Biochimica delle proteine

Biomica metabolica

Struttura delle proteine

La struttura tridimensionale di una qualsiasi proteina può essere scomposta in quattro diversi livelli: il primo è dato dalla struttura primaria, che si riferisce alla sequenza unica degli aminoacidi della catena polipeptidica. Il livello successivo interessa la struttura secondaria, che si riferisce a quelle parti della catena polipeptidica stabilizzate da legami idrogeno. Le strutture secondarie più note sono l'α-elica e il β-foglietto.

α-elica

L'α-elica fu trovata per la prima volta nell’α-cheratina. L’α-elica ha ogni spira dell'elica costituita da 3.6 residui aminoacidici e un passo di 5.4 Å. L'eccezionale stabilità di questa conformazione dipende dal fatto che tutti gli NH e i C=O dei gruppi peptidici sono impegnati in legami a idrogeno. Ogni legame a idrogeno si forma fra l'idrogeno dell'NH di un residuo e l'ossigeno del C=O del quarto residuo successivo. La direzione dei legami a idrogeno è pressoché parallela all'asse dell'elica. L'α-elica presente nelle proteine è quasi sempre destrorsa. Ciò è dovuto al fatto che gli amminoacidi proteici sono tutti nella configurazione "L" e in un'elica sinistrorsa i gruppi laterali R risulterebbero troppo vicini ai gruppi C=O, destabilizzando l'elica. Le catene laterali R dei residui aminoacidici sono tutte rivolte verso l'esterno dell'elica.

β-foglietto

La struttura a β-foglietto è stata trovata per la prima volta nella fibroina della seta. In questa struttura, la catena amminoacidica assume un andamento a zig-zag. Il β-foglietto si forma quando più componenti della stessa catena amminoacidica interagiscono tra di loro attraverso ponti idrogeno che si formano tra gruppi N-H di una catena e C=O della catena adiacente dello scheletro del polipeptide e non coinvolgono le catene laterali degli aminoacidi, che sporgono perpendicolarmente rispetto al piano del legame peptidico. Catene polipeptidiche adiacenti possono avere lo stesso orientamento (per esempio entrambe dall’N- al C-terminale) e sono dette catene parallele, mentre se hanno direzioni opposte sono dette antiparallele.

Struttura terziaria e quaternaria

La struttura terziaria è quella tridimensionale stabilizzata dall’effetto idrofobico, da forze di Van der Waals, da legami idrogeno, da forze elettrostatiche, da ponti disolfuro tra cisteine e nelle metallo-proteine dal coordinamento di ioni metallici. La struttura quaternaria è il risultato di interazioni tra catene polipeptidiche o subunità diverse tenute assieme da forze non covalenti ed elettrostatiche.

Aminoacidi e legami peptidici

Tutte le proteine sono formate a partire da 20 tipi di aminoacidi, tutti α-aminoacidi tranne la prolina che è un α-iminoacido. Gli aminoacidi polimerizzano mediante l’eliminazione di acqua, formando legami peptidici ---CO—NH---. A causa della risonanza, il legame ---C—N--- del legame peptidico ha circa il 40% di carattere di doppio legame e questo fa sì che la libera rotazione sia impedita da una barriera di energia di attivazione di 40-80 kJ/mol: di conseguenza il gruppo ammidico è planare. Così in una catena polipeptidica si hanno una serie di strutture planari, che possono ruotare le une rispetto alle altre attorno ai legami singoli Cα -C e N-Cα indicati rispettivamente con Φ (psi) e Ψ (phi).

Conformazioni del legame peptidico

La rotazione degli angoli psi e phi ha dei vincoli dovuti a collisione sterica. Solo alcune combinazioni sono permesse. Il legame peptidico può adottare due conformazioni diverse, trans e cis. Nella configurazione trans i gruppi C=O e N-H sono diretti in senso opposto mentre in quella in cis sono orientati nella stessa direzione. Nella maggior parte dei peptidi la forma trans è circa 1000 volte più stabile della cis. Quando il secondo residuo di un legame peptidico è rappresentato dalla prolina, la forma trans è solo 4 volte più stabile della forma cis ed è per questo motivo che in diverse proteine non è raro trovare dei legami peptidici contenenti prolina in configurazione cis.

