Biochimica - Appunti

Biochimica

Introduzione alla biochimica

La biochimica è la branca della chimica che studia le reazioni chimiche complesse che danno origine alla vita: oggetto di studio sono la struttura e le trasformazioni dei componenti delle cellule, come proteine, carboidrati, lipidi, acidi nucleici e altre biomolecole. L'insieme di reazioni chimiche che avvengono negli esseri viventi possono essere riprodotte in laboratorio (utilizzabili, per esempio, a scopi tecnologici). Ad esempio nel 1897 Eduard e Hans Buchner dimostrano che la fermentazione dello zucchero ad etanolo avviene anche in estratti di cellule di lievito morte e frazionate.

Caratteristiche comuni agli esseri viventi

Tutti gli esseri viventi hanno delle caratteristiche in comune:

• Trasmissione delle informazioni genetiche da cellula madre a cellula figlia (rientra nella biochimica degli acidi nucleici);
• Capacità di cambiare nel tempo attraverso un’evoluzione graduale: avvengono dei cambiamenti favorevoli all’essere vivente;
• Acquisire energia dall’ambiente: un esempio può essere il processo di fotosintesi nelle piante, oppure l’utilizzo dei nutrienti. I nutrienti possono essere rappresentati da micro (sali minerali e vitamine) e macronutrienti. Quest’ultimi rappresentano le macromolecole che vengono degradate per ottenere energia (processo che prende il nome di catabolismo). Di questa energia, una parte viene persa tramite calore, mentre una parte sostanziale viene immagazzinata sotto forma di ATP. Successivamente l’ATP può essere degradata per liberare energia. Grazie all’ATP vengono costituite molecole più complesse (processo che prende il nome di anabolismo).

Elementi chimici essenziali

Le molecole biologiche sono costruite da un numero limitato di elementi chimici: meno di 30 dei più di 90 elementi chimici che si trovano in natura sono essenziali per gli organismi viventi. I quattro elementi più abbondanti negli organismi viventi sono l'idrogeno, l'ossigeno, l'azoto e il carbonio. Gli elementi presenti in tracce rappresentano solo una minuscola frazione del peso del corpo umano, ma sono tutti essenziali per la vita, soprattutto perché sono indispensabili per la funzione di specifiche proteine, tra cui molti enzimi.

Gruppi funzionali

Le biomolecole, in gran parte, possono essere considerate come derivati degli idrocarburi, in cui gli idrogeni sono sostituiti da una serie di gruppi funzionali che conferiscono proprietà caratteristiche alle molecole. Molte biomolecole sono polifunzionali, poiché contengono due o più gruppi funzionali. Essi: possono essere coinvolti nelle reazioni, determinano la stabilità della struttura, oppure fanno interagire diverse molecole tramite legami deboli.

Acetil Coenzima A

Acetil Coenzima A (o Acetil-CoA, oppure CoA) è un tioestere del coenzima A. Questo composto è sintetizzato da diversi processi: dalla degradazione di zuccheri in presenza di ossigeno, dalla degradazione di amminoacidi chetogenici, dalla degradazione di corpi chetonici e nella degradazione dei lipidi. Contiene 8 gruppi funzionali, ma solo il gruppo tiolico reagisce. Può essere utilizzato per produrre energia (attraverso il ciclo di Krebs), ma anche per vie anaboliche (costruttive) per la sintesi di molecole più complesse (es. acidi grassi).

Configurazioni e conformazioni

Le molecole possono avere configurazioni diverse a causa della presenza di doppi legami oppure di centri chirali. Molecole con centri doppi legami possono avere due conformazioni: cis e trans. Esse sono diverse, con funzioni diverse, identificate da proteine diverse. Sono detti enantiomeri, invece, molecole con centri chirali.

Le molecole possono avere diversa conformazione che dipende dalla disposizione spaziale che i gruppi assumono a causa della libera rotazione intorno ai singoli legami C-C. La conformazione può essere sfalsata (più stabile) oppure eclissata (meno stabile).

Interazioni biochimiche

Le interazioni tra biomolecole sono stereospecifiche, ovvero riconoscono solo specifiche conformazioni e configurazioni. Alcuni esempi possono essere: antigene-anticorpo, enzima-substrato, ormone-recettore cellulare. Il sito attivo è la zona dove si lega il substrato.

Legami coinvolti in interazioni biochimiche

I legami si dividono in legami covalenti (più forti) e legami deboli (la maggior parte dei legami in biochimica). Quest’ultimi sono caratterizzati da elevata dinamicità, ovvero che sono in equilibrio di associazione e di dissociazione, per questo sono essenziali per l’esistenza della vita. I legami "deboli" sono meno forti di quelli covalenti, ma solitamente non ne avviene solo uno, ma avvengono tanti legami in modo da eguagliare la forza dei legami covalenti. Tra i legami deboli (dunque non covalenti) si trovano, ad esempio, legami a idrogeno (tra idrogeno ed elementi molto elettronegativi), legame dipolo ed interazioni idrofobiche.

