Biochimica Applicata - parte 2

Tecniche che ci permettono di sintetizzare le proteine:

Amminoacido

Ha un C alfa, centrale che può sempre fare 4 legami, questo carbonio è sempre legato con NH4+,H e COO-,

e inoltre troviamo catena laterale (R) che ha il compito di dare specificità.

Ci sono 2 forme specifiche e possono essere: ionica o non ionica, dove la ionizzazione dei 2 gruppi

Ø è a pH diverso, il gruppo amminico (gruppo basico) può essere protonato o indissociato; viceversa

il gruppo carbossilico (gruppo acido) può perdere l’H generando la forma dissociata o essere

indissociato.

- Tab 3.1 tutti gli AA elencati.

I 20 AA vengono generalmente elencati in base al gruppo R e si dividono in:

1. Polari, che reagiscono con l’H2O

2. Non polari che sono idrofobici

3. Aromatici, dove il gruppo R è generalmente un anello

4. Aminoacidi carichi negativamente

5. Aminoacidi carichi positivamente

IMPORTANTE: Se parliamo di una proteina carica o non carica questo dipenderà solamente dal fatto che al

NETTO essa avrà una carica che dipende dagli AA che la formano. Quindi è molto importante conoscere da

cosa arriva la carica.

LEGAME PEPTIDICO: è un legame covalente che va a formarsi tra un gruppo carbossilico e un

Ø gruppo amminico di 2 AA vicini, questo legame è un legame molto forte.

Nella formazione di questo legame tra i 2 gruppi, viene rilasciata una molecola di H2O, siamo

quindi sempre pronti ad avere un polimero di AA, mai singoli AA.

Un peptide è formato da 4 AA, gli oligopeptidi sono quei peptidi che hanno fino a 100 AA, mentre se

andiamo oltre i 100 prende il nome di proteina.

PROTEINA: formata da oltre 100 AA e questa non ha una struttura lineare; proprio da questo fatto

Ø ogni proteina ha una funzione biologica a sé. Questo viene garantito dalla struttura 3D nello spazio

della nostra proteina. Se la proteina si denatura, perde la sua funzione biologica.

IMPORTANTE: lavorare in condizioni adatte alla proteina per prevenire la denaturazione

- PURIFICAZIONE: è quel processo di estrazione di una proteina da una miscela eterogenea

contenente altre proteine. Nella miscela troveremo molte proteine inutili (per il nostro scopo) che

quindi, purificando la nostra sostanza, andremo ad eliminare per ottenere una soluzione pura della

proteina che ci interessa.

COME FUNZIONA: vado ad eliminare tutto ciò che non mi interessa step by step e, così

ü facendo, resta solo ciò che ci interessa. Prima di purificare, però, devo estrarre la proteina dalla

matrice biologica.

es. cerco un alunno specifico in un’aula, vado ad escludere piano piano le persone che non interessano alla

mia ricerca.

Step da seguire per purificare la proteina:

Ø 1. Prelevare un estratto grezzo, dal quale ottengo la matrice primaria con la proteina che mi

interessa al suo interno.

2. Precipitazione frazionata, dove inizio a dare una prima sfoltita delle proteine che non ci

interessano. Questa è la prima vera e propria separazione, definita grossolana.

3. Cromatografia a scambio ionico

4. Gel filtrazione

5. Cromatografia di affinità.

COSA MI INTERESSA: stiamo cercando certe proprietà di una proteina, cioè le sue caratteristiche chimico-

fisiche (es. pro con PM= 100 Dalton); e come abbiamo già detto le proteine che cerchiamo sono all’interno

di una matrice biologica.

Proteine intra-cellulari

: si tratta invece delle proteine citoplasmatiche o comunque di quelle

o proteine presenti negli organuli subcellulari. Che devono essere poi trattati gli estratti ricavati

dopo che sono avvenuti i processi di lisi delle cellule.

Proteine extra-cellulari

: sono quelle proteine che sono presenti nel plasma sanguigno.

o Alcuni semplici esempi sono l’albumina o il fibrinogeno. Quindi, per quanto riguarda le proteine

presenti nel sangue, come il plasma, bisogna eliminare i globuli rossi o i globuli bianchi ecc. e

otterremo l’estratto grezzo solo però, dopo che avremo svolto le diverse eliminazioni delle

proteine che non ci interessano.

CENTRIFUGAZIONE SU CAMPIONI BIOLOGICI: dove abbiamo la centrifuga con i porta provette, che

Ø gira ad una velocità specifica, la quale genera una forza centrifuga e fa in modo che precipitino le

cose pesanti sul fondo.