Ruolo della prolina

La maggioranza dei residui di prolina presenti nelle proteine sono, ovviamente, nella configurazione trans poiché in tale situazione gli impedimenti sterici sono minori; i residui di prolina in configurazione cis sono generalmente localizzati nelle regioni in cui la catena polipeptidica cambia bruscamente direzione e sono spesso di fondamentale importanza per lo svolgimento dell’attività biologica o per garantire una maggiore flessibilità conformazionale. Nello stato nativo delle proteine, i legami peptidici contenenti residui di prolina in cis, intrinsecamente poco stabili, sono stabilizzati dalla struttura terziaria; nello stato denaturato le costrizioni conformazionali sono minori ed esiste, quindi, un equilibrio tra gli isomeri cis e trans a livello di ogni legame peptidico. Quando una proteina inizia il processo di folding per assumere la propria struttura nativa, una frazione non trascurabile di molecole possiede uno o più legami peptidici contenenti prolina nella conformazione errata. L’isomerizzazione cis-trans dei legami peptidici contenenti residui di prolina è un processo intrinsecamente lento in vitro. In vivo la velocità di questo processo è notevolmente incrementata dalla presenza di enzimi, peptidil prolil isomerasi, che si trovano in organismi procariotici ed eucariotici.

Enzimi e interazioni

La ciclofilina (la prima prolil isomerasi scoperta) è colpita da alcuni farmaci come la ciclosporina A, inoltre si è visto che interagisce anche con la calcineurina. La presenza di ciclosporina inibisce la produzione di citochine e la proliferazione dei linfociti, inoltre ha un ruolo essenziale nel differenziamento delle linee cellulari. Si sta cercando di sintetizzare inibitori della ciclofilina diversi dalla ciclosporina per ridurre gli effetti collaterali. Particolari prolil isomerasi sono coinvolte nel meccanismo della p53, una proteina che partecipa alla riparazione del DNA. La p53 ha una durata di vita modesta, che aumenta quando si verifica un danno al DNA. Il contatto con la proteina HDM2 provoca la distruzione di p53. Uno stimolo dovuto ad un qualche stress può attivare una serie di segnali che portano alla fosforilazione specifica di alcuni residui di p53. La prolil isomerasi PIN1 riconosce p53 fosforilata, quindi ne isomerizza le proline modificando la struttura complessiva della proteina in modo che possa svolgere la propria attività. p53 ha funzione di fattore di trascrizione per diversi geni che portano all'arresto della crescita cellulare e a fenomeni apoptotici.

Domini proteici

All’interno di una proteina, un dominio proteico è un insieme di aminoacidi in grado di combinarsi sino a formare una struttura globulare compatta. Un dominio consta di un numero di aminoacidi compreso solitamente tra 40 e 350 e tende a ripiegarsi in maniera indipendente. All’interno di una proteina possono esserci più domini. I domini sono costituiti da varie combinazioni di elementi di struttura secondaria (comune ripiegamento di elementi della struttura secondaria = struttura supersecondaria), vale a dire α-eliche e foglietti β quasi sempre disposti adiacentemente e connessi da regioni di loop. A seconda della loro costituzione in eliche e foglietti i domini vengono classificati in tre gruppi: α (coiled coil, helical bundle, globin fold), β (up and down, chiave greca, jelly roll, β elica) e α/β (α/β barrel, motivi ricchi di Leu, α/β opensheet).

