Biochimica e Biologia molecolare

H C

O

O 3 3

CoA SH

O Piruvato

metabolismo. H O

2 OH O O O

O

Ossalacetato

O O O

Malato OH

Può succedere ad alcuni microrganismi che il O

O O

Citrato O

ciclo di Krebs non serve per produrre ATP ma Fumarato O H O

O 2

intermedi, non è metabolismo energetico O

FADH

2 O

O

O

ma metabolismo catabolico. Ci sono FAD O

situazioni in cui manca l’α-chetoglutarato cis-Aconitato

O

O O

H

deidrogenasi, il succinil-CoA e l’α- Succinato O

chetoglutarato sono destinate alla biosintesi O O H O

CoA SH 2

SuccinilCoA

di nucleotidi, aminoacidi e porfirine. ATP GTP O

O O

O

O

Isocitrato

Esiste nelle piante la via del gliossilato: grazie GDP + Pi O

-Chetoglutarato O

all’isocitrato liasi e alla malato sintasi si può Ossalosuccinato

O H

O H

S O

produrre zucchero a partire da acidi grassi. CoA O

O O

O

O NAD +

Nucleotidi

Questo accade solo nelle piante, non negli NADH + H

+

O

Aminoacidi O O

Porfirine O O

umani. È ciò che succede nei semi in O O

germinazione. CO

2

Chiuso il ciclo di Krebs, andiamo a chiudere il cerchio con la spiegazione di cosa se ne fa la cellula degli

elettroni trasportati dal NADH e dal FADH , che entrano nella catena di trasporto di elettroni. È una stretta

2

relazione di localizzazione tra il metabolismo centrale, che avviene nel citoplasma, ed il ricavo di energia

finale con l’ossigeno molecolare, che avviene a livello della membrana interna mitocondriale.

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8. Fosforilazione ossidativa.

La fosforilazione ossidativa e la fotofosforilazione sono processi simili che coinvolgono un flusso di elettroni,

un insieme di reazioni esoergoniche, accoppiate ad un flusso protonico, che è endoergonico. È

l’accoppiamento tra due situazioni energetiche, uno favorevole ed uno sfavorevole. Il flusso di protoni, in

senso inverso, sarà mediato dall’enzima ATP sintetasi e fornisce energia per la sintesi di ATP.

L’anatomia del mitocondrio è fondamentale nella spiegazione di questo processo; sono le due membrane e

la formazione di uno spazio tra di esse, unite alla presenza della matrice mitocondriale, a spiegare la

formazione di ATP, detta ipotesi chemioosmotica.

Alla catena respiratoria partecipano:

 Coenzimi: NADH, FADH , FMN,

2

 Proteine integrali di membrana, come i citocromi (che contengono gruppi eme) o le proteine Fe-S,

 Il coenzima Q, detto anche ubichinone, una molecola idrofobica presente nello strato fosfolipidico,

 Il Citocromo C, una piccola molecola.

Ci sono 4 complessi:

1. NADH deidrogenasi, trasferisce elettroni dal NADH al Q,

2. Succinato deidrogenasi, trasferisce elettroni dal FADH al Q,

2

3. Ubichinone – citocromo C reduttasi, trasferisce elettroni dal Q al citocromo C,

4. Citocromo ossidasi, trasferisce elettroni dal citocromo C all’O .

2

C’è la capacità di pompa protonica dei complessi 1, 3 e 4. Con essa, si accumulano protoni nello spazio

intermembrana, con il caricarsi del gradiente elettrochimico, che serve per fare ATP. C’è un flusso spontaneo

di elettroni che è accompagnato da una spinta della pompa protonica verso lo spazio intermembrana. C’è

una forte importanza della componente anatomica per mantenere il gradiente protonico.

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-

+ +

Tutte le volte che il NADH si ossida a NAD vengono pompati 3 protoni, l’ossidazione di FADH a FAD genera

2

2 protoni.

 Complesso 1, NADH deidrogenasi: trasferisce gli elettroni del NADH (ossidandolo a

+ +

NAD ) al CoQ. Per 2 elettroni che vengono trasferiti, vengono pompati 4 H nello spazio

intermembrana.

 Complesso 2, Succinato deidrogenasi: è lo stesso enzima del ciclo di Krebs, trasferisce

elettroni direttamente dal FADH al CoQ; non trasferisce protoni. È una proteina prevalentemente

2

rivolta verso la matrice mitocondriale perché è lì che si svolge il ciclo di Krebs.

 Complesso 3, Ubichinone–Citocromo C reduttasi: il CoQ, che è liposolubile e si trova all’interno

della membrana interna, trasferisce gli elettroni al citocromo C attraverso un complesso proteico. Il

principale componente del complesso proteico è il citocromo B; tutti i citocromi trasportano un

elettrone per volta, provocando degli effetti collaterali. Il citocromo C è idrosolubile, una piccola

proteina periferica di membrana.

 Complesso 4, Citocromo ossidasi: trasferisce elettroni dal citocromo C all’O 2

molecolare, si ha la produzione di due molecole di H O per ogni molecola di O che viene ridotta; si

2 2

trasferiscono 4 elettroni.

In questi complessi è presente la FMN: è capace di accettare un elettrone per volta, trasformandosi in

+

semichinone, quindi FMNH , e poi in FMNH . Potendo accettare uno o due elettroni si trova in una situazione

2

intermedia.

