Biochimica - Appunti

Struttura e direzione delle catene polinucleotidiche

Le due estremità, in questo modo, non sono uguali: esiste un'estremità 5' (5 primo) ed estremità 3' (3 primo). La prima ha un fosfato libero legato ad un carbonio 5, mentre l'estremità 3' ha un fosfato libero legato ad un carbonio 3. La direzione di una catena polinucleotidica è definita come 5' -> 3', corrisponde alla direzione di polimerizzazione nella biosintesi sia del DNA che dell'RNA. Le sequenze nucleotidiche vanno quindi lette in direzione 5'. I gruppi fosfato hanno pKa = 2, dunque a pH fisiologico sono carichi negativamente. All'interno della cellula i gruppi fosfato sono in genere neutralizzati da ioni Mg2+ o da proteine cationiche (ricche in lisine e arginine) che formano complessi con il DNA.

Studi sul DNA:

• Regola di Chargaff: la quantità di A è uguale alla quantità di T; la quantità di G è uguale alla quantità di C. La quantità di G+A è dunque...

uguale alla quantità di C+T.

Studi di cristallografia su molecole di DNA (Rosalind Franklin): tramite una sorgente di raggi X, essi colpiscono il campione (del DNA) e vengono rifratti e vengono raccolti da una pellicola. Viene così espressa un’immagine.

Struttura ad elica del DNA (Watson e Crick): due eliche destrorse con sequenza complementare e polarità opposta.

Struttura tridimensionale del DNA

Le basi complementari interagiscono tra loro mediante legami a idrogeno (coppia A-T 2 legami idrogeno, C-G 3 legami a idrogeno). Coppia A-T meno stabile di C-G. La struttura è a doppia elica, poiché è quella che avvicina al meglio le coppie di basi adiacenti. Le coppie adiacenti formano tra loro interazioni idrofobiche e sono la forza principale che stabilizza la molecola di DNA. Questo impilamento insieme alle interazioni idrofobiche rende il doppio filamento molto più stabile rispetto alla molecola a filamento singolo.

Esistono anche forze

di repulsione che tendono ad allontanare i due filamenti dovute alle cariche negative dei fosfati che si trovano su entrambi i filamenti. Esse vengono annullate dall'interazione con cariche positive. L'elica di DNA è destrorsa. (13^ lezione - 15-11-21)

Principali differenze tra DNA e RNA:

1. L'RNA contiene uracile, mentre il DNA contiene timina;
2. Come zucchero ha il ribosio, mentre il DNA deossiribosio;
3. L'RNA è a singolo filamento, mentre il DNA è doppio (stessi legami fosfodiesterici).

Ci sono diversi tipi di RNA: il principale è l'RNA ribosomiale (rRNA, 80%). Costituisce assieme alle proteine ribosomiale costituisce i ribosomi. L'RNA di trasporto (tRNA, 5%) ha il compito di trasportare amminoacidi durante il processo di sintesi delle proteine. Infine l'RNA messaggero (mRNA, 3%) contiene l'informazione genetica per la sintesi delle proteine. Tutti sono coinvolti nel processo di sintesi delle proteine.

Anche se

è a singolo filamento ha struttura tridimensionale nello spazio formato in strutture secondarie. Si originano doppie eliche quando due regioni complementari si appaiano (la struttura si stabilizza). Ogni RNA ha struttura specifica.

Principio trasformante

Il DNA contiene tutte le informazioni genetiche che vengono poi trasmesse da generazione a generazione. Come si è capito? In un esperimento del 1928 vennero utilizzati due ceppi batterici: un pneumococco crepoS virulento (se inoculato in un topo, provoca morte), e un pneumococco ceppo R (se inoculato nel topo, non è virulento). Se il ceppo virulento viene fatto bollire ed iniettato nel topo, esso non muore; ma se vengono miscelate le cellule morte con cellule del ceppo non virulento il topo muore. C’è qualcosa che passa dal ceppo virulento (morto) ad un ceppo non virulento, rendendolo letale, ed ev’esserci qualcosa che lo passa: principio trasformante.

Nel 1944 l’esperimento venne ripetuto con gli

1. Viene prelevato il ceppo S e viene fatto bollire.
2. L'estratto che si ottiene viene diviso in 3 provette:
1. In una viene aggiunta RNase, enzima che promuove la degradazione dell'RNA.
2. Nella seconda viene aggiunto proteasi, enzimi che degradano le proteine.
3. Nella terza viene aggiunta DNase ("d n asi").
3. Queste 3 provette vengono aggiunte al ceppo R (sempre diviso).
4. Ceppo R miscelato a RNase o a proteasi danno origine a batteri virulenti, mentre quello miscelato con DNase si ha solo il ceppo R, non virulento.
5. Il principio trasformante è dunque il DNA.
6. Un altro esperimento ci permette di definire quale componente di un batteriofago, o DNA o proteina, rappresenta il materiale ereditario che penetra in una cellula batterica per dirigere la produzione di nuove cellule virali:
1. Si fa crescere due popolazioni distinte di batteriofagi T2, una cresciuta con terreno dove l'unica fonte di zolfo è la 35, mentre l'altra in un terreno dove l'unica fonte di...

