Biochimica - I semestre

Struttura tridimensionale delle proteine

La disposizione spaziale degli atomi di una proteina, o di una porzione di una proteina, è detta conformazione. Le conformazioni possibili di una proteina, o di un segmento di una proteina, corrispondono a tutte le strutture che la proteina può assumere senza rottura di legami covalenti. Quando si trovano in uno dei loro stati conformazionali funzionali, le proteine sono dette native. Le conformazioni che la proteina assume in condizioni diverse sono in genere quelle termodinamicamente più stabili, cioè quelle che possiedono il più basso valore di energia libera di Gibbs (G).

L’ambiente all’interno della maggioranza delle cellule è altamente riducente, a causa dell’elevata concentrazione di agenti riducenti come il glutatione; di conseguenza, in queste condizioni la maggior parte dei gruppi sulfidrilici rimane nello stato ridotto. All’esterno della cellula, l’ambiente è spesso più ossidante ed è quindi più facile che avvenga la formazione dei legami disolfuro. Negli eucarioti, i ponti disolfuro si trovano principalmente nelle proteine secrete nell’ambiente extracellulare.

Le catene laterali idrofobiche degli amminoacidi tendono a raggrupparsi all’interno delle proteine, lontano dall’acqua, mentre quelle idrofiliche sono esposte all’esterno.

Struttura primaria

Sequenza amminoacidica.

Struttura secondaria

Si riferisce a un segmento polipeptidico della proteina e descrive l’organizzazione spaziale della catena principale. Include la formazione di legami a idrogeno tra diversi amminoacidi e la disposizione spaziale di residui amminoacidici adiacenti in un segmento di un polipeptide.

• α-elica: lo scheletro carbonioso polipeptidico si avvolge strettamente intorno a un asse immaginario che attraversa longitudinalmente la parte centrale della spirale, mentre i gruppi R dei residui amminoacidici sporgono al di fuori dello scheletro elicoidale. L’unità che si ripete è un singolo giro dell’elica, che si estende per circa 5.4 Å lungo l’asse maggiore. Ogni giro dell’elica contiene 3.6 residui e ciascun giro dell’elica è collegato ai giri adiacenti da 3/4 legami a idrogeno.
• Foglietto β: i singoli segmenti che formano un foglietto sono generalmente vicini l’uno all’altro nella catena polipeptidica. I gruppi R di amminoacidi diversi sporgono dalla struttura a zig-zag in direzioni opposte, creando un’alternanza sopra-sotto. Le catene polipeptidiche adiacenti di un foglietto β possono essere parallele o antiparallele (possono cioè avere lo stesso orientamento o un orientamento opposto del legame carboammidico NH-CO).

Struttura terziaria

La disposizione nello spazio di tutti gli atomi di una proteina tiene conto delle relazioni a lungo raggio nella sequenza amminoacidica.

Struttura quaternaria

Alcune proteine contengono due o più catene polipeptidiche distinte (o subunità) che possono essere identiche o diverse. La disposizione di queste subunità in complessi tridimensionali prende il nome di struttura IV.

Considerando questi livelli strutturali, molte proteine possono essere classificate come fibrose o globulari. Le proteine fibrose hanno catene polipeptidiche disposte in lunghi fasci o foglietti, con prevalenza di una struttura secondaria e struttura terziaria relativamente semplice, e sono proteine che determinano la resistenza, forma e protezione. Le proteine globulari hanno catene polipeptidiche ripiegate che assumono forme globulari o sferiche, contengono più tipi di struttura secondaria e strutture supersecondarie (motivi-ripiegamenti-domini), e comprendono enzimi e proteine regolatrici.

• Proteine fibrose: α-cheratina, collagene e fibroina della seta hanno proprietà tali da conferire resistenza e/o elasticità alla struttura di cui fanno parte. L’unità strutturale di base è un semplice elemento di struttura secondaria ripetuto. Tutte le proteine fibrose sono insolubili in acqua, una caratteristica che dipende dalla presenza di elevate concentrazioni di amminoacidi idrofobici sia all’interno che sulla superficie della proteina.

α-cheratina: Struttura adatta a resistere alla tensione. Si trova solo nei mammiferi, dove rappresenta la quasi totalità del peso secco dei capelli, della lana, delle penne, delle unghie, degli artigli, delle corna, degli zoccoli e degli strati esterni della pelle. Le α-cheratine fanno parte di una grande famiglia di proteine chiamate proteine dei filamenti intermedi (IF). Nel citoscheletro delle cellule animali sono presenti altre proteine IF e tutte hanno funzioni strutturali e caratteristiche comuni.

