Biochimica applicata

Biochimica applicata - 02 marzo 2021

Informazioni generali

Programma del corso

Parte I: Biochimica farmaceutica

• I farmaci: definizione dal punto di vista biochimico. La natura dei bersagli farmacologici
• Le proteine come bersaglio di farmaci: Enzimi; Recettori e vie di trasduzione del segnale; Proteine di trasporto transmembrana; Pompe e canali
• Il DNA, l'RNA e i lipidi di membrana come bersaglio di farmaci

Parte II: Metodologie biochimiche

• Tecnologie del DNA ricombinante: Proteine ricombinanti: Colture cellulari. Le proteine ricombinanti come farmaci.
• Purificazione di proteine: tecniche centrifugative e cromatografiche. Tecniche elettroforetiche. Elettroforesi bidimensionale e spettrometria di massa.
• Tecniche spettroscopiche: Spettroscopia di assorbimento, spettroscopia di emissione di fluorescenza, dicroismo circolare. Applicazioni.
• Tecniche enzimatiche: Studio allo stato stazionario: metodi continui e metodi discontinui. Saggi diretti, indiretti e accoppiati. Studi allo stato pre-stazionario.
• Tecniche immunochimiche: gli anticorpi (struttura, specificità, marcatura). Produzione di anticorpi monoclonali e policlonali. Immunodosaggi: RIA ed ELISA.
• Struttura delle proteine: Banche dati di struttura e sequenza proteiche. Cenni di bioinformatica.

Nella prima parte vedremo che i bersagli dei farmaci sono macromolecole biologiche, caratterizzate con le metodologie biochimiche, e quindi lo studio delle interazioni tra queste proteine e farmaci o potenziali farmaci è fondamentale. Tanti farmaci inoltre sono proteine, e lo saranno sempre di più; ci saranno sempre più proteine a uso farmaceutico (vedi anche vaccini Covid).

Testi consigliati e bibliografia

• Materiale fornito dal docente caricato sul sito Elly (continuamente aggiornato dal prof)
• Nelson, Cox «I principi di biochimica di Lehninger», Zanichelli
• Berg, Tymoczko: Stryer – «Biochimica», Zanichelli
• Wilson e Walker: «Biochimica e Biologia Molecolare», Nuova edizione italiana. Cortina Editore.
• Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. «Metodologie Biochimiche». Casa Editrice Ambrosiana
• Link condivisi su Elly
• Materiale supplementari forniti a richiesta - Articoli inerenti aspetti specifici del programma

Strutture e reattività chimiche da sapere

• Aminoacidi (e la rispettiva chimica per quelli trattati)
• Struttura delle proteine e nomenclatura relativa
• Nucleotidi (e derivati trattati) e struttura del DNA
• Secondi messaggeri delle vie di trasduzione del segnale
• Principali molecole segnale (amine, ormoni steroidei)
• Principali molecole utilizzate nelle metodologie biochimiche (reazioni enzimatiche riportate come esempi, reagenti più comuni, ecc)
• Sarà richiesto di saper descrivere una proteina dal punto di vista strutturale (legame peptidico, interazioni che stabilizzano le strutture secondarie, terziarie, quaternarie)
• Dovranno essere chiari i principi della catalisi, i principi del folding, i principi della regolazione allosterica degli enzimi.

Altro da sapere

• Equazioni di interesse biochimico e loro significato (rette, parabole, iperboli, equazioni esponenziali)
• Corretta rappresentazione grafica dei dati sperimentali, corretta rappresentazione grafica delle equazioni di interesse biochimico (assi cartesiani, nomi degli assi)
• Grandezze chimico-fisiche di interesse biologico, loro multipli e sottomultipli (concentrazioni, velocità enzimatiche, ecc).

Modalità d’esame: orale

Biochimica farmaceutica

Andremo a vedere le macromolecole come target di farmaci, in particolare in relazione alle vie di segnalazione. Quando parliamo di farmaci, intendiamo in biochimica il termine inglese “drug” con cui si intende una molecola che ha attività biologica: terapeutica, tossica, ricreazionale (le cosiddette “droghe” in italiano). Alcune molecole possono essere ad uso terapeutico a certe dosi, ma tossiche o usate a scopo ricreazionale a dosi diverse. A volte una molecola ha un meccanismo tossico su un certo bersaglio (virus, batterio, parassita, cellule tumorali) e questo può avere indirettamente un’applicazione terapeutica sull’uomo. L’accezione di farmaco che utilizzeremo quindi sarà molto ampia.

