Biochimica

Introduzione al corso

Il nostro organismo, a seconda delle condizioni in cui gli zuccheri sono di un livello o un altro, o i grassi sono di un tipo o di un altro, fa avvenire reazioni più o meno diverse. L'insieme delle piccole molecole in una data cellula è detto metaboloma cellulare.

Proteine

Proteine: legano il ligando (es: emoglobina). Gli enzimi, come le proteine, sono capaci di far avvenire reazioni che non avverrebbero in tempi così riduttivi (una proteina verrebbe digerita spontaneamente ma in molto tempo, con gli enzimi viene accelerata di milioni di minuti). Le proteine sono tutti i fattori che permettono la codificazione di geni, la duplicazione del DNA, sono enzimatiche (che catalizzano tutte le nostre reazioni), proteine di membrana che gestiscono la comunicazione tra le cellule.

Ci sono tanti modi per regolare le reazioni e i processi. Le interazioni che ingaggiano le proteine sono deboli, prese singolarmente, ma essendoci migliaia di interazioni deboli in una macromolecola, queste interazioni diventano forti. Questo è il concetto di cooperatività (es. nel DNA abbiamo legami a idrogeno deboli tra le basi azotate, se presi individualmente, ma il fatto che se ne porti dietro migliaia di legami a idrogeno, essi per essere rotti, necessitano di molta energia, come acqua molto calda). L'insieme di tutte le proteine funzionanti in una data cellula è detto proteoma.

Carboidrati

Carboidrati: nella digestione formano trigliceridi che si accumulano in grassi. L’insieme di tutti i carboidrati funzionanti in una data cellula è detto glicoma.

Lipidi

Lipidi: hanno funzione di componenti strutturali delle membrane cellulari, riserve di energia, pigmenti e segnali intracellulari. L’insieme dei lipidi di una data cellula è detto lipidoma.

Biochimica

La biochimica descrive come siamo fatti (strutture che ci compongono), i meccanismi che portano a far funzionare le molecole biologiche (proteine che trasportano - emoglobina-), come trarre energia da macromolecole (degrado, vie cataboliche) e come sintetizzare tali molecole (vie anaboliche), concetto centrale nel metabolismo. Si tratta di una chimica incentrata sul carbonio (scheletri carboniosi nei zuccheri, acidi grassi). Perché proprio il carbonio? Il carbonio è estremamente flessibile quindi può dare origine a legami singoli, doppi e tripli e a seconda di questi tre legami e dei sostituenti che ha, forma molecole tra di loro diverse.

Concetto di stereochimica

Sembra un concetto astratto (enantiomeri L o D) ma in biochimica l'implicazione della stereochimica è molto importante. Concetto di stereospecificità: capacità da parte degli enzimi di riconoscere gli stereoisomeri.

Configurazione degli isomeri: due molecole possono essere fatte della stessa maniera ma cambia la disposizione degli atomi attorno al C (queste molecole sembrano identiche ma non lo sono, hanno interazioni biochimiche diverse, hanno bisogno di enzimi diversi perché questi riconoscono perfettamente un isomero da un altro. Può essere che l'enzima per una forma qualsiasi neppure esiste).

Si noti come, a seconda che la conformazione sia cis o trans, si formino due composti diversi, nonostante i sostituenti legati al doppio legame siano uguali, ma disposti in modo diverso attorno al C che ha il doppio legame. Nella maggior parte delle molecole i legami sono singoli quindi gli atomi legati possono ruotare di 360 gradi, a meno che ci siano gruppi che ingombrano particolarmente, portando a un ingombro sterico. Nel caso degli enantiomeri, si possono presentare due diversi tipi di configurazione: S ed R. Anche la temperatura influenza l'interconversione di questi atomi.

In conclusione, per passare da una configurazione ad un'altra è necessario rompere i legami e crearne di nuovi (per passare da cis a trans o da S a R ad esempio bisogna rompere i legami per l'impossibilità della libera rotazione intorno al C; nel primo caso per la presenza del doppio legame, nel secondo per l'ingombro sterico).

Conformazione

Si parla di conformazione quando non è necessario rompere il legame per far sì che i sostituenti legati al C ruotino intorno ad esso. Questo perché il C ha 4 legami singoli dunque c'è libera rotazione degli atomi attorno ad esso. Ci possono essere infinite conformazioni all’interno di una configurazione.

