Biochimica

Enzimologia

L'enzimologia è una branca della biochimica che ha per oggetto di studio gli enzimi. Un enzima è una proteina con attività catalitica. La catalisi (attività catalitica) è il meccanismo chimico che prevede l'accelerazione di una reazione chimica, ovvero la trasformazione attraverso la rottura e la formazione di legami chimici di molecole dette reagenti in composti nuovi detti prodotti. Una reazione chimica si scrive come un'equazione che ha nella parte sinistra i reagenti e nella parte destra i prodotti.

A + B → C + D dove A interagisce con B per dare C e D

Catalizzatore biologico

L'enzima non è né un reagente né un prodotto ma è un catalizzatore biologico, per cui né si consuma né si produce e non interviene nel cambiare la possibilità che la reazione possa avvenire in modo completo o parziale, quindi non cambia la termodinamica della reazione e il suo equilibrio chimico, ma cambia il meccanismo con cui la reazione avviene e accelera la velocità di reazione, ovvero la velocità in cui si raggiunge l'equilibrio.

"Gli enzimi sono i principali giocatori del metabolismo che costituisce l'ingranaggio molecolare attraverso cui la vita è possibile."

Reazioni lente

La maggior parte delle reazioni che avviene nel corpo animale sono reazioni lente, per cui i legami chimici che si devono rompere affinché la reazione avvenga sono legami chimici cineticamente stabili, che non si rompono alle temperature fisiologiche a cui operano gli organismi. Ciò significa che questi legami rendono impossibile i processi chimici se non in presenza di processi catalitici. La catalisi, abbiamo detto, è operata dagli enzimi, motivo per cui essi sono così importanti nella biologia cellulare. Senza un enzima, qualunque reazione chimica si possa immaginare all'interno di una cellula non si realizzerebbe.

All'interno delle cellule avvengono costantemente reazioni chimiche e il corredo enzimatico di una cellula permette che siano svolte al momento giusto e nel "posto" giusto affinché la cellula funzioni correttamente.

NB - cellule diverse → corredi enzimatici diversi → specificità diverse → attività diverse.

Velocità di reazione

La velocità di reazione è la variazione della concentrazione dei reagenti o dei prodotti nel tempo. Senza l'enzima questa velocità è bassissima, quindi quello che fa l'enzima è di permettere che la reazione proceda a velocità ragionevole (biologiche/fisiologiche) e in tempi che possono variare da frazione di secondi a pochi microsecondi (in loro assenza alcune reazioni potrebbero non avvenire mai o impiegare secoli per potersi realizzare).

Equilibrio chimico

Per equilibrio chimico si intende il punto finale di una reazione chimica, in cui le specie reagenti si sono trasformate nei prodotti e viceversa, quindi i due processi concomitanti e opposti cioè la trasformazione dei reagenti in prodotti (velocità diretta) e la trasformazione dei prodotti in reagenti (velocità inversa). Quando le velocità diretta e inversa si equivalgono si raggiunge il cosiddetto equilibrio chimico e la composizione del sistema chimico non si altera più, processo che dal punto di vista termodinamico vale per tutte le reazioni chimiche.

Dal punto di vista energetico questa non è una condizione ottimale per la cellula, perché in queste condizioni essa non è più in grado di cambiare la composizione del suo ambiente cellulare, quindi di modificare i reagenti in prodotti e viceversa, questo perché quando la reazione è all'equilibrio non è più in grado di essere controllata.

Quindi una reazione può avvenire anche in condizioni fisiologiche grazie alla presenza dello specifico enzima; però se la cellula lasciasse operare l'enzima senza in qualche modo intervenire ad un certo punto, l'enzima farebbe raggiungere molto velocemente l'equilibrio alla reazione in questione.

NB - condizioni fisiologiche: pH neutro, p = 1atm, T = 25/27°C

Reazioni complete

Ci sono reazioni complete che prevedono che tutti i reagenti si trasformino in prodotti, dette tali perché i reagenti sono molto meno stabili dei prodotti dal punto di vista termodinamico e quindi quando la reazione procede fino all'equilibrio ci sono pochissimi reagenti e moltissimi prodotti.