Un farmaco può avere dimensioni molto varie: può essere piccolo come un singolo atomo (esempio: ione litio) o grande quanto una proteina (esempio: eritropoietina, ma ci sono farmaci anche più grandi come gli anticorpi monoclonali). La maggioranza di quelli attualmente disponibili in commercio sono piccole molecole organiche di PM compreso tra 100 e 1000 Dalton (esempio: fluoxetina, che è un antidepressivo di nuova generazione). Se ci limitiamo alle small molecules, ci sono farmaci con effetti molto diversi: fluoxetina antidepressivo, tetraciclina antibiotico, aciclovir antivirale, ecc. Ma sono sempre composti organici di dimensioni confrontabili. Perché quindi queste molecole, che hanno funzioni chimiche simili e dimensioni confrontabili, hanno azione così diversa dal punto di vista biologico? La risposta sta nel fatto che queste molecole interagiscono in modo diverso con diversi target biochimici. Definiamo bersagli di farmaci quelle macromolecole che interagiscono con i farmaci e ne spiegano l’effetto biologico. Le molecole bioattive non selettive per una macromolecola sono pochissime (esempio: alcuni chelanti nel plasma per complessare il ferro, alcuni diuretici, i disinfettanti). La maggior parte dei farmaci invece agisce in modo selettivo su una macromolecola, quindi l’effetto biologico non sta tanto nella natura chimica del composto in sé, ma nel bersaglio molecolare a cui il farmaco si lega.

Quando si parla di interazioni, spesso si parla di legami non covalenti, ma non sempre: una molecola (ad esempio una small molecule) si va a legare a una macromolecola (tipicamente una proteina), forma un complesso sufficientemente forte e questa interazione, a seconda del tipo di proteina, può alterare l’azione della proteina in modi diversi. I bersagli in farmacologia si indicano anche come drug receptors o recettori farmacologici, ma in biochimica per recettore si intende una proteina con funzione recettoriale e fisiologica (esempio: recettore per adrenalina, recettore per insulina). Ci sono anche farmaci che agiscono su proteine prive di attività recettoriale in senso biochimico (esempio: enzimi e altre proteine), quindi un recettore farmacologico è un termine più ampio del significato biochimico. L’interazione farmaco-bersaglio innesca, attraverso diversi meccanismi, la catena di eventi biochimici che porta all’effetto osservato (terapeutico, tossico o ricreazionale). Dobbiamo quindi saper descrivere l’interazione farmaco-recettore ma anche saper ricostruire, dal punto di vista molecolare e biochimico, il processo che intercorre tra l’interazione farmaco-bersaglio e l’effetto biologico. La farmacologia studia gli effetti dei farmaci sull’organismo umano o animale in chiave terapeutica, classificandoli in base dell’effetto farmacologico, del tipo di patologia che consentono di trattare o dell’organo bersaglio. In biochimica invece ci occupiamo di classificare le macromolecole in termini biochimici: natura chimica, ruolo biochimico (recettori, classi di recettori, enzimi, trasportatori di membrana, canali ionici) e azione che innesca la cascata di eventi che porta all’effetto biologico.

La grandissima parte dei farmaci attuali (99%) ha come target una proteina. Ci sono però anche farmaci che interagiscono con il DNA (antitumorali), con l’RNA e con il doppio strato fosfolipidico (antibatterici e antifungini). Partiremo quindi ad analizzare le proteine come bersaglio dei farmaci. Le proteine bersaglio possono anche funzioni biologiche diverse: enzimi, recettori, trasportatori, pompe, canali di membrana, proteine con funzione strutturale.

Proteine come bersaglio di farmaci

Proteine: aspetti strutturali

Da ripassare:

• Struttura: primaria, secondaria, terziaria, quaternaria
• Definizione di subunità
• Definizione di protomeri