Il precipitato è il pellet, la parte in sospensione prende il nome di surnatante.

FILTRAZIONE: qui, invece abbiamo degli imbuti, sopra il quale appoggiamo un filtro che riesce a

Ø separare la parte liquida, facendola passare, da quella solida trattenendola sul filtro.

Se ho una proteina extra-cellulare vado a separare direttamente l’estratto grezzo con la

ü matrice e le proteine.

Se, invece, ho una proteina intra-cellulare, devo prima andare a rompere la cellula dalla quale

ü poi andrò a prelevare e trattare opportunamente l’estratto grezzo.

Tecniche di lisi delle cellule:

Inizialmente bisogna fare una divisione generale delle tecniche di lisi, le quali possono essere:

1. Non meccanici, non uso uno strumento per fare avvenire la lisi cellulare.

2. Meccanici, necessito l’utilizzo di specifiche strumentazioni per la rottura della cellula.

Ogni metodo deve mantenere inalterata la funzione e la struttura della proteina, sennò andremmo a

perdere anche la sua attività biologica.

IMPORTANTE: È necessario mantenere intatta l’attivitá biologica delle proteine, perché altrimenti

andremmo a perdere la funzione principale della nostra proteina e di conseguenza non avrebbe senso

continuare il nostro processo.

Le tecniche di lisi cellulare non meccaniche si dividono in:

Ø Lavaggio con saponi

1. che tendono a lisare la cellula, facendo si che essa rilasci il contenuto

plasmatico. Questa tecnica è usata principalmente per le cellule eucariotiche (no batteriche e no

vegetali)

Digestione enzimatica

2. , andiamo a trattare la proteina con un enzima digestivo in modo che poi

questa vada a rompersi e rilasciare il contenuto.

Le tecniche meccaniche si dividono, invece, in:

Ø Omogenizzatori differenti, che non sono usati per la lisi delle cellule, ma per i tessuti.

Con il pestello andremo a rompere il tessuto e poi preleveremo il contenuto che ci interessa.

1. Omogenizzatore a lama, dove andremo a mettere gli organi in dei frullatori che presentano

la parete fredda per far si che non si surriscaldi il tutto. Questo è dovuto dal fatto che le

pale ruotano in modo così veloce da andare a generare calore il quale potrebbe causare la

denaturazione della nostra proteina. T< 20°, viene mantenuta l’integrità.

2. Omogenizzatore a pestello, che va a creare una forza di attrito tra vetro e parete del

pestello andando a disgregare le cellule. Può essere sia manuale che motorizzato. Viene

molto usato per le cellule eucariotiche ed è poco intrusivo.

3. French press, o estrusione liquida; qui il materiale viene immesso in una camera fredda,

dove troviamo uno stantuffo che andrà a premere le cellule con elevate pressioni e questo

causerà la loro distruzione. Esiste un’unica valvola di sfogo, a farfalla, dove attraverso

questo capillare fuoriesce la sospensione lisata di cellule; ma con un valore di pressione

molto minore. Eccessiva su sospensione di cellule eucariote, viene usato per le cellule

batteriche.

4. Sferette di vetro, questo non è un metodo aggressivo. Infatti qui le cellule non verranno

mai rotte ed è una tecnica molto usata per le cellule eucariotiche umane. Si va a introdurre

la soluzione di cellule in sospensione con le sferette di vetro e poi verrà vorticata. Questo

farà si che si vada a formare una sospensione che verrà rotta da sferette per via del vortice.

5. Sonicatori, sono delle sonde di metallo, che producono delle onde ultrasoniche le quali

andranno a sbattere contro la membrana della cellula e andranno a romperla. Non è un

processo necessario per le cellule animali, viene invece molto usato soprattutto per le

cellule batteriche.

PROBLEMA: se andiamo a riscaldare la sospensione dove la sonda è immersa, questo fa si

che la proteina tenda a denaturare.

RISOLUZIONE: 1. usare dei contenitori raffreddati (sonda in bagno di ghiaccio),

2. Prevenire il problema facendo funzionare la sonda con cicli di on/off di durata non molto

lunga 3. Problema per chi lavora per via degli ultrasuoni generati, risolvibile usando delle

cuffie per prevenire i problemi all’udito.

Riassumendo, quindi, possiamo usufruire di tecniche non meccaniche o meccaniche, oppure di

enzimi digestivi.

ENZIMA DIGESTIVO: secondo questa tecnica la proteina viene trattata con un lisozima. Visto che la

Ø parete cellulare è formata da peptidoglicano, la sospensione con lisozima è in grado di andare a

rimuovere il peptidoglicano; così facendo diventa una semplice cellula. Poi, potremo usare le

tecniche di lisi cellulare.