fosforo è la 32. Lo zolfo è presente nelle proteine (non nel DNA), mentre il fosforo è presente nel DNA (mai nelle proteine). Questi batteriofagi vengono messi a contatto con batteri E. coli e poco dopo tempo il mescolamento di un frullatore causa il distacco dei virus dai batteri. La miscela che si ottiene viene centrifugata dove viene separata in una parte solubile ed una parte insolubile. I fagi con fosforo 32 mostrano pellet marcato, mentre la parte solubile incolore, mentre i fagi con zolfo 35 mostrano parte solubile marcata e pellet no. La molecola, dunque, che contiene tutte le informazioni genetiche è la molecola di DNA.

Replicazione del DNA

Vi sono 3 ipotesi per la duplicazione della molecola di DNA: conservativa (si mantiene integra la molecola originaria generando una molecola interamente nuova), dispersiva (due molecole i cui filamenti sono costituiti da frammenti di DNA vecchio e neosintetizzato dispersi lungo ogni filamento) e semiconservativa (ciascuna)

molecola contiene un intero filamento vecchio e uno neosintetizzato). Quest’ultima venne stataproposta da Watson e Crick, ed è anche la teoria più accreditata.

Esperimento di Meselson e Stahl: Vennero fatti moltiplicare batteri con azoto 15 (azoto “pesante”) per piùcicli di duplicazione, e fatti crescere su un terreno con azoto 14 (azoto “leggero”) e vengono fatti duplicareper una o due volte. Si estrae così il DNA dalla popolazione iniziale (cresciuta con azoto 15), dallapopolazione duplicata una volta e da quella duplicata due volte, in 3 provette diverse con saccarosio emesse poi in centrifuga. Il saccarosio permette di distinguere le molecole in base alla loro densità.

Il DNA estratto dalla popolazione originale origina un’unica banda. Estraendo il DNA dalla primaduplicazione si nota che un filamento è costituito da azoto 15, e l’altro da azoto 14 (più leggera). La teoriaconservativa

interviene è il DNA elicasiperché svolge la doppia elica, e dopo l'apertura, delle proteine chiamate proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSBP) si legano ai singoli filamenti di DNA per evitare che si richiudano. Qui inizia la sintesi del filamento nuovo grazie al Replisoma che comprende gli enzimi Primasi, DNA polimerasi e ligasi. Questi enzimi sono direttamente coinvolti nella sintesi del nuovo filamento.

Come avviene la sintesi del nuovo filamento: la sintesi avviene sempre in una direzione 5' → 3'. Quindi vengono aggiunti nucleotidi all'estremità 3' primo. Il filamento nuovo ha sequenza complementare, e polarità opposta, al filamento che fa da stampo.

Il filamento madre è composto a sua volta da due filamenti: uno che va da 3' a 5', mentre quello sotto va da 5' a 3'. Per la sintesi del filamento che va da 3' a 5' si legge (la lettura dello stampo va da 3' a 5') e si sintetizza (questo filamento nuovo viene chiamato filamento guida).

mentre per la sintesi del filamento (chiamato filamento ritardato) che va da 5 a 3 la situazione è più complessa dove viene sintetizzato in modo discontinuo (in piccoli pezzi, in frammenti) perché l'apparato di sintesi deve tornare indietro.

Questi frammenti sono chiamati frammenti di Okazaki e vengono poi uniti con un processo separato.

La sintesi dei legami fosfodiesterici tra nucleotidi avviene grazie all'enzima DNA polimerasi III. Essa legge il stampo (3 a 5) e polimerizza in direzione contraria (aggiunge nucleotidi all'estremità 3). È in grado di capire qual è il nucleotide corretto da aggiungere. Senza stampo non è in grado di sintetizzare. La DNA polimerasi III, infatti, si lega allo stampo, lo legge ed utilizza, come substrati, nucleotidi trifosfato. Il nucleotide monofosfato si lega alla catena sintetizzata e si libera uno ione pirofosfato (due fosfati assieme). Successivamente lo ione pirofosfato viene

idrolizzato e viene liberata tutta l'energia necessaria per compiere questa reazione. La DNA polimerasi III necessita anche di un innesco. Serve un filamento già preformato per poterlo allungare. Questi frammenti già sintetizzati che si appaiano allo stampo sono chiamati RNA di innesco (pezzi verdi nell'immagine precedente). L'enzima primasi sintetizza questi RNA di innesco composti da circa 10 nucleotidi, mentre un frammento di Okazaki è lungo circa 1000 nucleotidi. Quando tutti i frammenti di Okazaki sono sintetizzati, interviene l'enzima DNA polimerasi I che idrolizza l'RNA di innesco e lo sostituisce con del DNA. Infine l'enzima ligasi lega tra loro i frammenti di Okazaki. La DNA polimerasi I ha due attività:

• Attività polimerizzante in direzione 5' a 3';
• Attività esonucleasica 5' a 3': L'attività nucleasica è l'attività opposta alla polimerizzante. Si suddivide in