Esempi di domini

• Coiled coil: in genere si tratta di un impaccamento di due eliche costituite da 7 aa con all’interno aminoacidi idrofobici e idrofilici. L’aminoacido idrofobico (D) come la Leu o Ile, tende ad impaccarsi con il D della corrispondente catena α ogni due giri. L’aminoacido idrofilico (A) s’impacca anch’esso con il suo corrispondente. Gli aa A e D costituiscono il cosiddetto core idrofobico di questa superelica, denominata appunto coiled coil. Gli aa E e G invece, adiacenti al core idrofobico, sono carichi (Glu, Asp, Arg, Lys) e formano interazioni fra le due eliche (ponti salini). Un famoso coiled coil è il dominio Leu zipper osservato nella proteina GCN4.
• Helical bundle: è costituito da 4 eliche disposte in modo tale che i loro assi siano reciprocamente paralleli. Le catene idrofobiche stanno all’interno mentre quelle idrofiliche stanno all’esterno. Proteine tipiche contenenti questo dominio sono la mioemeritrina, i citocromi c e b562, la ferritina, le proteine del capside del virus del mosaico del tabacco.
• Globin fold: dominio caratteristico delle emoglobine, mioglobine e ficocianine, è costituito da 8 α-eliche indicate con le lettere A-H, collegate da loop corti, e disposti in modo da formare la tasca del sito attivo che in mioglobina e emoglobina ospita il gruppo eme.
• Up and down: Si tratta di foglietti β antiparalleli in cui i filamenti beta appaiono collegati da regioni di loop (β-hairpin). Spesso l’ultimo foglietto è collegato al primo da legami idrogeno, a formare un barile (β-barrel). Un esempio di questo tipo di dominio è fornito dalla neuroaminidasi del virus influenzale in cui i foglietti si organizzano in un β-propeller.
• Chiave greca: È un dominio costituito da 8 filamenti β antiparalleli in modo che beta-n sia collegato con n+3 oppure con n-3. In questo modo si otterrà un core idrofobico ed una porzione idrofilica. Un esempio di questo dominio è rappresentato dall’enzima superossidodismutasi.
• Jelly roll: è un dominio in cui 8 filamenti β antiparalleli sono collegati a 2 a 2 da legami idrogeno formando coppie 1-8, 2-7, 3-6, 4-5. Esempio di questo dominio: proteine del capside dei virus sferici ed emoagglutinina.
• β-elica: La catena si avvolge a formare una ampia elica costituita da filamenti β uniti fra loro da regioni loop. Esistono β-eliche a 2 e a 3 foglietti. Es. a 2 foglietti: sequenza consenso (Gly-Gly-X-Gly-X-Asp-X-U-X)2, dove X = aa qualsiasi e U = aa idrofobico.

Domini α/β

Questi domini si basano sulla cosiddetta cross over connection, cioè la tipica topologia dei domini α/β. Nella cross over connection, due filamenti β sono collegati da una zona di loop dove spesso si trova un’α-elica. Nella mioglobina il dominio proteico costituito da tratti in α-elica è quello in cui è contenuto l’eme. Questo dominio proteico è un esempio di dominio funzionale, in quanto è a questo livello che è presente il sito attivo per il legame con l’O₂, fondamentale affinché la proteina possa svolgere correttamente la propria funzione.

SRC tirosina chinasi

La Src tirosina chinasi è composta di una sequenza di parti funzionali connesse insieme in una singola catena proteica. Procedendo da un capo all'altro, la catena è composta da un segmento di ancoraggio (non visibile nella struttura cristallina), un dominio SH3, un dominio SH2, un collegamento flessibile, un dominio di chinasi, ed una coda finale. Il dominio SH3 ha una piccola scanalatura che afferra le catene proteiche, tenendole abbastanza vicine al dominio chinasi da permettere l'addizione di gruppi fosfato. L'ATP (in rosso nella figura) fornisce i gruppi fosfato. La forma inattiva è avvolta strettamente su se stessa, e usa il corto segmento di collegamento per bloccare il dominio SH3 in modo che non si possa legare ad altre proteine. La chiave per innescare la transizione è una tirosina nella coda (in blu nella figura). Quando questa tirosina è fosforilata, si lega al dominio SH2, facendo assumere la conformazione chiusa a tutto il complesso e mantenendolo in questa posizione come se fosse incollato. Quando il fosfato è rimosso, la coda viene rilasciata e la molecola intera può aprirsi, sbloccando il sito di legame SH3 e permettendo l'accesso al sito attivo di chinasi. La Src compie un movimento grande e complesso quando si "accende" e si "spegne". I domini SH2 ed SH3 sono domini strutturali, nel senso che hanno funzione regolatrice dell’attività della proteina ma non contengono il sito attivo catalitico (presente nel dominio chinasi che rappresenta il dominio funzionale).

Proteine fibrose

Vi sono numerose proteine la cui conformazione tridimensionale è data dalla sola struttura secondaria; tra esse distinguiamo l’α-cheratina, il collageno, la fibroina e l’elastina (sono tutte proteine fibrose). Le cheratine sono il componente fondamentale, pressoché unico, degli annessi cutanei degli animali: capelli, peli, unghie, strati superficiali della pelle, piume, etc. L'unità della cheratina è costituita da una coppia di α-eliche (destrorse) strettamente superavvolte e rinforzate da numerosi ponti disolfuro intercatena. A loro volta, due di queste unità si avvolgono fra loro a formare una protofibrilla. Un certo numero di protofibrille si organizzano infine in fasci, secondo schemi definiti, a costituire un filamento.

