Biochimica e analisi biochimica degli alimenti

Utilizzo di enzimi per determinare la concentrazione di un analita

Si possono utilizzare gli enzimi per dosare delle molecole presente in soluzione, e vengono chiamati analiti. In questo caso l'enzima non è il soggetto della misura, cioè la molecola da quantificare, ma l'enzima è solo lo strumento che permette di quantificare un'altra molecola.

Quando si fa un saggio enzimatico, quindi quando si vuole quantificare l'enzima, interessa capire la velocità iniziale della reazione. Quando si usano gli enzimi per dosare un'analita, la velocità della reazione è irrilevante: non interessa sapere la velocità con cui procede reazione. Quando si utilizzano gli enzimi per dosare l'analita, si fanno misure all'equilibrio: si usa l'enzima per raggiungere in tempi ragionevoli l'equilibrio chimico della reazione stessa. Non importa il punto da cui si parte, ma quello a cui si arriva, cioè l'equilibrio chimico.

In questo tipo di misure la molecola che si vuole determinare è il substrato dellareazione stessa, per esempio si vuole dosare la molecola A in soluzione che non ha caratteristiche tali darenderla dosabile. Il principio generale di queste reazioni è di trasformare questa molecola, grazie ad unenzima, in un prodotto B che abbia caratteristiche spettroscopiche diverse dal substrato. EA → B* Se B assorbe la luce ad una determinata lunghezza d'onda si può misurare l'assorbanza della soluzione e grazie alla legge di Lambert-Beer si può sapere la concentrazione e quindi anche la quantità dellamolecola B. Se si trasforma il substrato, che è l'analita da quantificare, in un prodotto che si può quantificare con lospettrofotometro, quello che si può fare è quantificare il prodotto che si è formato. Però, la molecola che si vuole quantificare è il substrato della reazione, in questo caso A.sapere quanto A era presente in soluzione quantificando B, si devono valutare due aspetti:

Aspetto stechiometrico: Rapporto stechiometrico tra le moli di B che si sono formate per ogni mole di A che ha reagito. Per non commettere errori, questa reazione deve trasformare completamente il substrato A nel prodotto B. Se il substrato A è stato trasformato completamente nel prodotto B, le moli di B formate equivarranno alle moli di A iniziali. [Si deve creare (o consumare) una specie facilmente rilevabile]. Quantificando il prodotto si può sapere quanto substrato c'era all'inizio.

Se invece il substrato non è trasformato completamente in prodotto, si può commettere un errore perché le moli di prodotto che si formano, saranno meno delle moli di substrato iniziali. Questo si fa considerando la K, che si calcola facendo le concentrazioni dei prodotti diviso le concentrazioni dei reagenti.

Una reazione non si ferma quando tutto il substrato diventa prodotto.

ma quando raggiunge il suo• equilibrio chimico: quando il rapporto tra concentrazione di prodotti rispetto a concentrazione disubstrati rispetta l'equilibrio chimico. Per poter fare questi tipi di dosaggi si devono scegliere dellereazioni chimiche che hanno la costante di equilibrio molto spostate verso i prodotti, cioè costantidi equilibrio che all'equilibrio danno una quantità residua trascurabile di substrato ancora presentein soluzione. All'equilibrio, la quantità di substrato che non ha ancora reagito e che è ancorapresente in soluzione è trascurabile, e se è trascurabile, quantificando i prodotti formati si puòsapere quanto substrato c'era all'inizio.

Dosaggio del glutammato

Il glutammato è un amminoacido che può essere dosato usando una reazione catalizzata da enzimi. Il glutammato, grazie all'enzima glutammato deidrogenasi, viene deamminato ossidamente a formare α-chetoglutarato.

E ione ammonio. È una reazione in cui avviene un'ossidazione, quindi un cofattore si riduce, un NAD si riduce in NADH.

Si mette in provetta il glutammato, il NAD (non contenuto nell'alimento, ma aggiunto come reattivo per far avvenire la reazione) e l'enzima → la reazione va all'equilibrio chimico. Per ogni glutammato che era presente, si sarà formato un α-chetoglutarato, uno ione ammonio e un NADH.

In questo caso la specie facilmente rilevabile è il NADH che assorbe la luce ad una lunghezza d'onda caratteristica, alla quale invece il NAD non l'assorbe. Dopo che è avvenuta la reazione ed è stato raggiunto l'equilibrio chimico, si deve misurare l'assorbanza alla lunghezza d'onda caratteristica per quantificare il NADH che si è formato. Grazie alla legge di Lambert-Beer si può sapere quell'assorbanza a quale concentrazione di NADH corrisponde e dato che la reazione ha

