Biochimica - Appunti

Acidi nucleici

DNA e RNA eucariotico

Il DNA eucariotico è nucleare ed è presente prevalentemente nel nucleo e in minima parte negli organelli. L'RNA eucariotico è più differenziato, cioè troviamo varie forme di RNA oltre a quelle classiche (RNA transfer, RNA messaggero, RNA ribosomiale). È localizzato a livello citoplasmatico e costituisce il 75% dei ribosomi e delle proteine ribosomiali.

DNA e RNA procariotico

Il DNA procariotico è più semplice in quanto è cromosomiale e circolare, ovviamente non è nucleare perché privo di nucleo. L'RNA procariotico è costituito da RNA transfer, RNA ribosomiale e RNA messaggero.

Valore C

Per avere un'idea delle dimensioni di un genoma si utilizza un parametro che ha il nome di Valore C: che è il contenuto di DNA aploide in un organismo. DNA aploide perché in questo modo si può paragonare sia organismi che hanno un assetto cromosomico aploide e sia organismi che hanno un assetto cromosomico diploide, poliploide ecc. Quindi si prende in considerazione solo un set di cromosomi là dove ci sono, o di DNA presente, e questo sia nei procarioti che negli eucarioti. Il Valore C viene indicato con BP cioè base pairs che significa coppie di basi. Notiamo infatti come aumenta man mano che si passa da organismi semplici come batteri (un es. E. coli) a uomini e a piante. Nel caso dell’uomo ci sono circa 3 miliardi di coppie di base che assumono una lunghezza di 94 cm. Nel caso delle piante le dimensioni aumentano, in quanto si parla di 100m di DNA.

Struttura degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono macromolecole, quindi così come le proteine e carboidrati, anch'essi derivano dalla condensazione di vari monomeri che sono i nucleotidi. Queste macromolecole sono lineari, organizzate a catena che sono state isolate originariamente per la prima volta dai nuclei delle cellule. Se noi prendiamo un acido nucleico e lo idrolizziamo, cioè lo rompiamo, quindi lo trattiamo, in presenza di acqua, con un enzima specifico che taglia i legami che uniscono i vari monomeri dell’acido nucleico e otteniamo i nucleotidi.

Per vedere questi nucleotidi come sono formati, li idrolizziamo ulteriormente aggiungendo però una base forte che provoca la rottura dei vari costituenti dei nucleotidi e si libera una componente che è l’acido fosforico (H₃PO₄) e resta il cosiddetto nucleoside. Il nucleoside è uno zucchero più una base azotata, per rompere ulteriormente i nucleosidi, in presenza di acidi molto forti si possono ottenere la base eterociclica che costituisce il nucleoside e lo zucchero.

Nucleotidi e nucleosidi

Quindi ricapitolando, in ordine abbiamo: il nucleoside che è formato da zucchero e una base azotata. Aggiungendo al nucleoside il gruppo fosfato otteniamo il nucleotide, più nucleotidi formano gli acidi nucleici. Quindi quando parliamo di gruppo fosfato ci riferiamo ai nucleotidi (zucchero + base e gruppo fosfato); nel momento in cui non c’è il gruppo fosfato, parliamo di nucleoside. Gli acidi nucleici sono formati da nucleotidi.

DNA e RNA

Gli acidi nucleici sono due: DNA e RNA. Il DNA è l’acido deossiribonucleico e l’RNA è l’acido ribonucleico. Entrambi sono formati da queste tre componenti: zucchero, base eterociclica e gruppo fosfato. La differenza tra i due riguarda lo zucchero perché l’RNA ha il ribosio mentre il DNA ha il deossiribosio. Le basi azotate del DNA sono quattro: Adenina, Citosina, Guanina e Timina, mentre nell’RNA sono: Adenina, Citosina, Guanina e Uracile al posto di Timina. Gli atomi di carbonio dello zucchero vengono nominati con gli apici per differenziarli da quelli delle basi. Il legame fra il C1’ (carbonio uno primo) dello zucchero e l’N (azoto 1 o azoto 9) della base azotata è un legame glicosidico.

Pirimidine e purine

Le basi azotate si dividono in due classi: le purine e le pirimidine. A seconda dei sostituenti abbiamo tre basi pirimidiniche e due puriniche.