2 α-eliche destrorse superavvolte l’una sull’altra con andamento del superavvolgimento sinistrorso. Le superfici dove le due eliche si toccano nel superavvolgimento sono rivestite da amminoacidi idrofobici, i loro gruppi R si inseriscono l’uno vicino all’altro con un’alternanza perfettamente regolare, permettendo un avvicinamento massimo delle catene all’interno del superavvolgimento. Sono ricche di residui idrofobici.

α-elica superavvolgimento di due catene con la stessa direzionalità, coiled coil, protofilamenti, protofibrille. Formazione di legami crociati: ponti di solfuro tra le cisteine.

Collagene: Presente nel tessuto connettivo come il tendine, cartilagine, matrice organica delle ossa e cornea. Specie proteica più abbondante nella maggior parte degli animali: fino a 1/3 della massa proteica. L’elica del collagene è una struttura secondaria unica sinistrorsa e ha 3 residui amminoacidici per giro. Superavvolgimento (destrorso) di 3 catene α le une sulle altre (sinistrorse).

Nei vertebrati esistono molti tipi di collagene nei quali la Gly rappresenta il 35% dei residui totali, l’Ala l’11% e la Pro insieme alla 4-Hyp (4-idrossiprolina, un amminoacido non comune). La sequenza amminoacidica è costituita da un’unità tripeptidica ripetuta Gly-X-Y, dove X è spesso prolina e Y è spesso idrossi-prolina.

I residui di Gly sono gli unici che si possono adattare ai punti in cui le catene α sono molto vicine fra loro, i residui di Pro e 4-Hyp consentono lo stretto avvolgimento della catena polipeptidica. La resistenza alla tensione viene amplificata dallo stretto avvolgimento delle 3 catene α. Le fibre di collagene sono organizzazioni sopramolecolari costituite da triple molecole di collagene (tropocollagene) che si associano tra loro in vari modi per generare diversi gradi di resistenza alla tensione.

Le catene α all’interno di una molecola di collagene e le molecole di collagene all’interno di una fibra sono unite tra loro da legami covalenti crociati di tipo insolito che coinvolgono residui di Lys, di HyLys (5-idrossilisina) o di His presenti in alcune posizioni X e Y del collagene. Questi legami creano residui non comuni come la deidroidrossilisinonorleucina (accumulo di legami crociati nell’anziano).

Idrossilazione post-traduzionale di prolina e lisina hanno come cofattore l’acido ascorbico (vitamina C); prolil- e lisil- idrossilasi sono diossigenasi che trasferiscono entrambi gli atomi di O su due diverse molecole. Avviene la glicosilazione da parte della glicosilasi (aggiunta di glucosio e galattosio) di alcuni residui, conferendo rigidità alla molecola.

Nel lume del RER vengono sintetizzate due tipi di catena (pre-pro-collagene) α-1 e α-2, contenenti residui C- e N-terminali. Le due catene di pre-pro-collagene vengono rilasciate nel lume del RER, dove viene eliminata la sequenza segnale, formando pro-catene α1 e α2 precursori del collagene. Nel lume del RER, le procatene vanno incontro a modificazioni post-traduzionali quali l’idrossilazione delle lisine e delle proline e la glicosilazione delle idrossilisine.

Dopo essere state idrossilate e glicosilate, le procatene α formano pro-collagene, un precursore del collagene la cui regione centrale a tripla elica è affiancata da tratti ammino- e carbossiterminali chiamati pro-peptidi. La formazione del pro-collagene inizia con la formazione di legami disolfuro a ponte tra i peptidi carbossiterminali delle procatene α, portando le tre catene α in una disposizione favorevole alla formazione dell’elica.

La molecola di pro-collagene viene trasferita nel Golgi, dove viene completata la glicosilazione e immessa in vescicole che verranno trasportate all’esterno della cellula, fondendosi con la membrana plasmatica e liberando le molecole di pro-collagene nello spazio extracellulare. Dopo la liberazione all’esterno delle cellule, le molecole di pro-collagene subiscono tagli da parte di N- e C- procollagene peptidasi, che rimuovono i propeptidi terminali, liberando molecole di tropocollagene a tripla elica.