un preciso rapporto stechiometrico con l'analita da dosare. In questo caso, si può risalire alla quantità iniziale di glutammato presente. Un metodo comune per effettuare questi dosaggi è utilizzare la reazione di accoppiamento tra l'accoppiata+NAD e il NADH. In laboratorio, la molecola finale che viene quantificata è il NADH. Esistono diversi tipi di reazioni per dosare gli analiti, che possono essere sia reazioni semplici che reazioni accoppiate. Questi dosaggi possono essere utilizzati anche per misurare più composti presenti in una singola miscela iniziale. Per determinare la concentrazione di un singolo composto utilizzando una reazione semplice, si può utilizzare una reazione che non è accoppiata, ma che produce come prodotto una specie facilmente quantificabile e che ha un preciso rapporto stechiometrico con l'analita da dosare.l'equilibrio chimico spostato verso i prodotti. Ci sono dei meccanismi per trasformare l'equilibrio chimico verso i prodotti. Una reazione semplice per dosare un singolo composto è quello dell'ammoniaca. Questo dosaggio ha delle peculiarità. Per fare questo dosaggio si aggiungono come reattivi gli altri substrati necessari e l'enzima. Quindi in provetta si aggiunge α-chetoglutarato (come substrato), NADH ridotto come reattivo, e si aggiunge anche l'enzima Glutammato deidrogenasi per catalizzare la reazione. [L'ammoniaca si trova nell'alimento che si sta analizzando]. Se si fa avvenire la reazione in questo modo, la glutammato deidrogenasi catalizza la reazione del glutammato; la reazione va avanti fino a quando si raggiunge l'equilibrio chimico. In questa reazione il NADH non si forma, ma si consuma, perché viene riossidato a +NAD. Si può usare questa reazione per fare un dosaggio, tenendo presente che in questa reazione.

Non si sta formando un prodotto facilmente quantificabile, ma si sta consumando un substrato che si può facilmente quantificare. In ogni caso, grazie alla precisa stechiometria, potendo misurare la concentrazione di una delle specie coinvolte nella reazione, si può fare il dosaggio.

Determinazione di un singolo composto con reazioni accoppiate

Una reazione accoppiata viene usata quando la reazione semplice non rispetta entrambe le caratteristiche necessarie per far avvenire il dosaggio. Ad esempio, se non si forma una specie quantificabile o se non ha un equilibrio chimico abbastanza spostato verso i prodotti.

Il dosaggio di un analita con una reazione accoppiata diventa necessario perché la prima reazione non ferma un prodotto facilmente rilevabile.

Marianna Sala

Il dosaggio del glucosio viene fatto in laboratorio sfruttando le reazioni catalizzate da esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi. La prima reazione è reversibile ed è spostata verso i prodotti.

nessuna delle molecole che stanno reagendo o che si formano è quantificabile dallo spettrofotometro; quindi questa reazione avviene in modo completo, ma non si può quantificare nessuna molecola di quelle che si sta formando o consumando. A questa prima reazione si accoppia una seconda reazione catalizzata dalla glucosio-6-fosfatodeidrogenasi; il secondo enzima prende il prodotto della prima reazione e lo ossida a 6-fosfo-gluconato. In questa seconda reazione si forma il NADPH che è una specie facilmente quantificabile allo spettrofotometro misurando l'assorbanza. Anche in questo caso si conosce la stechiometria di reazione. Se si quantificano quanti NADPH si sono formati, si possono quantificare quante molecole di glucosio erano presente in soluzione. Questi enzimi hanno ottimi di pH e di temperatura molto simili, quindi possono catalizzare la loro reazione in contemporanea. In provetta si mettono come enzimi l'esochinasi e la glucosio-6-fosfato+deidrogenasi.

Come reattivi l'ATP e il NADP. Le due reazioni avvengono in contemporanea, perché man mano che il primo enzima crea il suo prodotto, il secondo enzima comincia a lavorare. Grazie allo spettrofotometro si vede un valore di assorbanza che aumenta nel tempo. La curva che descrive l'andamento della reazione è la curva iperbolica e raggiunge un certo equilibrio finale. La velocità con cui la reazione inizia non è importante, ma interessa solo vedere a quale valore di equilibrio finale si arriva. In questo esempio i due enzimi hanno lo stesso ottimo di pH e temperatura e quindi possono lavorare in contemporanea. Si può fare anche con diversi ottimi di pH → si fa avvenire prima la prima reazione con il primo enzima, poi si modifica e si corregge il pH e poi si fa avvenire la seconda reazione! Quindi non è indispensabile che due enzimi abbiano lo stesso ottimo di pH. Se si fa avvenire la reazione con meno enzima di quello previsto dal protocollo,

il dosaggio è valido lo stesso: quello che cambia è che si raggiunge più lentamente il punto di equilibrio, ma il punto che si raggiunge è lo stesso. Ci vorrà, però, un po' più tempo per raggiungere l'equilibrio della reazione stessa. In questi tipi di dosaggio la quantità di enzima presente non è un fattore strettamente rilevante affinché avvenga in modo corretto il dosaggio, ma se si mette più o meno enzima di quello previsto non si commette nessun errore sulla quantificazione; semplicemente ci vorrà più tempo per raggiungere l'equilibrio finale della reazione stessa. Quindi sbagliare l'enzima non è un problema rilevante. A volte le reazioni vengono accoppiate perché la prima reazione non ha l'equilibrio spostato verso i prodotti. Cioè, al termine della prima reazione, la quantità di substrato residua all'equilibrio è troppo alta e quindinon è trascurabile. In questa casistica c'è il dosaggio di etanolo. Nella prima reazione