Biochimica I

H O

2

A – B + X: ----> A – X + B ----> A + X: + B

Da ricordare che un nucleofilo è una molecola con grande disponibilità di

doppietti elettronici, che attacca una molecola elettrofila, cioè povera di

elettroni. La formazione del legame covalente transitorio altera l’andamento

della reazione, ma ne risulta una catalisi solo se il nuovo percorso della

reazione ha un’energia di attivazione inferiore a quella della reazione non

catalizzata. Entrambe le tappe del processo devono essere più veloci della

reazione non catalizzata. Un certo numero di catene laterali amminoacidiche

e i gruppi funzionali di alcuni cofattori enzimatici possono fungere da nucleofili

nella formazione di legami covalenti con i substrati. Questi complessi

covalenti vanno sempre incontro a ulteriori trasformazioni, che rigenerano

l’enzima libero. Il legame covalente che si forma tra l’enzima e il substrato

può attivare un substrato inducendo un’altra reazione con un meccanismo

specifico per il particolare gruppo o coenzima.

La catalisi covalente viene eseguita da enzimi come le serinoproteasi

(chimotripsina, trispina ed elastasi), le transaminasi (aminotransferasi) e le

aldolasi.

Catalisi elettrostatica = il legame dell’enzima con il substrato tende ad

escludere l’acqua dal sito attivo dell’enzima. La costante dielettrica (ε) locale

del sito attivo ricorda quindi quella di un solvente organico, dove le interazioni

elettrostatiche sono molto più forti di quelle di un ambiente acquoso. Quindi,

la catalisi elettrostatica risulta essere la distribuzione delle cariche intorno al

sito attivo di un enzima che sono organizzate in modo tale da stabilizzare lo

stato di transizione della reazione catalizzata. Inoltre, in alcuni enzimi, la

distribuzione delle cariche serve a guidare i substrati polari verso il sito di

legame e così la velocità di questi enzimi sembra più grande degli stessi limiti

imposti loro dalla diffusione.

Catalisi per prossimità = fenomeno più interessante per la fisica che per la

biochimica. I gruppi reattivi del sito attivo si attivano solo quando i reagenti

entrano in contatto tra loro con una reazione spaziale corretta. Gli enzimi

inducono l’aumento di velocità delle reazioni perché fanno sì che i reattanti si

trovino nel giusto orientamento per reagire.

La maggior parte degli enzimi combina diverse strategie catalitiche, in modo

da aumentare la velocità delle reazioni. Un valido esempio è l’uso della

catalisi covalente, della catalisi acido-base generale, e della stabilizzazione

dello stato di transizione nella reazione catalizzata dalla chimotripsina.

Meccanismo di azione della chimotripsina

La chimotripsina (per gli studi è stata utilizzata quella pancreatica bovina)

appartiene alla famiglia delle serinoproteasi, che hanno un meccanismo di

catalisi comune. Gli enzimi digestivi come tripsina e chimotripsina vengono

secreti sotto forma di proenzimi inattivi e vengono attivati solo nel sito dove è

necessaria la loro azione (altrimenti si avrebbe un’autodigestione del

pancreas -> pancreatite).

Essendo una proteasi, la chimotripsina catalizza la rottura idrolitica di legami

peptidici. Questa proteasi è specifica per i legami peptidici adiacenti a residui

amminoacidici aromatici (Trp, Phe, Tyr). La reazione catalizzata da questo

enzima illustra il principio di stabilizzazione dello stato di transizione ed è un

esempio classico di catalisi acido-base e di catalisi covalente.

La chimotripsina, essendo una serinoproteasi, possiede una serina reattiva

(Ser 195) nel sito attivo. Insieme ad Asp 102 e His 157, forma la triade

catalitica, caratteristica di tutte le serinoproteasi (evoluzione convergente

con la subtilisina, enzima batterico che utilizza un meccanismo simile alle tre

serinoproteasi). -

La chimotripsina rompe un legame peptidico in cui il COO appartiene ad un

amminoacido aromatico (che viene accolto in una tasca idrofobica

dell’enzima). La serina reattiva della chimotripsina contiene un gruppo

ossidrile (OH), nucleofilo. Il legame dell’ossigeno con l’idrogeno viene stirato

da His, che tende a strappare l’ossigeno a pH ≈ 7 (il gruppo OH della Ser è

quindi reso ancora più nucleofilo). L’ossigeno di OH attacca il carbonile e si

forma lo stato di transizione, molecola caratterizzata da un carbonio

tetraedrico (C al centro con legati 4 atomi elettronegativi -> molecola molto

instabile).

Con la rottura del legame peptidico (la velocità del processo di idrolisi viene

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aumentata di ca. 10 volte dalla chimotripsina), si ha la fase di acilazione: si

forma un legame estere tra il carbonio carbonilico del peptide e l’enzima. In

questo modo si viene a creare un intermedio covalente transitorio acil-enzima

(infatti, la chimotripsina non catalizza l’attacco diretto di una molecola d’acqua

sul legame peptidico, ma forma invece un intermedio covalente transitorio

acil-enzima). Successivamente, NH dell’acil-enzima strappa un idrogeno a

2

His e si libera il primo prodotto di reazione, NH (porzione amminica del

2

legame peptidico).

His tenta poi di strappare un idrogeno a H O. A questo punto, H O attacca il

2 2

carbonile dell’acil-enzima e fa sì che il carbonio diventi di nuovo tetraedrico: si

ha quindi la fase di deacilazione, in cui il legame estere viene idrolizzato e

viene rigenerato l’enzima libero non acilato.

H O poi rompe il legame della Ser con l’ossigeno e livera il secondo prodotto

2

della reazione, COOH (porzione carbossilica del legame peptidico).

