Biochimica Applicata - parte 2

SPETTROFOTOMETRIA PER ANALISI QUANTITATIVA

Per la determinazione delle analisi quantitative bisogna conoscere qual è la lunghezza d'onda massima a cui assorbe la sostanza che vorremmo trattare. Per esempio, tutte le proteine non assorbono nell'area del visibile, ma in quella del violetto; assorbono quindi a 280 nm. Essenzialmente sono gli AA aromatici che rientrano in questa categoria. Tutti gli altri AA, invece, non assorbono a nessuna lunghezza d'onda.

Se ho un AA aromatico, quindi, posso fare un'analisi quantitativa, sennò se la nostra proteina è priva degli AA aromatici, allora non è possibile sottoporla ad un'analisi quantitativa in quella forma.

In genere, per svolgere un'analisi quantitativa di tutte le proteine viene utilizzato un agente specifico che fa colorare la proteina che abbiamo preso in esame; per far si che riesca ad assorbire in una lunghezza d'onda specifica, indipendentemente dalla

proteinache stiamo trattando. Un es. di colorante è il bioreto.

RELAZIONE TRA CONCENTRAZIONE E ASSORBIMENTO: viene utilizzata una cella portacampione, dove viene riposta la sostanza da analizzare, che poi verrà colpita dalla radiazione monocromatica con intensità pari a I. Se il campione è in grado di assorbire la radiazione a tale lunghezza d'onda, allora, la radiazione esce con intensità minore rispetto a quella entrante (I). Quindi in genere, I<I, mentre L è lo spessore della cella ed è sempre pari a 1 cm. T= I/I

TRASMITTANZA: È il rapporto tra la luce uscente e quella entrante; cioè. Questa Ø grandezza esprime quale frazione della luce incidente ha attraversato il campione senza essere assorbita. Se T=1 allora non c'è stato nessun assorbimento da parte della nostra sostanza e quindi la trasmittanza è totale. Se invece T è minore di 1, allora la radiazione è stata assorbita.

dal campione.0<T<1; eIn generale, chiaramente non potremo mai trovare campioni che hanno trasmittanzapari a 0 o 1, in quanto non esistono sostanze che sono in grado di Assorbire tutta la radiazionea cui è sottoposta, né viceversa.

TRASMITTANZA PERCENTUALE TGeneralmente, quindi si parla di ( ) dove si va a%moltiplicare la T trovata x 100, in questo modo i risultati trovati avranno dei valori più facili daconfrontare.

ASSORBANZA: È quella grandezza che viene definita per conoscere quanta luce il campione èØ riuscito ad assorbire;Per il calcolo dell’Assorbanza (A) bisogna calcolare il log 1/T.Con questo calcolo riuscirò a scoprire quanta Energia della radiazione è stata effettivamenteassorbita dal campione. Per fare più chiarezza sul trattamento dei dati va aggiunto come pedicedi A la lunghezza d’onda a cui stiamo trattando il nostro campione (es. A ).280nm0<A<infinitoVisto che 0<T<1, allora ;

è di facile comprensione in quanto il log 1/1=0, mentre illog 1/0=infinito.

LEGGE DI LAMBERT-BEER : È la legge che venne inventata per riuscire a convertire il valore diØ Assorbanza (A) in un valore quantitativo.

Per il calcolo della legge di LAMBERT-BEER, bisogna moltiplicare la concentrazione del campioneeper due costanti ( e b, che sono rispettivamente il coefficiente di estinzione molare e ileA= x b x ccammino ottico della cella [sempre pari a 1 cm]).

Si può subito comprendere che l’Assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione ed èlineare; questo perché si è in grado di formare una linea retta partente dall’origine degli assi che prende ilretta di taraturanome di “ ”.retta di taratura

La è necessaria per il calcolo della concentrazione incognita di una qualsiasi sostanza

SCHEMA BASE DELLO SPETTROFOTOMETROØSORGENTE —> MONOCROMATORE —> CELLA (campione)

—> RIVELATORE —> ELABORATORE DATISORGENTI

1. Le , possono essere generalmente di 2 tipi: LAMPADA AL DEUTERIO (Analisi UV) e LAMPADE AL TUNGSTENO (Analisi VISIBILE). È facile capire che in base a qual è la zona in cui si vuole lavorare basta accendere una o l’altra lampada; a questo punto sarà il monocromatore a decidere quale radiazione dovrà passare.

MONOCROMATORE

2. Il , è un prisma che è in grado di splittare le lunghezze d’onda e far passare solo quella desiderata dall’operatore per far si che poi il campione venga analizzato a quella lunghezza d’onda.

PORTACAMPIONE

3. Il , invece, può essere in PLASTICA o in QUARZO; anche in questo caso il materiale distingue in base a quale zona andremo a trattare il nostro campione: QUARZO (Analisi UV) e PLASTICA (Analisi VISIBILE).