Costituenti degli esseri viventi

Gli esseri viventi sono costituiti da micro e macromolecole (30%, dove la maggior parte sono macromolecole) e acqua (70%). La percentuale di macro e micromolecole è la stessa per tutti gli esseri viventi. Tra le macromolecole troviamo le proteine, gli acidi nucleici, i carboidrati e i lipidi. Le proteine (che rappresentano più del 50% delle macromolecole), gli acidi nucleici e i carboidrati sono polimeri, costituiti rispettivamente da amminoacidi, nucleotidi e monosaccaridi. Il vantaggio di avere dei polisaccaridi è che, ad esempio, con solo 20 amminoacidi si possono formare migliaia di proteine, oppure con solo 4 nucleotidi si possono formare tutti gli acidi nucleici.

Acqua

L'acqua è un componente fondamentale nell’organismo degli esseri viventi in quanto costituisce circa il 70%. Nell’acqua allo stato liquido le molecole d’acqua sono disordinate e in continuo movimento e formano in media 3,4 legami a idrogeno con altre molecole d’acqua (mentre nel ghiaccio ogni molecola forma 4 legami). Ogni molecola di acqua è in grado di formare 4 legami a idrogeno: 2 da donatori e 2 da accettori.

Acqua come solvente

• Con composti idrofilici (es. NaCl) si ha maggior disordine (aumento di entropia) dunque il processo è favorito; deltaG > 0;
• Con composti idrofobici: l’acqua si dispone intorno alla molecola idrofobica in modo ordinato (processo sfavorito deltaG < 0);
• Con molecole anfipatiche: molecole anfipatiche (es. lipidi) costringono le molecole d’acqua a disporsi in modo altamente ordinato. Queste molecole si raggruppano per formare micelle dove vengono disposti i gruppi idrofobici all’interno e gruppi idrofilici verso l’esterno, a contatto con l’acqua. Il processo è favorito perché le interazioni idrofobiche che si associano tra loro limitano le molecole d’acqua che si devono coordinare intorno alle regioni idrofobiche. Effetto idrofobico.

Macromolecole: Proteine

Le proteine sono polimeri non ramificati che assumono specifiche strutture tridimensionali. Gli amminoacidi possono essere considerati come le unità costitutive con cui, organismi diversi, possono generare prodotti molto diversi, come enzimi, ormoni, anticorpi, trasportatori, fibre muscolari… e sono legati tra loro da legami peptidici. La proteina funziona solo se è allo stato nativo.

La lunghezza della catena di amminoacidi può essere molto variabile: ad esempio l’insulina è costituita da due catene polipeptidiche e 51 amminoacidi, la titina (la quale determina la struttura del sarcomero) da 33345 aa.

Funzioni delle proteine

• Sostegno strutturale: sia a livello cellulare, che a livello di tessuto, che a livello macroscopico. Oppure vanno a costituire, come ad esempio la cheratina, le unghie, le corna…
• Trasporto: le proteine di trasporto trasportano piccole molecole non solubili nell’ambiente in cui si trovano; le inglobano e le trasportano. Ad esempio l’emoglobina e la mioglobina trasportano l’ossigeno all’interno del nostro organismo.
• Catalisi: gli enzimi sono proteine che catalizzano delle reazioni biologiche.
• Difesa: come vengono prodotti e che funzioni hanno gli anticorpi.
• Regolazione: ruolo dell’insulina (regola l’ingresso del glucosio in alcuni tipi di cellule).
• Movimento: actina, miosina.

Amminoacidi

Gli amminoacidi sono gli elementi che costituiscono le proteine:

A pH intorno a 7 gli amminoacidi si trovano in questa forma. Sono tutti α-amminoacidi, il gruppo amminico è sempre legato al carbonio adiacente al carbonio carbossilico (quello, appunto α):

Gli amminoacidi beta esistono in natura ma hanno altre funzioni (mai nella catena di amminoacidi). In tutti gli amminoacidi comuni, ad eccezione della glicina (dove R = H) il carbonio α è legato a quattro differenti gruppi: un gruppo carbossilico, un gruppo amminico, un gruppo R e un idrogeno. Il carbonio α è quindi un centro chirale. Inoltre a causa della disposizione tetraedrica degli orbitali di legame, i 4 gruppi possono disporsi nello spazio in due modi, quindi per ogni amminoacido sono possibili due stereoisomeri, che essendo non sovrapponibili, vengono detti enantiomeri. Grazie alla configurazione assoluta si possono dividere in D e L amminoacidi. Nelle proteine sono tutti L-amminoacidi.