Collageno

L'unità fondamentale del collageno, il tropocollageno, è una struttura elicoidale superavvolta con andamento destrorso, formata da tre catene polipeptidiche, ciascuna delle quali ha una struttura secondaria ad elica (elica del collageno), diversa dall'α-elica. L'elica del collageno è infatti sinistrorsa, è più "stirata" (ha un passo quasi doppio rispetto all'α-elica) ed ha un diametro inferiore, avendo solo tre residui amminoacidici per giro. Ogni singola catena è formata da circa 1000 amminoacidi ed è pressoché completamente avvolta ad elica. Le unità del tropocollageno si organizzano in fibre, disponendosi in maniera sfalsata, parallelamente, lungo l'asse della fibra. La fibra è resa ancor più resistente e rigida dalla formazione di legami crociati, di tipo covalente, che si instaurano fra residui di lisina o di istidina delle unità e anche all'interno della stessa unità, tra le singole catene polipeptidiche. A loro volta, le fibre si organizzano con modalità diverse (fasci paralleli, fogli o disordinatamente) a seconda della funzione tipica del tessuto che vanno a formare.

Fibroina

La fibroina è la proteina della seta. A differenza di collageno e cheratina, la fibroina ha una struttura β, organizzata in estesi foglietti, pieghettati a ventaglio. La fibroina è ricchissima di alanina e glicina, che si alternano nella sequenza primaria. Ciò consente ai foglietti β di disporsi in piani sovrapposti, ravvicinati e compatti, tenuti insieme da deboli interazioni apolari fra i residui laterali di alanina e glicina. Questa particolare organizzazione rende la seta morbida e flessibile.

Elastina

Le molecole di elastina vengono secrete nello spazio extracellulare e si dispongono in fibre elastiche vicino alla membrana plasmatica, di solito in rientranze della superficie cellulare. Dopo la secrezione, le molecole di elastina vengono collegate da un gran numero di legami incrociati, generando una estesa rete di fibre e strati. La proteina elastina è composta in gran parte da due tipi di segmenti corti che si alternano lungo la catena polipeptidica: segmenti idrofobici responsabili per le proprietà elastiche della molecola e segmenti ad α-elica ricchi in lisina, che formano legami incrociati fra molecole adiacenti.

Folding e denaturazione

In condizioni fisiologiche le proteine appena sintetizzate tendono ad assumere la loro conformazione nativa, che rappresenta la proteina nella sua forma ripiegata, stabile e a minor contenuto energetico. La proteina nella sua conformazione nativa è attiva da un punto di vista funzionale e da ciò si capisce come variazioni della conformazione nativa possano destabilizzare la struttura della proteina e quindi determinare l’insorgenza di eventuali deficit funzionali. Il processo che conferisce alla proteina la struttura definitiva viene detto folding. Tutta l’informazione che riguarda tale processo e che deriva dalla sequenza del DNA che ha portato all’espressione della proteina risiede nella sequenza primaria degli amminoacidi che la compongono.

Denaturazione delle proteine

Il processo contrario al folding è la denaturazione, con cui la proteina perde la sua struttura tridimensionale (si denatura) per tornare allo stato di semplice catena polipeptidica lineare. La proteina denaturata perde naturalmente anche la propria funzione fisiologica. La denaturazione delle proteine avviene al crescere della temperatura e in altre condizioni estreme, quali una forte variazione della concentrazione salina o in presenza di alte concentrazioni di alcune sostanze (dette denaturanti), quali l'urea, SDS (sodio dodecilsolfato) oppure cloruro di guanidinio. Il processo di denaturazione è reversibile. L’equilibrio termodinamico tra lo stato denaturato (unfolded) e quello nativo (folded) ha un ΔG di 5-20 Kcal/mol (energia modesta). Lo stato unfolded ha contenuto energetico superiore a quello dello stato folded, di conseguenza l’equilibrio è spostato verso lo stato folded, che poi è quello che si riscontra in condizioni fisiologiche. Tra i due stadi, foldato e non, esiste un intermedio liquido che prende il nome di molten globule. Questo possiede la maggior parte della struttura secondaria presente nello stato nativo e in alcuni casi ha addirittura il corretto posizionamento dei segmenti.