Le molecole di tropocollagene si associano spontaneamente, formando fibrille che assumono una disposizione parallela e sfalsata, nella quale le molecole di collagene si sovrappongono a quelle vicine per circa ¾ della loro lunghezza. Le fibrille di collagene con la loro disposizione ordinata sono il substrato della lisil ossidasi, un enzima extracellulare che catalizza la deaminazione ossidativa di alcuni residui di lisina e idrossilisina del collagene, generando aldeidi reattive (allisina e idrossiallisina) che danno luogo a reazioni di condensazione, formando legami covalenti tra catene.

Le fibrille infine possono disporsi in fasci ondulati o paralleli per formare fibre e le fibre possono formare fasci di fibre.

• Proteine globulari: formate da catene polipeptidiche ripiegate in forme simmetriche nello spazio. Diversi segmenti della catena polipeptidica si avvolgono gli uni sugli altri, generando una struttura più compatta rispetto a quella delle proteine fibrose. L’avvolgimento delle proteine è responsabile delle diversità strutturali, permettendo una gamma di funzioni vasta.

Le proteine globulari comprendono gli enzimi, le proteine di trasporto, le proteine regolatrici, le immunoglobuline e tante altre proteine che hanno le più svariate funzioni. Presenza di più strutture secondarie e supersecondarie (motivi-ripiegamenti-domini); catene laterali distribuite in base alla polarità, stratificazione e compattazione.

Membrane

Le membrane non sono soltanto barriere passive: esse contengono una serie di proteine specializzate che promuovono o catalizzano un gran numero di processi cellulari. Sulla superficie delle cellule, i trasportatori spostano molecole organiche specifiche e ioni inorganici attraverso la membrana; i recettori sulla membrana plasmatica captano segnali extracellulari e attivano modificazioni molecolari all’interno della cellula, mentre le molecole di adesione tengono unite cellule vicine.

All’interno delle cellule, le membrane costituiscono il supporto per un gran numero di processi cellulari, come la sintesi dei lipidi e di certe proteine e la trasduzione energetica nei mitocondri. Poiché le membrane sono composte soltanto da due strati di molecole e quindi sono molto sottili, possiamo considerarle essenzialmente bidimensionali. Le collisioni intermolecolari sono più probabili in questo spazio bidimensionale che non in quello tridimensionale, perciò l’efficienza di alcune vie metaboliche catalizzate da enzimi viene considerevolmente incrementata proprio dall’organizzazione strutturale delle membrane.

Composizione e architettura

Le quantità relative di lipidi e proteine variano a seconda del tipo di membrana e riflettono le differenze delle loro funzioni biologiche.

Ogni specie, tessuto e tipo di cellula hanno un corredo caratteristico di lipidi di membrana. Le membrane plasmatiche sono ricche di colesterolo e non contengono quantità apprezzabili di cardiolipina; le membrane mitocondriali sono molto povere di colesterolo e di sfingolipidi, mentre contengono fosfatidilglicerolo e cardiolipina (sintetizzati all’interno dei mitocondri).

La fosfatidilserina, il fosfatidilinositolo e il fosfatidilglicerolo sono relativamente poco rappresentati nella maggior parte delle membrane, pur svolgendo funzioni essenziali: per esempio, il fosfatidilinositolo e i suoi derivati sono importanti nei processi di trasduzione del segnale innescati da ormoni. Gli sfingolipidi, la fosfatidilcolina e la fosfatidiletanolammina sono presenti nella maggior parte delle membrane, ma in proporzioni diverse. I glicolipidi, i principali componenti delle membrane dei cloroplasti delle piante, sono praticamente assenti nelle cellule degli animali.

Le membrane sono impermeabili alla maggior parte dei soluti carichi o polari, ma sono permeabili ai composti non polari, con uno spessore che varia da 5 a 8 nm (da 50 a 80 Å).

Modello a mosaico fluido

I fosfolipidi formano un doppio strato in cui le regioni non polari dei lipidi sono disposte all’interno della struttura e le teste polari guardano invece verso l’esterno, interagendo con la fase acquosa su entrambi i lati.