• Basi Pirimidiniche:
  • Citosina (presente sia nel DNA che RNA)
  • Timina (Presente nel DNA e qualche RNA)
  • Uracile (è il corrispondente della timina nell’RNA)
• Basi Puriniche:
  • Adenina (presente sia nel DNA che RNA)
  • Guanina (presente sia nel DNA che RNA)

Proprietà delle basi azotate

Esse sono dei tautomeri, cioè isomeri strutturali che hanno la stessa molecola ma una diversa disposizione nello spazio. I tautomeri differiscono per la presenza di doppi legami, quindi quando il doppio legame all’interno della molecola può essere spostato a un’altra parte della molecola mantenendo le proprietà chimico-fisiche. I tautomeri sono essenzialmente due e si parla di equilibrio tra i tautomeri, nel senso che le molecole passano da una forma all’altra. Quando si ha questo passaggio, una delle due forme prevale sull’altra perché è più stabile.

Le forme tautomeriche sono due:

• L’equilibrio tra la forma cheto-enolica per guanina e timina (uracile)
• L’equilibrio tra forma ammino-imminica per adenina e citosina

Un’altra proprietà degli acidi nucleici è quella di assorbire i raggi ultra violetti a 260 nm questo per la presenza di doppi legami coniugati. Oltre alle 5 basi azotate conosciute, presenti sempre nel DNA, nell’RNA oltre a queste 5 basi ve ne sono altre rare come: Ipoxantina, l’inosina, pseudouridina, la 5-metilcitosina, la 5,6-Diidrouracile.

Nomenclatura

• Nucleoside: zucchero + base azotata. Possiamo avere due conformazioni  SIN: quando le basi azotate sono impilate sullo zucchero; ANTI: se è alternata intorno allo zucchero. È sempre presente l’orientamento ANTI negli acidi nucleici e nel DNA. I nucleosidi sono solubili in acqua, quindi fortemente polari, e sono facilmente idrolizzabili in condizione acide.

Abbiamo quattro nucleosidi nel DNA:

• Adenina  2-deossiadenosina
• Guanina  2-deossiguanosina
• Citosina  2-deossicitosina
• Timina  2-deossitimina

E quattro nucleosidi nell’RNA:

• Adenina  adenosina
• Guanina  guanosina
• Citosina  citidina
• Uracile  uridina

• Nucleotide: al C 5’ OH di uno zucchero si aggiungono gruppi fosfato. Il legame che si viene a formare è di tipo fosfodiesterico cioè un acido fosforico si lega a un gruppo ossidrilico mediante un legame estereo che si chiama fosfoestereo perché c’è il gruppo fosfato. Quindi i nucleotidi derivano dai nucleosidi e possono essere: Mono, Di e Tri- fosfato a seconda di quanti gruppi fosfato vengono legati. I Trifosfati, in misura maggiore, e i Difosfati, in misura minore, sono molto più energetici rispetto ai nucleotidi Monofosfati. Infatti l’ATP, la moneta energetica, viene usata come Adenosina-trifosfato, in quanto si libera il pirofosfato e resta l’AMP. La liberazione e la scissione di questo pirofosfato conferisce alla cellula l’energia necessaria per formare dei legami e per portare avanti il metabolismo energetico.

Abbiamo quattro nucleotidi nell’RNA:

• Adenina  AMP, ADP, ATP
• Guanina  GMP, GDP, GTP
• Citosina  CMP, CDP, CTP
• Uracile  UMP; UDP; UTP

Quattro nucleotidi nel DNA:

• Adenina  dAMP, dADP, dATP
• Guanina  dGMP, dGDP, dGTP
• Citosina  dCMP, dCDP, dCTP
• Timina  dTMP, dTDP, dTTP

Funzioni dei nucleotidi

1. I nucleotidi sono le unità strutturali degli acidi nucleici.
2. Fungono da deposito di energia.
3. Sono dei secondi messaggeri, cioè molecole che trasmettono le informazioni. La cellula reagisce con uno stimolo e passa l’informazione all’interno di essa attraverso questi secondi messaggeri. Un esempio è il calcio che è il secondo messaggero che serve alla contrazione muscolare. Il g AMP e in particolare il c AMP sono dei nucleotidi che fungono da secondi messaggeri. Il cAMP (AMP ciclico) si forma partendo dall’ATP e in presenza di adenoilato ciclasi si stacca il pirofosfato e si forma il legame tra il fosfato al 5’ e al 2’.
4. Fanno parte di coenzimi (NAD, FAD, CoA).
5. Sono intermedi di alcune reazioni sintetiche.
6. Sono importanti nella formazione della S-adenosilmetionina, una proteina donatrice di metili. La metionina, che è un amminoacido, si lega all’adenina quindi si forma un legame tra lo zolfo della metionina e il C 5’. Questa struttura che si viene a formare è molto instabile per la presenza dello zolfo carico positivamente che lega tre carboni e che ha questo gruppo metilico che facilmente viene tolto.

