritto maturo (aumentare l’emivita dell’mRNA va di pari passo con l’efficienza di traduzione: se si ha una degradazione prematura inficio il processo di traduzione).

Lo splicing è un processo che prevede la rimozione di sequenze non codificanti (le quali hanno delle sequenze di riconoscimento affinché possa aver luogo l’escissione delle stesse) per produrre l’mRNA maturo. Lo splicing è operato dallo spliceosoma, un grosso complesso costituito da snRNA (small nuclear RNA) e proteine.

Lo splicing alternativo è un escamotage degli eucarioti che attuano nella regolazione tessuto-specifica dell’espressione genica. Consiste nell’escissione opzionale degli esoni, producendo diversi tipi di trascritti codificanti per diverse proteine. L’editing è un intervento a posteriori (post-trascrizionale) sulla sequenza dell’mRNA cui induce piccole modifiche.

Sintesi proteica

Una volta prodotto, qual è il codone utilizzabile come inizio della traduzione? AUG, codificante per una metionina. Tuttavia, in un trascritto possono esserci vari AUG: quale AUG segnala l’inizio della trascrizione? I batteri hanno risolto con delle sequenze che si appaiano perfettamente con gli rRNA 23 S denominate Shine-Dalgarno posizionate pochi nucleotidi a monte di questo AUG d’inizio permettendo il perfetto appaiamento fra l’mRNA e l’rRNA della subunità minore del ribosoma. Gli eucarioti non hanno la sequenza Shine-Dalgarno; banalmente, l’AUG di inizio è quello più vicino all’estremità 5’ (dove c’è il cap). Tuttavia, il modello di Kozak prevede che comunque l’AUG d’inizio degli eucarioti sia parte di una sequenza che assolve a funzioni simili a quelle Shine-Dalgarno.

I ribosomi hanno 3 siti di legame: A (amminoacidico), P (peptidico) ed E (sito di uscita, exit). L’A è la tasca in cui “atterra” il tRNA caricato dell’amminoacido da aggiungere, quello P è quella in cui avverrà invece la creazione del legame peptidico, E è il sito in cui il tRNA scarico viene liberato.

Inizio

L’assemblaggio dei componenti per la traduzione prevede la presenza di una serie di proteine, chiamate fattori di inizio, e della subunità minore del ribosoma, cui a sua volta attraverso il suo rRNA lega l’mRNA. I fattori impediscono l’associazione precoce con la subunità maggiore fin quando non arriva il primo tRNA caricato del giusto amminoacido. Altri fattori invece consentiranno l’associazione con la subunità maggiore.

Allungamento

L’allungamento è la fase in cui arrivano i vari tRNA carichi successivi al primo. Il secondo amminoacil-tRNA entra nel sito A legato al fattore di allungamento EF-Tu, che a sua volta è legato al GTP. Il legame dell’amminoacil-tRNA al sito A è accompagnato dall’idrolisi del GTP seguita dal rilascio del complesso di EF-Tu-GDP dal ribosoma. Il GDP viene liberato quando EF-Tu-GDP si lega all’EF-Ts. La formazione del legame peptidico è catalizzata dall’attività peptidil-transferasica dell’RNA 23 S (ribozima).

Terminazione

Tutto ciò si verifica finché non si incontrano i codoni di terminazione, a livello dei quali si ha l’indebolimento di tutte le associazioni che tengono insieme le due subunità ribosomiali. Si hanno eventi di dissociazione cui fanno sì che la catena polipeptidica venga rilasciata. Questa raggiungerà la conformazione nativa e svolgerà il suo mestiere. Le proteine che incentivano la dissociazione delle subunità vengono chiamate fattori di rilascio.

Sintesi negli eucarioti

Negli eucarioti la situazione è sovrapponibile a quella dei procarioti, soltanto che sono coinvolti più fattori, i ribosomi sono più complessi (80S) e l’mRNA è più articolato (si può verificare anche l’assunzione di una struttura secondaria che a sua volta può influenzare la traduzione: se presenta delle anse, tutti i fattori che dovranno atterrare e modulare il processo di traduzione avranno difficoltà rispetto a quello che nei batteri è piuttosto lineare). eIF4E lega il CAP, PABP lega la coda di poli(A) a formare un mRNA che assume una forma circolare che facilita il legame ai ribosomi.