1. Pectinasi e cellulasi, vengono usate se si tratta una cellula vegetale;

2. Lisozima, se invece si sta trattando delle cellule batteriche.

TUTTO QUESTO VIENE SVOLTO, PER OTTENERE L’ESTRATTO GREZZO; DOPO QUESTO DOVREMO

ü ANDARE AD ELIMINARE TUTTO CIÒ CHE È PESANTE E NON NECESSARIO.

Elimino mediante centrifugazione con separazione del pellet dal surnatante; andremo a lavorare solo

con quest’ultimo.

PRE-LISI bisogna utilizzare dei tamponi fisiologici, con i quali si ottengono delle soluzioni di sale. In

Ø questi tamponi bisogna mettere la nostra soluzione cellulare.

I tamponi specifici, vengono utilizzati con soluzioni a pH stabilito tra 6-7.5 e soluzioni saline

specifiche tra 150-200mM.

Il pH deve essere mantenuto costante perché questo influenza la carica delle proteine, se ho un pH

vicino a quello fisiologico intracellulare, riusciremo a mantenere la carica e questo andrà a

influenzare la nostra proteina.

RIASSUNTO: ottengo estratto grezzo, che è stabile per via delle concentrazioni di sale e il pH specifico a

cui ho lavorato; sono riuscito a prevenire i problemi di surriscaldamento e solo a questo punto posso

iniziare la scremazione di tutto, andando a purificare la miscela eterogenea e ricavare ciò che ci

interessa.

• Precipitazione frazionata o purificazione primaria; noi dobbiamo rendere insolubile alcune

molecole (FRAZIONATA= non elimino tutto, ma solo ciò che non ci interessa) questo processo è

selettivo, perché andiamo a variare la solubilità di alcune proteine e altre invece no.

Tutto, però, invece dipende dalle proprietà chimico-fisiche della proteina che ci interessa, se essa sta

ad un valore di P.I., significa che è al netto è stabile, e quindi, non ha carica. Perciò, perde la sua

solubilità, precipitando.

Esistono proteine con P.I. pari a 8 o altre pari a 6.

Ø In base a che pH ci troviamo riusciamo a far variare la solubilità della nostra proteina. Sapendo

come è strutturata la proteina che ci interessa, andremo invece a lavorare sulla concentrazione dei

sali, sul pH e P.I. , temperatura e polarità del solvente. Lavorando su questi aspetti sono in grado di

far precipitare la proteina eliminando ciò che non ci interessa e, infine, andremo a trattare il tutto

centrifugando e andremo a scremare il tutto fino a ottenere ciò che ci interessa.

Precipitare, significa andare a staccare|separare qualcosa che non ci serve.

Ø Il precipitato è il pellet, mentre ciò che rimane sospeso in alto, prende il nome di surnatante.

Esistono precipitazioni reversibili o irreversibili, ed è importante conoscere le varie tecniche.

Ø Distinguere una tecnica reversibile, da una non, è importante per andare a salvaguardare il proprio

lavoro in caso di errore. Se la proteina che ci interessa è precipitata ed è finita nel pellet, invece che

rimanere in superficie, se avessimo utilizzato una tecnica reversibile, saremmo stati in grado di

recuperare il tutto, facendo ri-naturare la proteina e riutilizzandola.

SAREMMO, QUINDI, RIUSCITI A SALVARCI, NEL CASO AVESSIMO SBAGLIATO A SEPARARE LA NOSTRA

PROTEINA CHE ERA FINITA NEL PELLET.

1. Precipitazione con sale

Il SALE può interagire con la proteina mediante le cariche formando un guscio di solvatazione.

Senza sale se avessi 2 molecole con cariche opposte andrebbero a formare un legame e di

conseguenza precipiterebbero.

Grazie al sale, invece, noi siamo in grado di mascherare le cariche e, così facendo, diventano

imprecipitabili e influenzano la stabilità della proteina.

Se ho 150-200 mM di sale, vanno ad influenzare in modo positivo la mia proteina.

Ø

Influenza positiva

• , prende il nome di Salting In. Abbiamo sull’asse y la solubilità e sull’asse x la

concentrazione del sale. La curva di gauss mostra come il sale è in grado di mascherare le proteine

e non farle legare tra loro.

Ma da cosa dipende l’influenza?

Ø

La precipitazione della proteina che stiamo trattando, dipende semplicemente dall’influenza che ha

il sale su essa. Quindi, ogni proteina è diversa dalle altre e questo dipende dalle loro proprietà

chimico-fisica, grazie a questa caratteristica, però, riusciremo a capire quando avvengono i due

diversi processi di precipitazione.