Proteine omologhe, ortologhe, paraloghe

Tutti gli organismi viventi hanno una comune origine filogenetica e anche le proteine sono “imparentate” fra loro. Due proteine sono omologhe quando hanno un’origine filogenetica comune, cioè derivano da un unico gene ancestrale che attraverso la duplicazione e l’accumulo di mutazioni, ha generato le proteine attuali. Queste proteine hanno mantenuto aspetti funzionali e strutturali comuni, questo spiega perché alcuni farmaci agiscano su più proteine che magari catalizzano reazioni diverse, se parliamo di enzimi. Più specificamente si definiscono ortologhe due proteine che svolgono la stessa funzione in due organismi differenti: ad esempio la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, presente nell’uomo in un unico tipo, presente nei rettili, negli elefanti, ecc. Queste proteine sono omologhe ma nello specifico sono ortologhe. All’interno di una specie può succedere che un gene si duplichi e le due proteine codificate dai geni derivanti, che cominciano a divergere per accumulo di mutazioni, iniziano ad avere funzioni diverse e si definiscono paraloghe, sono sempre omologhe ma sono all’interno della stessa specie. Esempio: esochinasi, le varie forme svolgono reazioni leggermente differenti, con substrati differenti, regolate in modo differente. La struttura primaria delle proteine dà informazioni di questa parentela: la sequenza proteica della G3PDH (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi) di vari organismi, allineata (messa una sopra all’altra), si vede che diversi residui amminoacidici sono mantenuti. Ci sono però anche dei residui diversi e quanto più lontani sono due organismi, tanto più è facile che le sequenze primarie di proteine ortologhe tendano a cambiare. Però in linea di massima si può avere un’indicazione sulla relazione evolutiva. A volte però, soprattutto sulle proteine i cui geni si sono separati molto tempo fa, la struttura primaria diventa irriconoscibile e la similarità di sequenza diventa minima per l’accumularsi di mutazioni. Esempio: globine (mioglobina, subunità dell’emoglobina, altre globine come neuroglobina e citoglobina), sono proteine imparentate ma, se si valuta la somiglianza nella sequenza amminoacidica, è sostanzialmente irrilevante, si conservano pochissimi residui (come quelli di istidina prossimale e istidina distale, critici per la funzione biologica). Come possiamo sapere se due proteine sono omologhe se hanno perso somiglianza di sequenza? Questa relazione evolutiva diventa evidente nel confronto delle strutture tridimensionali: se consideriamo tre globine come esempio, vediamo che le loro strutture spaziali sono quasi sovrapponibili, legano il gruppo eme, hanno la stessa organizzazione in termini di struttura secondaria e terziaria. Un principio generale è che le strutture terziarie si conservano evolutivamente molto meglio delle strutture primarie, perché le strutture tridimensionali sono fondamentali per la funzione e la perdita di questa struttura comporta l’impossibilità di svolgere la funzione biologica. Ci può essere il caso di proteine omologhe che non sono più riconoscibili sulla base della struttura primaria, ma sono pienamente riconoscibili dal punto di vista della struttura terziaria. La divergenza strutturale è più lenta quindi della divergenza amminoacidica.

Domini

Molte proteine, soprattutto tra quelle eucariotiche, hanno un’unica catena polipeptidica che si può ripiegare in regioni compatte, strutturalmente distinte, sempre legate ma che costituiscono unità strutturali e funzionali che prendono il nome di domini. A volte questi domini si compattano ulteriormente, quindi può risultare complesso capire se una proteina formi dei domini o meno. I domini osservati nelle proteine sono relativamente pochi in natura e circa il 90% dei domini ha meno di 200 residui aminoacidici. Non si può concludere automaticamente che tutti i domini tra loro siano omologhi, perché è normale che si sia persa la somiglianza in termini di sequenza amminoacidica, ma c’è questa idea che le proteine ancestrali fossero molto poche e corrispondessero ai domini riconosciuti nelle proteine che si incontrano oggigiorno. Poi i geni che codificavano per queste proteine ancestrali si sono combinati durante l’evoluzione producendo delle proteine di fusione, in cui questi domini compaiono in varie combinazioni, per cui si parla di domain shuffling (mescolamento di domini). Quindi tante proteine attuali possono essere descritte in termini di combinazione di questi domini, che presumibilmente derivano da proteine ancestrali piccole combinate a livello di geni codificanti. Vedremo molte proteine multidominio, in particolare per quanto riguarda le proteine coinvolte nelle vie di biosegnalazione. Esempio: il dominio SH2 riconosce residui fosforilati di tirosina, quindi tutte le proteine che hanno questo dominio possono interagire con particolari recettori che vedremo.

Ogni dominio può avere una sua funzione, quindi molto spesso la varietà funzionale delle proteine può essere vista in termini di combinazione dei domini che le costituiscono. Ci sono domini molto frequenti, altri meno, alcuni che prevalgono negli eucarioti e altri nei procarioti. Esempi:

• Dominio delle immunoglobuline, assente nei procarioti e nei più semplici eucarioti (lieviti), mentre sono molto presenti nei mammiferi
• Dominio delle proteine chinasi, presente in tutti gli eucarioti

N.B. Non confondere il termine dominio con il termine subunità.