Osmolarità

I legami idrogeno, non si formano solo tra le molecole di acqua o ghiaccio, ma tra atomi elettronegativi (di solito ossigeno o azoto con una coppia di elettroni non condivisi) e un idrogeno legato covalentemente ad un altro atomo elettronegativo nella stessa o in un’altra molecola. Tutto ruota in ambiente acquoso. Tutto quello che deriva dai ragionamenti che facciamo, non può prescindere dalla presenza di acqua, se questa non ci fosse non saremmo fatti così.

Ci sono amminoacidi che si sposano bene con l'acqua per la presenza di catene idrofiliche, altri invece hanno catene idrofobiche. I composti che contengono regioni idrofobiche e regioni idrofiliche sono detti anfipatici. Essi, quando vengono mescolati all'acqua, interagiscono in modo tale che la parte idrofobica evita il contatto con l'acqua mentre quella idrofilica si dispone in modo da rendere ottimale la sua interazione con l'acqua. I composti anfipatici in acqua assumono delle strutture stabili chiamate micelle. Molte biomolecole sono anfipatiche: proteine, steroli, fosfolipidi, alcune vitamine, pigmenti.

Collasso idrofobico: la proteina si ripiega portando dentro tutti gli amminoacidi idrofobici (core), all'esterno tutta la superficie di amminoacidi idrofilici. Ci saranno alcuni enzimi che avranno dei siti attivi in cui si lega il substrato (adattamento indotto) la proteina si chiude (ripiegamento conformazionale) per fare entrare acqua e avviene la reazione (l'acqua quindi in qualche maniera interferisce, favorendo o sfavorendo quella reazione – spinta termodinamica).

Le membrane delle cellule non si sarebbero mai create senza la presenza di acqua. Esse tendono a compattarsi in maniera tale da mettere insieme tutte le code idrofobiche. L'emoglobina è un tetramero ricoperto da molecole di acqua. L'osmolarità non si può trascurare; essa spiega perché accumuliamo grassi, glicogeno (polimero del glucosio) e quindi spiega perché quando noi mangiamo zucchero sebbene esso venga degradato in monomero, poi, quando questo finisce nel fegato non rimane monomero ma ritorna polisaccaride. Il polisaccaride arriva all'intestino e diventa glucosio, entra in circolo la glicemia che aumenta, produciamo insulina che è un ipoglicemizzante e contrasta l'iperglicemia. Il glucosio non rimane monomero ma dobbiamo spendere energia per prendere glucosio e immagazzinarlo sotto forma di polimero. Questo perché quando lo zucchero diventa monomero, entra nella cellula se ne ho ingerito tanti grammi, questo richiamano l’H₂O per osmosi. Ciò provocherebbe un eccessivo rigonfiamento della cellula che così scoppierebbe. Invece, se a mano a mano che entra il monomero, questo viene convertito nuovamente in polimero e immagazzinato nel fegato, ottengo una concentrazione minore di monomero e non necessito di richiamare ancora H₂O evitando di far scoppiare la cellula. (polimero- monomero - polimero).

Siamo in acqua che è compatibile con gruppi idrofilici ma incompatibile con quelli idrofobici. Gli zuccheri sono idrofilici per definizione per questo si sciolgono in acqua. Interazioni di Van der Waals: quando due atomi privi di carica si avvicinano, le loro nuvole elettroniche si influenzano e si formano due dipoli elettrici transitori opposti. I due dipoli si attraggono avvicinando tra di loro i loro nuclei. Man mano che si avvicinano, però, le loro nubi elettroniche cominciano a respingersi. Quando l’attrazione è massima si dice che i due nuclei sono in contatto di Van der Waals. Le interazioni non covalenti (legami idrogeno, interazioni di Van der Waals, interazioni idrofobiche, legami ionici) sono importanti nelle molecole biologiche e sono molto più deboli dei legami covalenti. Nonostante questo, l’effetto cumulativo di queste interazioni, può essere molto significativo:

• Legame tra enzima e substrato: caratterizzato da molti legami idrogeno, interazioni idrofobiche, ioniche e di Van der Waals. L’energia rilasciata da questo legame è la principale fonte catalitica dell’enzima.
• Il DNA e l’RNA: caratterizzati da molti legami idrogeno e interazioni di Van der Waals il cui potere cumulativo è molto significativo.
• Ripiegamento tridimensionale delle proteine, legame antigene – anticorpo, legame di un ormone o di un neurotrasmettitore al suo recettore: caratterizzati da molte interazioni deboli.