Influenza negativa

• , prende il nome di Salting out; qui trattiamo la proteina con una elevata

concentrazione di sale, che fa si che la solubilità della proteina diminuisca.

in questo processo, giocano un ruolo fondamentale gli AA idrofobici della proteina che stiamo

trattando.

Gli AA idrofobici si possono trovare:

Ø Nel core della proteina

; in questo caso anche se la nostra proteina entra in contatto con

ü l’H2O non succede nulla, in quanto questi AA sono situati in una posizione molto distante e

non ha effetti su di loro

In superficie

; in questo caso, invece, questi AA cercheranno di sfuggire dall’H2O, facendo

ü in modo che non si creino legami.

esistono zone idrofobiche

Quindi che sono instabili e termodinamicamente svantaggiate.

Le molecole di H2O vanno a porsi attorno ai domini idrofobici creando strutture che prendono il nome di

clatrati; i quali hanno il compito di non far avvenire nessun contatto tra la proteina e il solvente.

Andando ad aumentare la concentrazione del sale, per far si che la proteina precipiti completamente, c’è

bisogno di più molecole d’acqua; quindi se ho abbastanza molecole di H2O questa precipita, altrimenti no e

quindi il processo di precipitazione andrà ad interrompersi.

Può succedere, però, che ad un certo punto le molecole di acqua finiscono e, entrino in gioco queste zone

di acqua attaccate ai clatrati.

eccesso di sale

Se l’ , andasse a strappare queste molecole dalle proteine, continuando il suo

ü processo di scioglimento, allora questo non s’interromperà fino a quando queste molecole sono

finite.

Non dimentichiamoci però che staccando queste zone, andremo a scoprire le zone idrofobiche della

proteina, più ci sono zone di questo tipo aperte, e più andranno a legarsi tra loro formando un altro

precipitato.

La tecnica della precipitazione del sale è una tecnica reversibile. Ed è importante, comprendere come

l’influenza positiva arrivi fino a un determinato livello x della concentrazione salina, e oltre un certo punto,

l’influenza diventi negativa, andando a causare la precipitazione del sale.

Ogni sale ha una quantità fisiologica di concentrazione che fa si che crei aggregati insolubili.

Il sale che viene più utilizzato in laboratorio, per questo tipo di processo, è l’ammonio solfato; perché ha un

costo basso ed è inoltre molto solubile e in grado di favorire questo tipo di tecnica.

Processo usato per l’eliminazione del sale

• : questo processo prende il nome di dialisi e,

solitamente, avviene tra 2 comparti diversi per via della pressione osmotica.

La pressione osmotica, è quel valore di pressione che permette, in genere a una soluzione, di venir

trasportata da una zona ad un’altra per via del differenziale di pressione che si è creato. (Es. da

interno a esterno della cellula)

In questo processo viene inserito all’interno di un tubo, chiuso ad un’estremità, la nostra soluzione

di proteine che vogliamo trattare e, successivamente, e lo chiudiamo anche dall’altra estremità.

Riponiamo il tubo in un contenitore, il quale è stato riempito di tampone privo di sale, e ora tutto il

lavoro lo svolgerà la Pressione osmotica, facendo si che il sale esca dai pori del tubo e vada

all’esterno.

Grazie a questo processo, la proteina precitata riesce a tornare in soluzione e può essere

Ø riutilizzata.

2. Variabilità del pH di estratto grezzo :

Questa tecnica viene usata, in genere, molto meno della precedente.

Prende il nome di precipitazione al P.I. qui, le proteine, hanno una carica specifica e di conseguenza, hanno

anche un valore del punto isoelettrico; che è quel valore di pH, al quale, al netto le proteine trattate sono

neutre. proteina non ha una carica

• Se la , come abbiamo già detto, non rimane in soluzione.

Conoscendo il P.I. della proteina

• , siamo in grado di portare la soluzione ad un pH tale che sia

in grado di portare alla precipitazione la proteina che stiamo studiando.

valori inferiori al P.I.

• Lavorando, invece, a riusciremo a mantenere in soluzione ciò che ci

interessa.

Quindi, è fondamentale conoscere le proprietà chimico-fisiche della proteina che ci interessa e anche

questo processo è un processo di precipitazione reversibile.

3. Variabilità di temperature (scaldando)

Un esempio di questo tipo di tecnica viene rappresentato dall’albumina dell’uovo. L’albumina è una

proteina che quando viene scaldata non torna indietro e quindi è facile comprendere che processi di

questo tipo sono processi irreversibili.

Ovviamente, come abbiamo già detto, se scaldando andiamo a sviluppare un processo irreversibile r