Coenzimi

Il Coenzima A (CoA): serve in alcune reazioni a legare alcuni gruppi acilici e a trasferirli fisicamente ad un’altra parte della cellula. Il CoA è formato da tre porzioni: L’ADP con una piccola modifica, il fosfato al 3’; all’ADP è legato l’acido pantotenico che si lega alla porzione β-mercaptoetilamina. Siccome trasporta gruppi acilici, quali l’acetile, essa prende il nome di acetil-CoA.

NAD (nicotinammideadenindinucleotide) e FAD (flavin adenina di nucleotide): sono due enzimi che partecipano nelle reazioni di ossido-riduzione in quanto sono in grado di ridursi e ossidarsi, quindi di acquistare e cedere due H. Inoltre sono fondamentali energeticamente poiché dopo tutto il metabolismo aerobico che la cellula fa produce una serie di coenzimi, NAD e FAD ridotti (NADH₂ e FADH₂) e questi coenzimi sono quelli che vanno sulla catena di trasporto degli elettroni nel mitocondrio e che producono l’ATP.

Polinucleotidi

I polinucleotidi sono catene lineari di monomeri di nucleotidi che si formano dalla condensazione cioè dal legame tra due o più nucleotidi. Questo legame avviene sempre tra il 5’ del gruppo fosfato e il 3’ OH di un altro nucleotide, e questo ci dà la direzionalità degli acidi nucleici, 5’→3’. Il legame che si viene a formare si chiama legame fosfodiestereo e ha una direzionalità in questo senso 5’ →3’. Il legame avviene per eliminazione di una molecola d’acqua ed è uguale sia nel DNA che nell’RNA. Il legame avviene tramite due passaggi: la scissione del pirofosfato e quello che si viene a formare è una condensazione fra questi due componenti con eliminazione di una molecola d’acqua e formazione di un legame fosfodiesterico tra l’O e il P.

Proprietà dei polinucleotidi

I polinucleotidi hanno la proprietà di avere da un lato estremità acide dovute ai gruppi fosfato e all’interno le basi azotate. La presenza contemporaneamente di queste componenti conferisce ai polinucleotidi la proprietà di essere metastabili. Questo significa che i polinucleotidi sono più instabili dei nucleotidi e sono più suscettibili a idrolisi, quindi il processo di idrolisi in vivo è più lento mentre in vitro basta cambiare le condizioni di pH. Questa meta stabilità è dovuta sia dalla presenza di gruppi acidi e basici all’interno degli acidi nucleici. L’idrolisi può avvenire completamente, parzialmente o rompere solo il legame fosfodiesterico. Per rompere il legame fosfodiesterico utilizziamo degli enzimi che prendono il nome di nucleasi e si distinguono in due tipi: quelle che lasciano l’estremità fisiologiche cioè tagliano il legame fosfodiestereo e lasciano 3’OH e 5’ P, e quelle che non lasciano l’estremità fisiologiche e tagliano il legame fosfodiestereo in modo da lasciare 5’ OH e 3’ P. Inoltre possiamo rompere gli acidi nucleici tramite catalisi acide, cioè metterle in condizioni acide e idrolizzare i polinucleotidi. Se li mettiamo in condizioni acide blande non otteniamo nucleotidi veri e propri ma si stacca solo il gruppo fosfato, se invece mettiamo degli acidi forti si romperà anche il legame β-glicosidico e si libereranno le basi azotate. In condizioni basiche gli acidi nucleici reagiscono diversamente, nel senso che il DNA è stabile e in presenza di una base non si degrada mentre l’RNA viene degradato rompendo il legame fosfodiesterico e così si viene a formare una miscela composta dal 50% dal 2’ fosfato e l’altro 50% 3’ fosfato. Quindi ricapitolando, l’idrolisi alcalina avviene solo nell’RNA.

Struttura degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici hanno una struttura primaria che corrisponde alla sequenza delle basi. È univoca, nel senso essendoci una polarità la sequenza CTAGG è una sola ed è diversa da GGTAC in quanto non è possibile leggerla in tutte è due i sensi. Le basi azotate sono la porzione più idrofobica degli acidi nucleici e anche se hanno dei sostituenti polari il loro nucleo centrale è una base aromatica e il benzene è una molecola idrofobica. Quindi l’unico modo per stabilizzare questi vasi è quello di farle impilare le une sulle altre in modo tale che le nubi elettroniche presenti sui doppi legami interagiscano tra di loro. Questo fenomeno prende il nome di stacking, impalamento delle basi, ed è uno dei modi per stabilizzare l’energia.

Struttura secondaria del DNA

1. È organizzato ad elica
2. Una doppia elica
3. Le due catene dell’elica sono antiparallele
4. I gruppi acidi sono presenti all’esterno

Successivamente Chargaff, studiando la composizione delle basi azotate del DNA, aveva notato che in tutti gli acidi nucleici la quantità di adenina era sempre uguale alla timina e la quantità di citosina era uguale a quella di guanina. In qualsiasi DNA il contenuto di basi puriniche, cioè adenina e guanina, è sempre uguale alle basi pirimidiniche totali, citosina e timina.