Il ruolo di Asp in questo meccanismo catalitico è soprattutto quello di

stabilizzare la serina (la quale possiede un ossigeno, quindi un gruppo

nucleofilo).

La catalisi avviene con un meccanismo ping-pong: entra il primo substrato,

esce il primo prodotto; entra il secondo substrato, esce il secondo prodotto.

meccanismo d’azione della chimotripsina

Per quanto riguarda le altre serinoproteasi, mentre la chimotripsina riconosce

- -

il gruppo COO degli amminoacidi aromatici, la tripsina riconosce COO degli

amminoacidi basici, mentre l’elastasi presenta la tasca ostruita da piccoli

amminoacidi.

COFATTORI

Sono solitamente grosse molecole organiche o metalli, oppure coenzimi

derivati da vitamine idrosolubili. Ad esempio:

biocitina, derivata dalla biotina. È un cofattore della piruvato

- carbossilasi (trasforma il piruvato in ossalacetato). La biocitina è un

trasportatore di CO : partecipa alla carbossilazione inserendo CO

2 2

inorganica in composti organici;

5’-deossiadenosilcobalamina, derivata dalla vitamina B . È un

- 12

cofattore della metilmalonil mutasi (trasforma malonil-coA in succinil-

coA);

flavin adenin dinucleotide (FAD), derivato dalla riboflavina (B ). È un

- 2

cofattore delle monoaminossidasi;

acido lipoico;

- nicotinamide adenin dinucleotide (NAD), derivato dall’acido

- nicotinico (quindi dalla vitamina PP – pellagra preventing – o niacina). È

un cofattore della lattato deidrogenasi (LDH);

piridossalfosfato, derivato dalla piridossina (B ). È un cofattore della

- 6

glicogenofosforilasi;

tetraidrofolato, derivato dal folato (B );

- 9

tiamin pirofosfato, derivato dalla tiamina (B ). È un cofattore della

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piruvato deidrogenasi;

coenzima A, derivato dall’acido pantotenico (B ). È un cofattore

- 5

dell’acetil-coA-carbossilasi (trasforma l’acido acetico in malonil-coA).

Gli elementi inorganici che agiscono da cofattori sono:

2+

Cu = cofattore di citocromo ossidasi;

- 2+ 3+

Fe o Fe = cofattore di catalasi, perossidasi;

- +

K = cofattore di piruvato cinasi;

- 2+

Mg = cofattore di esochinasi, glucosio-6-fosfatasi;

- 2+

Mn = cofattore di arginasi;

- Mo = cofattore di dinitrogenasi;

- 2+

Ni = cofattore di ureasi;

- Se = cofattore di glutatione perossidasi;

- 2+

Zn = cofattore di anidrasi carbonica, alcol deidrogenasi.

-

Circa il 30% degli enzimi sono metalloenzimi. I cofattori (metalli e coenzimi)

incrementano le possibilità catalitiche degli enzimi. Certi enzimi necessitano

per il loro funzionamento sia di un coenzima sia di ioni metallici.

CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI

L’enzima è costituito da una porzione proteica, l’apoenzima o apoproteina, e

da un gruppo prostetico, il cofattore (metallo o coenzima). Il complesso

apoenzima + cofattore è detto oloenzima. Il precursore inattivo

dell’apoenzima è detto zimogeno.

A causa del numero sempre maggiore di enzimi individuati, è stato adottato

per convenzione internazionale un sistema di nomenclatura e di

classificazione degli enzimi. Questo sistema divide gli enzimi in 6 classi

principali, ognuna suddivisa in sottoclassi in base al tipo di reazione chimica

catalizzata. Le 6 classi sono:

ossidoreduttasi = il gruppo prostetico è in grado di trasferire elettroni

- (reazioni redox). Ad esempio, la lattato deidrogenasi (LDH) catalizza

una reazione reversibile di trasformazione del lattato in piruvato:

Un’altra reazione catalizzata da una ossidoreduttasi fa parte del ciclo di

Krebs:

transferasi = trasportano gruppi nelle reazioni di trasferimento. Ne

- esistono di 2 tipi:

aminotransferasi o transaminasi

• cinasi o chinasi o kinasi.

•

Le aminotransferasi catalizzano la reazione di trasferimento del gruppo

amminico α di un amminoacido ad un α-chetoacido (ad esempio,

aspartato -> ossalacetato o glutammato -> α-chetoglutarato). Nella

stessa reazione aspartato -> ossalacetato, l’α-chetoglutarato accoglie

NH perso da Asp e riforma glutammato. È il sistema enzimatico

2

presente nel processo di biosintesi dell’urea (sistema di eliminazione di

azoto amminico con l’urina).

Le cinasi catalizzano la reazione di trasferimento del gruppo fosfato

43-

(PO ) dall’ATP. Sono quindi delle fosfotransferasi. Ad esempio, la

-

creatina è una molecola che possiede un gruppo COO e un carbonio

circondato da 3 atomi di azoto (gruppo guanidinico). Sulla creatina puà

essere trasferito reversibilmente un gruppo fosfato, grazie all’azione di

una cinasi, la creatinchinasi (C ), a formare creatinfosfato. Il

K

creatinfosfato svolge nel muscolo la stessa azione dell’ATP: è una

riserva energetica e primo carburante della contrazione muscolare. La

creatinchinasi compare nel sangue quando c’è stato un danno

muscolare o cardiaco (strumento di diagnosi per gli infarti);

idrolasi = rompono legami addizionando H O. Si tratta di esterasi,

- 2

proteasi, lipasi ecc. Ad esempio:

glucosio-6-fos