pH

Il pH è una misura della concentrazione di ioni H⁺ generati. Le molecole di H₂O hanno una piccola tendenza a ionizzarsi secondo l'equilibrio. In realtà, il prodotto H⁺ si trasforma istantaneamente in H₃O⁺ poiché si lega immediatamente ad un'altra molecola di H₂O secondo la reazione. Dalla dissociazione dell'acqua deriva il concetto di pH. La misura del pH è molto importante in biochimica, poiché esso influenza la struttura e l'attività delle macromolecole biologiche. L'attività catalitica degli enzimi, per esempio, dipende dal pH. L'analisi del pH delle urine e del sangue si effettuano per formulare una diagnosi medica. Quando un individuo è affetto da diabete grave, il pH del sangue è inferiore alla norma (7,4) e tale condizione viene chiamata acidosi; quando invece il pH risulta maggiore di 7,4, tale condizione è detta alcalosi. Sia l'acidosi che l'alcalosi possono essere mortali.

In biochimica è più importante fare riferimento ad acidi deboli piuttosto che ad acidi forti. Le costanti di equilibrio per le reazioni di ionizzazioni sono chiamate costanti di dissociazioni acide, ed indicate con K_a. Per i valori di K_a si può definire la pK_a: maggiore è la tendenza a liberare H⁺, minore sarà il pK_a e più forte sarà l'acido; minore è la tendenza a liberare H⁺, maggiore sarà il pK_a e meno forte sarà l'acido.

Per determinare il pK_a dell'acido acetito si utilizza la curva di titolazione: metto acido acetico non -deprotonato in una provetta, poi lo tampono con OH^- (ad esempio aggiungendo una base forte come NaOH), spingendolo a deprotonarsi, il pH cambia radicalmente fin quando la curva flette diventando quasi orizzontale e il pH oscilla tra valori molto vicini. Alla fine della titolazione, il pH si ferma a 7 (neutro). Questo spiega che un acido debole e la sua base coniugata, possono agire come una soluzione tampone.

Nella zona in cui il potere tamponante è massimo, il pH della soluzione è uguale al pK_a dell'acido acetico stesso, inoltre, si ottiene il potere tamponante quando la concentrazione del donatore di protoni (acido acetico) è uguale alla concentrazione dell'accettore di protoni (acetato). Ci sono compartimenti intracellulari che sono a pH molto diversi tra di loro (il citosol è neutro, i lisosomi, organello in cui avviene la degradazione delle molecole, sono acidi). Se alcuni enzimi svolgono le loro funzioni nel citosol o nei lisosomi bisogna chiedersi in che contesto stanno lavorando da lì ci si rende conto se si sta sbagliando o meno pH, dato che piccole variazioni di pH influenzano la velocità di un processo. (Non c'è nessuna proteina che sia capace di agire a pH fisiologico).

Nel nostro organismo il pH è mantenuto costante grazie alla presenza di tamponi, cioè la presenza di acidi deboli e le loro basi coniugate. Tra i sistemi tampone biologici, i più importanti sono il sistema fosfato e il sistema bicarbonato:

• Sistema fosfato: agisce nel citoplasma di tutte le cellule ed è costituito dal donatore di protoni H₂PO₄^- e dall'accettore di 2-protoni HPO₄^2-. Esso agisce nel plasma sanguigno a pH fisiologico (7,4).
• Sistema bicarbonato: il sangue può assumere H⁺ provenienti ad esempio dall'acido lattico, prodotto dal muscolo dopo un'intensa attività fisica. L'H₂CO₃ aumenta (reazione 1), a sua volta aumenta anche la CO₂ nel sangue (reazione 2) e anche la pressione parziale di CO₂ aumenta in modo tale che l’anidride carbonica venga espulsa dai polmoni al sangue. Dunque, i polmoni mantengono costante la CO₂ prodotta dall'ossidazione dei combustibili nei tessuti, con conseguente accumulo di H₂CO₃.

Il pH del plasma umano ha un valore compreso tra 7,35 e 7,45, e molti enzimi che agiscono nel sangue si sono evoluti in modo da avere l'attività massima in quell'ambito di pH. L'attività catalitica degli enzimi mostra una sensibilità particolare al pH. Ogni enzima ha un'attività catalitica massima a un pH caratteristico, detto pH ottimale. Allontanandosi dal pH ottimale l'attività catalitica diminuisce rapidamente. Quindi una piccola variazione di pH può influenzare negativamente la velocità di alcune reazioni catalizzate dagli enzimi.