Modello di Kozak

Il modello di Kozak tenta di spiegare quale potrebbe essere il codone di inizio della traduzione negli eucarioti e prevede una sorta di scansione a partire dal 5’ dell’mRNA. Appena si incontra l’AUG codificante la metionina, lì potrà atterrare il tRNA caricato con la metionina. Il problema sta nel fatto che gli mRNA possono avere delle strutture secondarie. Se l’AUG lo ritroviamo ad esempio in un’ansa avrò come risultato una traduzione più scarsa. Se l’AUG è presente nell’ansa ma ad una “distanza di sicurezza” allora avrò una buona traduzione perché in tal modo l’mRNA può essere associato in modo agevole alla subunità minore del ribosoma. La migliore situazione è quella in cui l’AUG non è in un’ansa ma in una sequenza lineare. Se si trova a valle di un’ansa, l’mRNA non verrà tradotto perché è come se si avesse un ostacolo all’arrivo dei fattori e quindi all’associazione con la subunità minore.

Inizio della traduzione negli eucarioti

Anche negli eucarioti quindi, quando l’AUG d’inizio è stato efficacemente individuato, arriveranno i vari fattori. Alcuni, hanno proprio il compito di impedire che arrivi precocemente la subunità maggiore. eIF-4 è composto da 3 proteine ed ha il ruolo di assicurare una perfetta ed agevolata associazione con la subunità ribosomiale, ma ce ne sono molti altri.

Struttura, folding e chaperones

Le proteine sono delle macromolecole fondamentali per qualsiasi funzione che si verifica all’interno dell’organismo, costituite da amminoacidi. Ciascuna proteina ha una propria struttura tridimensionale che la rende capace di svolgere specifiche funzioni biologiche.

Ciò che è alla base della struttura, funzionalità e carica elettrica di una proteina e che differenzia un amminoacido da un altro è la catena laterale indicata con R. In base a questo gruppo, gli amminoacidi possono essere distinti in più categorie: idrofobici con catena alifatica, idrofobici con catena aromatica, polari non carichi, polari carichi positivamente e polari carichi negativamente. Gli amminoacidi con catene laterali cariche, idrofiliche, sono generalmente esposti sulla superficie delle proteine. I residui idrofobici, non polari, si trovano in genere all’interno delle proteine, protetti dal contatto con l’acqua. Quelli con carica opposta invece si attraggono. Tutti gli amminoacidi si sciolgono in acqua perché hanno sia il gruppo amminico che quello carbossilico, tuttavia, quelli polari interagiscono nettamente meglio con l’acqua.

A pH bassi l’amminoacido a prescindere da chiunque sia sarà carico positivamente, all’aumentare del pH l’amminoacido cede le cariche positive; arriverà un certo punto del pH in cui la sua carica sarà 0, forma zwitteriana; se il pH si alza ulteriormente, l’amminoacido si carica negativamente. Lo stato di ionizzazione dell’amminoacido si riflette sullo stato di ionizzazione della proteina, cui influenza la funzione della stessa. Ogni compartimento cellulare ha un proprio pH e in base a questo troveremo determinate proteine.

Gli amminoacidi essenziali sono quelli che una determinata specie non è in grado di sintetizzare (o li sintetizza in quantità non sufficienti) pertanto devono essere assunti con la dieta. Per l’uomo sono essenziali la valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, treonina e lisina. Questi amminoacidi sono reagenti limitanti: quando uno di essi si consuma del tutto, la sintesi di qualsiasi proteina viene interrotta anche se sono presenti abbondanti quantità di tutti gli altri amminoacidi (il reagente in eccesso per eccellenza negli eucarioti è l’ossigeno; l’acqua è in molti casi un prodotto). Gli alimenti ricchi di amminoacidi essenziali sono quelli di origine animale come carne, pesce, uova, latte, formaggi mentre quelli carenti sono quelli di origine vegetale.

Gli amminoacidi non essenziali sono invece quelli che possono essere sintetizzati da una determinata specie. Un’altra classificazione prevede la distinzione degli amminoacidi in chetogenici, glucogenici e cheto/glucogenici.

• Glucogenici: tutti gli AA dal cui catabolismo è ottenibile acido piruvico o un intermedio del ciclo di Krebs e che quindi possono essere utilizzati per riformare glucosio attraverso la gluconeogenesi (Asp, Glu, Asn, Gln, His, Pro, Arg, Gly, Ala, Ser, Cys, Met, Val).
• Chetogenici: gli AA dal cui catabolismo è ottenibile acetilCoA o acetoacetilCoA, che quindi non possono essere utilizzati per riformare glucosio (leucina e lisina) ma possono essere formati per formare altri intermedi.
• Sia chetogenici che glucogenici: dal loro catabolismo è ottenibile acido piruvico o un intermedio del ciclo di Krebs, oltre che acetil CoA o acetoacetilCoA (Phe, Tyr, Trp, Ile, Thr).

Ancora, esistono anche gli amminoacidi solforati, caratterizzati dalla presenza dello zolfo (metionina e cisteina). In alcuni enzimi la cisteina ha un ruolo catalitico, ma soprattutto ha un ruolo nella stabilità delle proteine mediante la formazione dei ponti disolfurici.