Reazioni non complete

Ci sono altre reazioni dette reazioni non complete in cui soltanto una frazione dei reagenti si trasforma in prodotti (ovviamente la quantità dipende dalla reazione e in particolare dalla stabilità relativa tra reagenti e prodotti). Ogni reazione ha il suo punto di equilibrio, quindi bisogna conoscere le caratteristiche termodinamiche di queste reazioni per capire se una reazione è fortemente spostata verso i prodotti, verso i reagenti, oppure in un punto in mezzo in cui le due specie reattive si bilanciano quasi completamente.

Catalizzatore

Un catalizzatore è una sostanza in grado di abbassare l'energia di attivazione della reazione. Affinché una reazione possa avvenire, le molecole che reagiscono devono avvicinarsi e scontrarsi in modo tale da compenetrare le rispettive nuvole elettroniche, determinando un aumento dell'energia del sistema. L'energia necessaria affinché il sistema raggiunga una soglia critica perché possa trasformarsi è detta energia di attivazione. Quest'ultima è il motivo per cui le reazioni che si svolgono dentro il nostro corpo avvengono a velocità molto lente (energie di attivazione molto elevate).

L'energia di attivazione corrisponde alla quota che esiste tra l'energia dei reagenti e la sommità di questa curva. Il picco di questa curva corrisponde allo stato di transizione, cioè uno stato in cui le molecole si stanno trasformando, i loro legami chimici si stanno rompendo e il sistema è alla massima energia potenziale. Se non si raggiunge questo stato particolare, che non è definibile e non è isolabile, la reazione non avviene.

Un aspetto che fa vedere la differenza tra un catalizzatore biologico e un catalizzatore inorganico (platino, iodio) è il potere catalitico, cioè il rapporto tra la velocità della reazione catalizzata e quella della velocità non catalizzata, che può variare da diversi miliardi di volte a 10¹⁷.

Gli enzimi sono in grado di accelerare le reazioni di fattori enormi in condizioni assolutamente blande, fisiologiche senza dare prodotti secondari, a differenza delle reazioni messe in atto dai chimici che devono variare il pH, p, T o [C]. Quindi gli enzimi si differenziano dai catalizzatori chimici di uso comune per velocità (negli enzimi è superiore), condizioni, specificità e controllo della reazione (molto elevato negli enzimi, ma solo una minima parte di essi è regolata).

Essendo gli enzimi dei catalizzatori, la loro concentrazione affinché possa avvenire una reazione non deve essere elevata anzi, quindi normalmente non si dà un valore di concentrazione dell'enzima ma si misura la sua capacità di trasformare una reazione chimica. Ecco perché quando si dosa un enzima lo si fa in base alla sua attività enzimatica, cioè la capacità dell'enzima di intervenire su una reazione chimica.

Catal (kat)

L'unità di misura dell'attività enzimatica nel S.I. è il catal (kat), corrispondente alla quantità di enzima in grado di convertire 1 mole di reagenti in 1 secondo nelle condizioni ottimali di lavoro dell'enzima (condizioni standard). Questo nel sistema internazionale che usa come unità di misura "ufficiali" la mole e il secondo, ma in contesti più pratici è stata stabilita l'unità internazionale (U/UI), corrispondente alla quantità di enzima che converte 1 micromole di reagenti in 1 minuto in condizioni di reazione standard.

Fattore di conversione: 1U = 1,67 x 10^-8 kat.

Attività specifica: rapporto tra il numero di U/kat e il volume che la contiene (mL) o la quantità totale di proteina (mg).

Specificità e riconoscimento stereospecifico

Ogni reazione è abbinata ad un singolo enzima, normalmente attrezzato per riconoscere uno o pochi substrati e per farli reagire rispetto a tutte le possibili molecole che incontra nella sua vita. L'enzima è congegnato dalla natura in modo tale da avere una superficie che riconosca il suo substrato, non solo in base ai gruppi chimici ma anche alla struttura tridimensionale.

Per cui si parla di stereospecificità, cioè la capacità dell'enzima di riconoscere un particolare enantiometro tra i possibili stereoisomeri che una certa struttura molecolare può fornire (alcuni enzimi sono più permissivi di altri). Le molecole che vengono riconosciute, interagiscono e si legano all'enzima per reagire (reagenti) si chiamano substrati.