Le proteine sono immerse in questo foglietto lipidico a doppio strato a intervalli irregolari e sono mantenute nella posizione corretta da interazioni idrofobiche tra i lipidi di membrana e i domini idrofobici delle proteine. Alcune proteine sporgono solo da un lato o dall’altro della membrana e altre hanno domini esposti su entrambi i lati del foglietto lipidico. L’orientamento delle proteine nel doppio strato è asimmetrico, i domini di una proteina esposti su un lato della membrana sono diversi da quelli esposti sull’altro lato, creando un’asimmetria funzionale.

Le catene di acidi grassi all’interno della membrana formano una regione fluida e idrofobica. Le proteine integrali galleggiano nei lipidi, mantenute nella posizione corretta da interazioni delle catene laterali non polari dei loro amminoacidi con il nucleo idrofobico della membrana. La fluidità della membrana deriva dal fatto che le interazioni tra i suoi componenti sono non covalenti, e ogni singola molecola lipidica e proteica è libera di spostarsi lateralmente nel piano della membrana.

I glicerofosfolipidi, gli sfingolipidi e gli steroli sono praticamente insolubili in acqua. Quando dispersi in acqua formano spontaneamente aggregati lipidici microscopici in una fase separata dall’ambiente acquoso circostante, raggruppando le parti idrofobiche e mantenendole a contatto le une con le altre, mentre le parti idrofiliche polari si dispongono sulla superficie per interagire con il solvente acquoso.

Aggregati lipidici

• Micelle: strutture sferiche che contengono da una decina a qualche centinaio di molecole, disposte con le regioni idrofobiche raggruppate all’interno della sfera e le teste idrofiliche esposte sulla superficie a contatto con l’acqua.
• Doppio strato: due monostrati (foglietti) formano un foglio bidimensionale. La formazione è favorita nel caso dei glicerofosfolipidi e sfingolipidi; le teste idrofiliche sono a contatto con l’acqua su entrambe le superfici del doppio strato, mentre le code idrofobiche interagiscono tra loro. Tuttavia, avendo margini esposti all’acqua, questa struttura risulta instabile e forma un terzo tipo di aggregato lipidico.
• Vescicola o liposoma: il doppio strato si ripiega su se stesso formando una sfera, acquisendo la massima stabilità in ambiente acquoso. Possono inglobare acqua, formando un compartimento interno acquoso separato dall’ambiente circostante.

I lipidi delle membrane plasmatiche sono distribuiti sulle due facce del doppio strato in modo asimmetrico, anche se, a differenza delle proteine di membrana, l’asimmetria non è assoluta. La distribuzione di uno specifico fosfolipide viene determinata mediante trattamento della cellula intatta con la fosfolipasi C, che non può raggiungere i lipidi del monostrato (foglietto) interno, ma rimuove le teste polari dei lipidi del monostrato esterno. Ogni testa polare viene rimossa secondo una percentuale che è indice della quantità di ogni lipide nel monostrato esterno.

Il flusso dei componenti di membrana che passano dal reticolo endoplasmatico, attraverso vescicole di trasporto all’apparato di Golgi, alla membrana plasmatica è accompagnato da cambiamenti nella composizione e nella disposizione dei lipidi all’interno del doppio strato. La fosfatidilcolina è il principale fosfolipide presente nel monostrato interno del lume della membrana del Golgi, mentre nelle vescicole di trasporto la fosfatidilcolina è ampiamente sostituita da sfingolipidi e colesterolo che, quando le vescicole di trasporto si fondono con la membrana plasmatica, costituiscono la maggior parte dei lipidi nel monostrato esterno della membrana plasmatica.

Per molti tipi cellulari, l’esposizione sulla superficie esterna della fosfatidilserina rappresenta un segnale che porta la cellula alla distruzione mediante morte programmata. Il movimento delle molecole di fosfolipidi tra un foglietto e l’altro del doppio strato della membrana è catalizzato e regolato da proteine specifiche. Le ancore GPI, glicolipidi che possono attaccarsi all’estremità C-terminale di una proteina, sono composte da un gruppo di fosfatidilinositolo legato attraverso un segmento di carboidrati all’estremità C-terminale di una proteina matura; i due acidi grassi all’interno del gruppo idrofobico ancora la proteina alla membrana plasmatica.

Lipide anfipatico costituito da una componente idrofoba, il fosfatidilinositolo prende contatto con la membrana plasmatica, e una componente idrofila, costituita da un oligosaccaride, fa da ponte tra il lipide stesso e l'estremità carbossi-terminale della proteina da ancorare.