Per identificare se un amminoacido è L o D c’è un trucco: Guarda tra Carbonio e idrogeno Devi leggere "CORN" in senso orario se lo leggi è un L-amminoacido.

In condizioni fisiologiche (pH 7) gli amminoacidi sono in forma zwitterionica (contengono una carica positiva e una negativa). La forma non ionica (dove il gruppo carbossilico è protonato: COOH, e il gruppo amminico non lo è: NH₂) non ha carica (non esiste).

→ curve di titolazione.

Da un pH basso si ha la forma completamente protonata; aumentando il pH si ha prima la deprotonazione del gruppo carbossilico; aumentando ancora si ha la deprotonazione del gruppo amminico e completa deprotonazione (carica complessiva= -1). Il punto isoelettrico si trova dove la carica è pari a zero.

Gli amminoacidi che costituiscono tutte le proteine sono 20, i quali differiscono per la catena laterale e possono essere suddivisi in diversi gruppi in base alla loro funzione. Questi 20 possono essere considerati come una forma di alfabeto con cui è scritto il linguaggio della struttura delle proteine. Ad ogni amminoacido presente nelle proteine è stata assegnata un’abbreviazione a tre lettere e un simbolo ad una lettera, utilizzati per indicare le sequenze e le composizioni in amminoacidi delle proteine. Il codice a tre lettere consiste delle prime 3 lettere del nome inglese dell’amminoacido, mentre il sistema a una lettera è stato introdotto ai tempi del computer a scheda perforata a causa della necessità di ridurre le dimensioni dei file.

Classificazione degli amminoacidi

• Amminoacidi con gruppo R non polare. Le catene laterali di alanina, valina, leucina e isoleucina tendono a raggrupparsi all’interno delle proteine, stabilizzando la struttura proteica tramite interazioni idrofobiche. La minuscola catena laterale della glicina non contribuisce alla formazione di interazioni idrofobiche. Infine abbiamo la metionina e la prolina;
• Catena laterale polare ma non carica. I gruppi R di questi amminoacidi sono molti più solubili in acqua, o più idrofilici, degli amminoacidi non polari, perché contengono gruppi funzionali che formano legami a idrogeno con l’acqua. Vengono compresi gli amminoacidi serina (OH), la treonina (OH), la cisteina (SH, è un acido debole per cui può formare legami a idrogeno deboli con O e con S), l’asparagina (NH₂) e la glutammina (NH₂);
• Catene laterali che possono caricarsi positivamente o negativamente. Sono più idrofili i gruppi R contenenti cariche. Gli amminoacidi che hanno una catena laterale con carica netta positiva a pH=7 sono: la lisina (gruppo amminico carico), l’arginina (gruppo guanidinico) e l’istidina (gruppo imidazolico aromatico, senza carica). I due amminoacidi che hanno gruppi R con carica negativa a pH=7 sono l’aspartato e il glutammato, entrambi con un secondo gruppo carbossilico (COO-);
• Amminoacidi che nella catena laterale hanno anelli aromatici. I 3 amminoacidi fenilalanina, tirosina e triptofano, con le loro catene laterali aromatiche, sono non polari (idrofobici). Tutti e tre possono intervenire nelle interazioni idrofobiche.

Altra classificazione degli amminoacidi

Un’altra classificazione può essere:

• Amminoacidi idrofobi (hanno nella catena laterale carattere idrofobo) che possono essere glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e prolina.
• Idrofilici (hanno nella catena laterale carattere idrofilo) che possono essere arginina, istidina, asparagina, glutammina, aspartato, glutammato, serina e cisteina.
• Infine quelli anfipatici (che nella catena laterale hanno qualcosa di idrofilo e idrofobo) dove troviamo lisina, metionina, treonina, tirosina e triptofano.

Struttura proteica

Nella struttura proteica gli amminoacidi si avvolgono determinando strutture nello spazio. Ogni proteina ha una propria struttura e funziona solo se assume quella struttura (struttura nativa). Nell’avvolgimento delle catene, gli amminoacidi che non stanno bene nell’ambiente esterno (idrofobici) vengono disposti all’interno mentre quelli che stanno bene all’esterno (idrofilici) vengono disposti verso l’esterno. Nelle proteine di membrana, invece, gli amminoacidi idrofobici si dispongono sulla superficie delle proteine di membrana.