Il gruppo eme è il gruppo prostetico dei citocromi. I citocromi sono di tipo A, di tipo B e di tipo C. Il citocromo

è una specie di enzima, fa un lavoro di ossidoriduzione flussando gli elettroni. L’unico citocromo con cui si

lega in modo covalente l’eme è il citocromo C, dove c’è un legame tioestere.

Lo ione ferro nel gruppo eme può subire reazioni di ossidoriduzione, passando dallo stato ferroso allo stato

ferrico. Le proteine Fe-S presenti possono essere Fe S oppure Fe S .

2 2 4 4

L’ubichinone o coenzima Q è liberamente diffusibile nella membrana; l’ubichinone, se viene ossidato, diventa

un radicale semichinone; con un altro elettrone diventa ubichinolo ridotto.

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L’ATP sintasi.

L’ATP sintasi sfrutterà il gradiente protonico per ricavare energia, generando ATP.

Si genera un potenziale di membrana ed un gradiente di pH che viene sfruttato per far ritornare i protoni

nella matrice del mitocondrio attraverso l’ATP sintasi nella sua subunità F , per generare ATP mediante la

0

subunità F .

1

L’ATP sintasi è detto anche complesso V, è la quinta proteina in coda alle 4 appena analizzate. Questa teoria

è stata confermata dal fatto che se la membrana mitocondriale interna non è perfettamente integra, non

avviene la produzione di ATP. Sono stati fatti degli esperimenti con dei composti che dissipano il gradiente

protonico, detti disaccoppianti, che impediscono la sintesi di ATP. Per formare ATP ho bisogno di energia

sotto forma di gradiente protonico; i cosiddetti disaccoppianti dissipano questo gradiente.

In realtà esiste anche una situazione fisiologica con il dissipamento del gradiente protonico grazie

all’esistenza di proteine disaccoppianti: una di queste è la termogenina, serve per produrre calore. Il tessuto

adiposo di tipo bruno ha funzione di produrre calore dopo la nascita. Si chiama così perché è ricco di

mitocondri, che danno il colore bruno. Si trova nei neonati e nei mammiferi che vanno in letargo. Esso

+

contiene una proteina, la termogenina, che funziona come un trasportatore di H . Deve esserci un segnale

per farla attivare. La noradrenalina si lega

al recettore e viene attivata l’adenilato

ciclasi. Questa porta la produzione di

cAMP a partire da ATP; il cAMP va ad

attivare una proteina chinasi A legandosi

alle sue subunità regolatorie e lasciando

libere le subunità catalitiche. Non c’è un

target unico per le chinasi: a seconda della

situazione cellulare ci sono diversi

bersagli; in questo caso il target delle

subunità catalitiche sono delle lipasi,

enzimi che scindono i legami esterei dei

trigliceridi, liberando acidi grassi e

glicerolo. Viene consumata energia, l’ATP

si scinde in ADP + P, che si lega alla lipasi

che catalizzano la reazione. Gli acidi grassi

liberi si vanno a legare alla termogenina,

cambiandone la conformazione

(localizzata sulla membrana mitocondriale

interna), che si attiva e si apre. In questo

modo rende disponibile il flusso di protoni dall’esterno all’interno.

Ci sono degli inibitori della fosforilazione ossidativa. Il cianuro od il

monossido di carbonio sono in grado di legare il ferro dell’eme;

l’antimicina è un antibiotico che inibisce il passaggio di elettroni tra il

citocromo B al citocromo C, il rotenone inibisce il complesso 1.

L’ATP sintasi è composta da 2 unità catalitiche: F , proteina di

0

membrana che gestisce il trasporto di protoni; F , costituita da 5

1

subunità, è deputata alla sintesi di ATP.

+

È stato osservato che per 3 H viene sintetizzata una molecola di ATP.

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C’è un cambiamento conformazionale di ogni subunità B: in conformazione L il sito attivo lega ADP + P, in

conformazione T il substrato è legato e si forma ATP, che è rilasciato nella conformazione O. Il passo continuo

del ciclo catalitico garantisce il passaggio tra queste tre conformazioni.

Per trasportare l’ATP all’esterno, deve entrare ADP e P; si parla di trasporto ATP, ADP + P.

Ragionando sulla membrana mitocondriale

interna, definiamo lo spazio intermembrana ed

una matrice. Troviamo un antiporto adenina

nucleotide translocasi, che ha la funzione di

portare fuori ATP e dentro ADP. Troviamo l’ATP

sintasi e poi una fosfato translocasi, un simporto

+

che trasporta dentro ioni fosfato e ioni H . Si sono

quindi evoluti dei trasportatori che agiscono con

un simporto ed un antiporto rispettivamente nel

portar dentro i reagenti e nel portar fuori l’ATP

prodotta.

Il gradiente protonico va a contribuire al

trasporto di ATP e P.

L’ADP ed il P provenienti dall’idrolisi dell’ATP nel

citosol devono entrare nella matrice

mitocondriale.

I radicali liberi e lo stress ossidativo.

A conclusione della respirazione, associata ad essa, e quindi alla degradazione delle molecole associate ad

esse, c’è la produzione di molecole, dette radicali liberi, con stress ossidativo. Si possono formare le

cosiddette specie reattive dell’ossigeno (ROS). Sono composti che contengono elettroni spaiati. Le forme

dell’ossigeno parzialmente ridotte vengono sempre prodotte; è un fenomeno con il quale la cellula deve

avere a che fare e per la quale ha sviluppato sistemi di difesa. Le cellule sono altamente reattive ed altamente

tossiche. Si