Modificazioni post-traduzionali

È importante sapere quali proteine hanno quali modificazioni, perché spesso una modificazione cambia la localizzazione cellulare e la funzione della proteine. Nel nostro genoma sono codificate circa 20.000 proteine, questo si conosce già dai primi anni Duemila, quando è stato concluso il progetto Genoma Umano. Si conoscono le stesse informazioni anche in tantissimi altri organismi oltre all’uomo. C’è una prima sorgente di variabilità dovuta allo splicing alternativo: alcune proteine si possono presentare in più forme (troncate, con funzioni in più, ecc) ma non lo vediamo nel dettaglio. Un ulteriore elemento di amplificazione che porta a un numero di proteine nell’organismo diversi ordini di grandezza più alto delle proteine semplicemente codificate dal genoma sta nella modificazione post-traduzionale. Il numero reale di proteine non è precisamente definito, perché ci sono approcci proteomici che consentono di vedere quali e quante proteine subiscono modificazioni, ma è molto difficile perché le proteine sono tantissime e alcune modificazioni avvengono solo in condizioni fisiologiche oppure patologiche. Quindi il proteoma, cioè l’insieme delle proteine contenute in un organismo o in una cellula, è molto più elevato di quello che si potrebbe prevedere solo dall’analisi del genoma e questa varietà è causata dalle modificazioni post-traduzionali.

Queste variazioni possono avvenire dopo o contemporaneamente alla biosintesi proteica e tipicamente avvengono per via enzimatica: ci sono enzimi che hanno come substrato delle proteine, sulle quali vengono indotte modificazioni di solito covalenti. Alcune di queste sono reversibili (esempio: fosforilazione, vista nella regolazione del metabolismo) mentre altre sono irreversibili e attribuiscono alla proteina proprietà fisiche particolari. Abbiamo già visto ad esempio i ponti disolfuro, ma qui ci soffermiamo sul legame a lipidi. La fosforilazione avviene su gruppi ossidrilici della serina, della treonina o della tirosina e la localizzazione non è casuale e ha una precisa funzione. Ci sono poi modificazioni responsabili della strutturazione delle proteine, ad esempio il collagene e la formazione di residui di idrossiprolina. Ci sono anche tante modificazioni di glicosilazione (soprattutto a livello extracellulare).

Qui ci concentreremo sulle addizioni di gruppi laterali lipidici, che caratterizzano molte proteine di membrana. Questa modificazione prende il nome di liposilazione e consiste nel legame covalente delle proteine con gruppi idrofobici, che possono essere diversi chimicamente: gruppi farnesile (biosintesi del colesterolo), gruppi miristoile (acido miristoico), gruppo palmitoile (acido palmitico). Il miristato si lega tipicamente ai gruppi ammino-terminali delle proteine, tipicamente di glicina. La farnesilazione avviene invece con un legame tioetere con una catena laterale di una cisteina carbossiterminale. La palmitoilazione avviene sempre con un legame con una catena laterale di cisteina ma con legame tioestere. Questa modificazione post-traduzionale si presenta in molte proteine delle vie di biosegnalazione e serve a consentire l’aggancio della proteina alla membrana cellulare. Le proteine dotate di questa modificazione possono solo muoversi nell’ambito della membrana, non sono solubili nel citosol ma restano agganciate alla membrana.

Proteine di membrana

Tante proteine implicate nei processi recettoriali e tanti enzimi target di farmaci sono proteine di membrana. Distinguiamo:

• Proteine intrinseche di membrana: direttamente legate alla membrana. Tra queste ci sono le proteine transmembrana, che attraversano il doppio strato lipidico, e tutti i recettori di membrana sono proteine di questo tipo. Ci sono anche proteine intrinseche non transmembrana, di cui fanno parte ad esempio le proteine modificate con gruppi lipofili (viste prima), che sono agganciate alle membrane biologiche grazie ai gruppi lipofili ma non sono transmembrana. I gruppi lipofili possono essere anche più di uno (esempio: proteina Ras, legata con due ancore lipofile che sono un gruppo farnesile e un palmitato). Oltre che da modificazioni post-traduzionali, alcune proteine intrinseche non transmembrana possono semplicemente avere una porzione molto lipofila.
• Proteine periferiche: non interagiscono direttamente con la membrana