Il substrato viene riconosciuto all'interno di una tasca di un sito specifico di riconoscimento che viene chiamato sito di legame, formata dalla struttura terziaria che è funzionale per i compiti dell'enzima.

Esempio – il compito di questa specifica esochinasi (glucochinasi) è far reagire il glucosio con una molecola di ATP. Nell'immagine si può osservare che nel sito di legame dei substrati ci sono due molecole: glucosio (in basso) e ADP (in alto). Queste due molecole sono due reagenti legati, riconosciuti e posizionati dall'enzima nel modo corretto per poter reagire, questo è il motivo per cui l'enzima è in grado di accelerare notevolmente la velocità di reazione, cioè perché posiziona i reagenti nella corretta orientazione affinché possano interagire (ricorda che le molecole devono avvicinarsi per poter reagire). In questo caso l'esochinasi è una molecola in grado di riconoscere uno specifico zucchero e un nucleotide trifosfato: il glucosio esiste nella forma D e L come coppia di enantiomeri, i quali dal punto di vista chimico sono identici, motivo per cui un qualsiasi catalizzatore usato dai chimici non potrebbe mai distinguere un L-glucosio da un D-glucosio, cosa che può fare un enzima. Infatti questa esochinasi lega solo il D-glucosio e non L glucosio o i suoi epimeri D-galattosio e D-mannosio.

Ci sono enzimi che non hanno una stereospecificità assoluta come la glucochinasi sopra citata, ma ci sono altri enzimi che lavorano su un certo tipo di legami.

Esempio – endoproteasi – le endoproteasi sono enzimi che riconoscono e idrolizzano i legami peptidici interni alle proteine. Il sito di legame non serve solo ad accomodare il composto e a prepararlo per la reazione, ma anche a riconoscere la particolare molecola che deve reagire. In questo caso siccome i legami peptidici sono uguali, quello che cambia è l'amminoacido su cui va tagliato il legame. Tra di esse ci sono le proteasi a serina:

• Chimotripsina – possiede una tasca di legame idrofobica, per cui l'amminoacido su cui va tagliato il legame deve essere un amminoacido idrofobico. Nello specifico la chimotripsina ha una struttura tale che soltanto gli amminoacidi aromatici possono avvicinarsi al sito catalitico in questo modo (es. fenilalanina, tirosina, triptofano), gli altri aminoacidi non avendo questa struttura non sono in grado di avvicinarsi all'enzima nel modo corretto, quindi non vengono legati.
• Tripsina – il sito di legame della tripsina contiene alla base (in fondo) un aspartato, che permette solo ad aminoacidi che sono carichi positivamente di potersi legare (la carica negativa interagisce in modo opportuno con una carica positiva attraverso legame ionico). Quindi la tripsina riconosce solo amminoacidi basici attraverso un ponte salino (es. lisina, arginina (il più basico), istidina).
• Elastasi – possiede una tasca di legame idrofobica piuttosto ingombrata, cioè occupata da catene laterali che impediscono all'amminoacido di avvicinarsi e legarsi in questo sito, per cui gli unici amminoacidi che possono associarsi a questo sito di legame hanno catena laterale piuttosto piccola (es. glicina e alanina, molto abbondanti nel collagene e nel connettivo).

Sito catalitico

Il sito catalitico è quella regione dell'enzima in cui si trovano catene laterali di certi amminoacidi, opportunamente modificate e avvicinate a particolari gruppi chimici, che possono contribuire al meccanismo con cui l'enzima accelera la reazione chimica. Queste molecole, più o meno cariche e più o meno polarizzate, sono in grado di indebolire i legami chimici del substrato e di interagire con esso in maniera reversibile e in maniera covalente, formando degli addotti che non si vedranno alla fine della reazione ma che servono per trasformarla in un meccanismo più rapido.

Esempio – il sito catalitico delle serina proteasi è costituito da una triade catalitica: serina, istidina e aspartato legati da legami idrogeno, e posti in modo da formare una sorta di relè chimico che serve a indebolire il legame tra l'ossigeno e l'idrogeno della serina caricando negativamente l'ossigeno della serina e trasformandolo in alcolato (normalmente la serina non perderebbe l'idrogeno, ma la presenza dell'istidina e dell'aspartato fanno in modo che si formi una parte reattiva che reagisca con il legame che deve essere rotto).