RIVELATORE

4. IL ; è quello strumento formato da 2 piastre metalliche poste in parallelo e ha il compito di analizzare la luce

uscente dal campione. Le piastre sono mantenute a lunghezze d'onda differenti in modo tale che, una possa ricevere i fotoni della iniziale, mentre l'altra è quella trasmessa dal campione. Così facendo, crea un valore composto dalla differenza dei due valori e il risultato è un valore quantitativo di Assorbanza che poi verrà convertito dall'ELABORATORE DEI DATI (PC).

CROMATOGRAFIA:

Anche questo processo viene utilizzato per la purificazione delle proteine. È una tecnica molto utilizzata nei laboratori di biochimica, o di chimica, ed è importante dire che esistono diversi tipi di cromatografie, noi andremo a valutare il processo generale.

La cromatografia è un processo che permette la separazione dei componenti di una miscela proteica tra 2 fasi immiscibili tra loro. Nel sistema è presente una fase, sempre immiscibile e le sostanze vengono purificate ripartendo all'interno di una delle due fasi.

La ripartizione dipende dall'affinità che la proteina ha rispetto all'altra fase. Quindi, all'inizio abbiamo una miscela, alla fine del processo vengono separate le sostanze in base all'affinità rispetto alla fase mobile, uscirà dalla colonna una proteina prima dell'altra.

1. Fase mobile e Fase stazionaria

La fase stazionaria è sempre liquida o solida; mentre la Fase mobile può essere un liquido o un gas. Le due fasi sono sempre unite tra loro, anche essendo immiscibili, e sono una in compresenza con l'altra. La sostanza che vogliamo analizzare si separa a seconda dell'affinità che ha per la fase mobile o per la fase stazionaria. Una delle due fasi si muove all'interno dell'altra, la fase stazionaria è quella ferma; mentre la fase mobile scorre in flusso continuo all'interno della colonna. La miscela di proteine, quindi, entra in contatto con le 2 fasi e viene trascinata.

Spiega la coesione costante tra fase mobile e fase stazionaria.

IDEALITÀ: La miscela soggetta a cromatografia, deve essere un po’ affine per la fase stazionaria e un po’ affine per la fase mobile.

Basi del procedimento:

Il Campione della sostanza da mettere in analisi, viene caricata in un serbatoio nell’alto della colonna; a questo punto il campione viene miscelato con l’eluente (fase mobile) e se il nostro campione contiene:

• Dovremo separare in 2 tempi diversi le diverse miscele; questo è dovuto dall’affinità delle sostanze rispetto alle fasi.

PROCESSO DI ELUIZIONE, è quel processo che permette il passaggio continuo della fase mobile nella fase stazionaria.

IMPACCAMENTO: é quel processo di stabilizzazione della fase stazionaria per far si che venga occupato il minor spazio possibile.

• Se il campione entra nella fase stazionaria attraverso la fase mobile, in questo processo il campione ha 2 opzioni:
1. Se è

più affine alla componente stazionaria, rallenta fino a fermarsi e non fuoriesce dal processo

2) Se è più affine alla fase mobile, esce più velocemente dal processo cromatografico.

IDEALITÀ: La sostanza deve essere affine un po’ alla fase stazionaria e un po’ alla fase mobile. Non esistono sostanze, o campioni, affini solo per una fase o per l’altra; in questi casi, semplicemente, non avviene una separazione cromatografica.

3. Il coefficiente di Ripartizione:Kr, è detto coefficiente di ripartizione, questo coefficiente è il rapporto tra la concentrazione che ha la sostanza rispetto alla fase stazionaria/ concentrazione della sostanza nei confronti della fase mobile. Se Kr=1; la molecola con coefficiente di ripartizione pari a 1, implica che si ha la stessa concentrazione della fase stazionaria e della fase mobile. Se Kr<1; allora la concentrazione del campione è più affine alla fase mobile, si ha un

valore del§ denominatore maggiore.Se Kr>1 allora la concentrazione del campione è più affine alla fase stazionaria, in questo caso è il§ numeratore a avere un valore maggiore.

4. Schema del processo cromatografico:

Abbiamo un campione, formato da 2 sostanze, A+B, il campione viene immesso dall’alto della colonna escende secondo la gravità.

Al t=0, abbiamo le due molecole unite tra loro e coesistono.ü Al t=1 la fase mobile inizia a trascinare verso la fase stazionaria la miscela con i 2 campioniü Al t=2 riusciamo a vedere che A è più affine di B alla fase mobile, infatti A viene portata dallaü fase mobile più velocemente

Al t=3 avviene l’eluizione della prima molecola, quindi, esce la prima molecola e genera unü segnale che viene riportato dal rivelatore sul cromatogramma.

Al t=4 avviene l’eluizione della molecola B.ü