La lezione scorsa eravamo arrivati alla scoperta di Watson e Crick che, mettendo insieme le informazioni precedenti, ebbero l’intuizione di capire come è organizzato il DNA ed ebbero l’intuizione di capire che le basi azotate interagiscono l’una con l’altra in maniera ben precisa, formando all’interno della doppia elica dei legami H. Questa intuizione spiegava innanzitutto i dati di Chargaff dell’equimolarità delle basi azotate e inoltre spiegava anche la presenza di una doppia elica antiparallela con i gruppi fosfato acidi all’esterno che erano appunto i dati che emergevano dagli studi di diffrattometria a raggi X. In particolare studiando la conformazione delle basi azotate, Watson e Crick arrivarono a capire che i legami a H si formavano solamente tra Adenina-Timina e tra Guanina-Citosina, in particolare tra A-T si formavano due legami a H mentre tra G-C se ne formavano tre  questo era possibile perché i due filamenti di DNA che formavano la doppia elica erano antiparalleli, infatti l’essere parallelo permetteva la formazione di questi legami a H. Un legame H avviene sempre tra un H legato ad un atomo elettronegativo ed un atomo elettronegativo che funge da accettore di legame H mentre l’altro atomo funge da donatore di legame H.

Watson e Crick proposero che c’erano solo questi tipi di legame, nel senso che soltanto la timina poteva agire con l’adenina e la citosina con la guanina. Successivamente è stato visto che in realtà si possono formare dei legami ad H non canonici, quindi interazioni non canoniche; in ogni caso quelli che si formano sempre, che stabilizzano e tengono insieme i due filamenti di DNA sono quelli tra A-T e G-C. I legami H sono interazioni deboli e non legami forti però se immaginiamo una serie di legami H uno sopra l’altro formano delle interazioni molto forti, quindi separare poi la doppia elica non è facilissimo perché comunque bisogna rompere una serie di legami. Guardando le strutture, in teoria, si potrebbero formare anche degli altri legami ma un altro parametro da tener in considerazione è la distanza: affinché si formi un legame non solo serve un donatore ed un accettore di legame a H ma deve esserci anche una distanza che sia compatibile con la formazione del legame e che quindi non superi mai i 3 angstrom.

Questi legami sono perpendicolari all’asse della doppia elica, quindi la struttura secondaria proposta da Watson e Crick prevedeva questi due filamenti: l’uno avvolto sull’altro in maniera antiparallela (I filamenti di DNA hanno un orientamento  questo significa che se un filamento sarà 5’-3’, l’altro sarà 3’-5’; quindi i filamenti dovranno essere avvolti in maniera antiparallela per forza perché altrimenti le basi sarebbero orientate tutte nella stessa direzione e quindi non si potrebbe formar alcun legame H). La doppia elica proposta da W. e C. era destrorsa con due catene antiparallele, le basi allineate una sull’altra interagendo tra loro non solo con legami H ma anche con forze idrofobiche.

Parametri strutturali del modello di Watson e Crick

Quali sono i parametri strutturali (cose più importanti) di questo modello proposto da W. e C.? Innanzitutto l’organizzazione a doppia elica antiparallela portava alla formazione di due solchi, cioè due anse che prendono il nome di solco minore e solco maggiore: questi solchi sono fondamentali, soprattutto il solco maggiore, poiché sono i punti in cui il DNA interagisce con le proteine  quando le proteine devono legarsi al DNA si inseriscono proprio in questi solchi, soprattutto nel solco maggiore; questi solchi sono delle anse fatte per apposta per alcuni motivi strutturali proteici (esempio: motivo elica-loop-elica) che si ripetono nelle proteine che permettono l’inserimento della proteina a cavallo del solco maggiore o in alcuni casi del solco minore.

I parametri più importanti sono:

1. L’elica è destrorsa.
2. Le catene sono antiparallele.
3. La molecola è organizzata in modo tale da avere tutte le parti più idrofobiche all’interno, in modo tale che possano interagire, mentre i gruppi polari, cioè i gruppi fosfato, sono rivolti tutti all’esterno in modo tale che la molecola possa interagire con la soluzione acquosa in cui si trova che ovviamente è idrofilica.
4. La distanza tra le coppie di basi era sempre 0,34 nm.

La distanza che in entrambi i casi coprono le basi azotate quando si legano fra di loro è sempre 11 angstrom  quindi sia il legame A-T che quello G-C formano sempre una distanza di 11 Å e questo è importante perché ci assicura la stabilità della struttura dell’elica.