NB - zinco fondamentale per l'attività enzimatica anche se non è un amminoacido. Quindi sito di legame e sito catalitico non sono la stessa cosa.

Alcuni enzimi possono essere regolati attraverso l'interazione con altre molecole (le modalità di regolazione le vedremo meglio nella biochimica dei sistemi). Gli enzimi detti regolatori o segnapassolo sono enzimi posti in punti specifici della cellula che possono essere regolati semplicemente con un'interazione specifica con altre molecole che servono ad attivare o spegnerne l'attività.

Cofattori semplici

Gli enzimi, come le altre proteine, sono classificati in seconiugati costituiti esclusivamente da amminoacidi (rari) e seprevedono interazioni con altre molecole che non siano amminoacidi (la maggior parte). Nel loro complesso gli elementi non amminoacidici (ioni metallici o sostanze organiche) che interagiscono con la porzione proteica di un enzima coniugato per incrementare la potenzialità e la versatilità chimica dell'enzima stesso vengono detti cofattori. Senza i cofattori gli enzimi non potrebbero operare in molte reazioni chimiche.

Ad esempio le catene laterali, a parte il gruppo tiolico della cisteina, non sono molto utili nelle reazioni redox, mentre le catene laterali degli amminoacidi carichi sono utili durante reazioni in cui ci sono delle molecole che devono interagire con ponti salini e con dei passaggi di protoni (es. reazioni acido-base, reazioni di sostituzione nucleofila) ma non sono molto efficaci per quanto riguarda le reazioni redox. I cofattori devono essere introdotti con la dieta quotidianamente, in assenza di essi gli enzimi non funzionano correttamente.

Ioni inorganici

Gli ioni metallici sono i più comuni cofattori inorganici. Gli enzimi la cui forma attiva comprende uno o più metalli saldamente legati alla matrice proteica sono detti metallo enzimi (un terzo degli enzimi conosciuti). Gli enzimi attivati da metalli (Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺) richiedono solo un legame debole con questi.

• Zinco - nell'anidrasi carbonica lo ione zinco è complessato con le catene laterali dell'enzima, nello specifico con le catene laterali dell'istidine, poste correttamente nello spazio per catturare lo zinco. In questo contesto lo zinco serve per far idratare l'anidride carbonica e formare l'acido carbonico. Lo zinco fa parte del sistema di difesa contro i radicali liberi, cioè le specie reattive dell'ossigeno. La superossido dismutasi è un metallo enzima che ha bisogno sia dello zinco che del rame per poter operare sugli anioni superossido (una delle molecole reattive dell'ossigeno che si producono durante la respirazione mitocondriale). La carbossipeptidasi è una esoproteasi che riconosce il residuo C-terminale di una proteina e rimuove un aminoacido dall'estremità C-terminale. Se manca lo zinco essa non funziona e la digestione delle proteine viene compromessa. Lo zinco serve a formare domini strutturali in proteine con azione di fattori di trascrizione, detti dita di zinco, fondamentali per il controllo dell'espressione dei geni.
• Rame - il rame è un elemento importante per il trasporto degli elettroni, quindi nelle reazioni redox. Lo troviamo coinvolto come componente essenziale di uno dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, il complesso VI, ultimo complesso in cui gli elettroni vanno alla fine a convergere verso l'ossigeno. La superossido dismutasi è un metallo enzima che ha bisogno sia dello zinco che del rame per poter detossificare le cellule dai ROS. La lisil ossidasi è un metallo enzima che ha bisogno del rame per ossidare/idrossilare la catena proteica del collagene, e quindi renderla opportunamente preparata per formare le fibre di collagene necessarie per il corretto assemblamento del tessuto connettivo.
• Ferro (nelle sue forme ossidate) - il ferro è un elemento tossico e l'organismo ha sviluppato dei meccanismi complessi di assorbimento, trasporto, deposito ed utilizzo del ferro stesso. A differenza dello zinco e del rame, il ferro può oscillare tra due forme diverse a seconda della reazione redox, quindi gli elettroni si possono legare e spostare da una forma all'altra. Per queste ragioni il ferro è molto versatile. Deposito all'interno delle cellule e trasporto reversibile dell'ossigeno (Hb, Mb). Quest'ultime sono proteine che contengono un gruppo prostetico, il gruppo eme, contenente un