Caratteristiche particolari degli amminoacidi

La glicina è l’amminoacido più semplice (dove R= H) e quindi occupa meno spazio (si hanno avvolgimenti più stretti della catena polipeptidica). Il carbonio α non è chirale. La prolina ha una catena laterale ciclica rigida che limita la possibilità di formare legami idrogeno e di rotazione. Possiede quindi un gruppo amminico secondario (o gruppo imminico) invece di un gruppo amminico primario come gli altri amminoacidi. Per questo viene anche chiamata imminoacido.

→ Maggior numero di glicina: stabilizzante, maggior numero di prolina: destabilizzante.

La cisteina contiene zolfo nella catena laterale. Può reagire con un’altra cisteina per formare cistina (legame covalente zolfo-zolfo). Se due cisteine, all’interno di una catena polipeptidica, sono alla giusta distanza per formare il legame, si forma un legame covalente zolfo-zolfo (ponte disolfuro). Di ponte disolfuro ce ne possono essere di 2 tipi:

• Ponte disolfuro intracatena (cisteine nella stessa catena polipeptidica): ruolo di determinare la struttura;
• Ponte disolfuro intercatena (tra catene distinte): stessa funzione quando le proteine sono costituite da più catene polipeptidiche.

L’insulina è costituita da 2 catene polipeptidiche (diverse tra loro, ma possono essere anche uguali) dove ci sono sia ponti disolfuro intracatena e intercatena (2 inter, 1 intra).

pKa di alcuni gruppi R:

• Lisina: 10.53
• Arginina: 12.48
• Aspartato: 3.65
• Glutammato: 4.25

Essi hanno gruppi amminici nella catena R. Saremo sempre sotto questi valori di pH: sempre carichi (protonati). Essi hanno gruppi carbossilici nella catena R. Saremo sempre sopra questi valori di pH: sempre carichi (deprotonati).

L’istidina a pH 6.00 (fisiologico=7) a volte ci troviamo sopra (maggior casi) oppure sotto, dunque può essere protonata (carica) oppure deprotonata (non carica). In molte reazioni catalizzate da un enzima l’istidina facilita la reazione agendo da donatori o da accettori di protoni.

Nell’arginina, con tre azoti, si hanno 3 strutture di risonanza:

Nell’istidina, con due azoti, si hanno 2 strutture di risonanza:

Curva di titolazione del glutammato è determinata dai punti isoelettrici, considerati i pK dei soli gruppi COOH. Nell’istidina per calcolare i PI si considerano i pK dei soli gruppi NH₂.

Equazione di Henderson-Hasselbach

Dall’equazione di Henderson-Hasselbach: si ha che:

• Se [A-] = [HA] allora il rapporto [A-]/[HA] è pari a 1 e pH = pKa;
• Se il pH < pKa allora il log di [A-]/[HA] è negativo, il rapporto [A-]/[HA] è minore di 1 l’equilibrio è spostato verso la forma protonata;
• Se il pH > pKa allora il log di [A-]/[HA] è positivo, il rapporto [A-]/[HA] è maggiore di 1 l’equilibrio è spostato verso la forma deprotonata.

Amminoacidi aromatici

Amminoacidi aromatici (nella catena laterale contengono anelli aromatici) sono in grado di assorbire la luce e la capacità di assorbimento può essere misurata tramite spettrofotometro:

Una lampada emette luce su un monocromatore (che seleziona la lunghezza d’onda scelta dall’operatore) che colpisce il campione in una cella porta campione (provetta), la quale può essere di plastica (a lunghezze d’onda alte), oppure di quarzo (a lunghezze d’onda basse). Parte della luce verrà assorbita, l’altra parte verrà trasmessa (catturata e misurata da un rilevatore). Viene calcolato un valore A (assorbanza) come log*I₀/I. La relazione che correla la quantità di luce assorbita da un materiale, alla concentrazione e allo spessore del materiale stesso attraversato è la legge di Lambert-Beer:

Dove I è l’intensità della luce incidente, I₀ è l’intensità della luce trasmessa, il rapporto I/I₀ è la trasmittanza, ε è il coefficiente di estinzione, specifico per ogni proteina e dipende da quanti amminoacidi aromatici sono presenti della catena polipeptidica, c è la concentrazione delle specie che assorbono la luce, ed d è la lunghezza della cella porta campione.

Valori alti di A indicano alta capacità di assorbimento della luce, mentre valori bassi di A indicano bassa capacità di assorbimento. Sui 3 amminoacidi aromatici si eseguono spettri di assorbimento che servono per capire la lunghezza d’onda dove si ha maggior assorbimento (picco sul grafico).

Picchi di assorbimento: 276 nm per la tirosina, Triptofano 280 nm, Fenilalanina 270 nm. Il triptofano assorbe maggior quantità.