Curiosità

• Nei soggetti diabetici affetti da diabete mellito non trattato, la mancanza di insulina, o l'insensibilità all’insulina (a seconda del tipo di diabete), impedisce l'apporto di glucosio ai tessuti e costringe i tessuti a usare le riserve di acidi grassi come combustibile primario. La dissociazione di questi acidi abbassa il pH del plasma sanguigno a valori inferiori a 7,35, causando acidosi. Se l'acidosi è grave, insorgono mal di testa, stanchezza, nausea, vomito e diarrea, seguiti da stordimento, coma e convulsioni, presumibilmente perché alcuni enzimi a pH più basso non funzionano in modo ottimale. In un paziente con glicemia elevata, bassi valori di pH ed elevati livelli di acido 3-idrossibutirrico e di acido acetacetico nel sangue e nelle urine, la diagnosi più probabile è quella di diabete.
• Il digiuno, specialmente se prolungato, costringe a utilizzare gli acidi grassi come fonte di energia, con le stesse conseguenze che si hanno nel diabete.
• Un esercizio fisico strenuo, come lo sprint di un velocista o di un ciclista, porta all'accumulo temporaneo di acido lattico nel sangue.
• L'insufficienza renale diminuisce la capacità di regolare il livello del bicarbonato.
• Le malattie polmonari (come l'enfisema, la polmonite e l’asma) riducono la capacità di eliminare la CO₂ prodotta dall'ossidazione dei combustibili nei tessuti, con conseguente accumulo di H₂CO₃. L’acidosi grave deve essere trattata somministrando intravena soluzioni di bicarbonato.

Amminoacidi e proteine

Le proteine sono gli strumenti molecolari tramite i quali si esprime l’informazione genica. Gli elementi più essenziali delle proteine sono gli amminoacidi. Essi sono 20 in natura e nelle proteine sono modificati post-traduzionalmente, questo perché le proteine a seconda delle loro funzioni hanno bisogno d’essere modificate (fosforilazione). La fosforilazione avviene grazie alle proteine chinasi che attaccano un gruppo fosfato alla proteina, mentre le fosfatasi rimuovono il gruppo fosfato, in modo reversibile. Unendo i 20 amminoacidi con combinazioni diverse si formano proteine con funzioni diverse.

Lo scheletro generale degli amminoacidi: Gruppo amminico (NH₂) + gruppo carbossilico (COO^-). Il gruppo R spiega la differenza tra i 20 amminoacidi perché rappresenta la catena laterale che contribuisce alla differenza di carica. A seconda del pH in cui l’amminoacido si trova, i gruppi funzionali degli amminoacidi possono comportarsi da acidi o da basi. Il carbonio centrale (C_α) è un carbonio chirale (abbiamo stereoisomeri; configurazione L o D). Noi consideriamo gli amminoacidi della classe L perché sono quelli presenti in natura e gli enzimi stereospecifici riconoscono solo l’isomero L.

Classificazione degli amminoacidi

Si basa sulle caratteristiche di polarità (solubilità in acqua) o di carica della catena laterale. 5 categorie:

• Amminoacidi a catena semplice, idrocarburica, idrofobica: le parti idrofobiche si trovano all’interno, non in superficie; gli amminoacidi che hanno queste caratteristiche, sono formati solo da catene idrocarburiche, più o meno complesse.

Esempi di amminoacidi:

• Glicina: ha solo un H nella catena laterale, quindi non è chirale; è essenziale per la struttura della tripla elica del collagene; se in qualche paziente la glicina viene cambiata con qualsiasi altro amminoacido che provoca ingombro sferico, provoca patologie genetiche di distorsione del collagene.
• Alanina: ha un gruppo CH₃.
• Prolina: è particolare perché ha una struttura ciclica blindata che conferisce rigidità alla proteina; essa si porta dietro due differenti possibilità di orientamento in cis e in trans che non sono interconvertibili se non rompiamo un legame covalente. A seconda di quale isomero sia, dà una struttura diversa alla proteina. Le PPI sono degli enzimi (isomerasi) che convertono durante il ripiegamento della proteina, le due configurazioni cis e trans della proteina.

Ripiegamento delle proteine

Il ribosoma sintetizza pochi amminoacidi in un minuto, ma a mano a mano che dal canale fuoriesce la catena amminoacidica, essa comincia a ripiegarsi interagendo con altri amminoacidi, ma siccome ancora non ci sono tutti gli amminoacidi (tra cui quelli con i quali un determinato amminoacido deve legarsi), spesso il ripiegamento (folding) è errato e quella parte viene degradata.

Amminoacidi aromatici

Hanno una catena laterale grande, che occupa spazio ingombrando stericamente gli amminoacidi che gli stanno vicini; sono idrofobici (queste parti stanno all’interno della proteina). I gruppi aromatici hanno la caratteristica di delocalizzare gli elettroni.