Biochimica applicata

MALDI+TOF

Per questo tipo di ionizzazione è necessario un laser e una matrice. La matrice in questo caso è una sostanza cristallina, una molecola organica, che deve avere una determinata caratteristica: deve essere in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica emessa dalla luce laser che utilizziamo per questo tipo di ionizzazione. Le matrici più utilizzate in ambito delle proteine sono l'ACIDO SINAFINICO e l'ACIDO ALFACIANO-IDROSSICINNAMICO, queste matrici vengono solubilizzate in una soluzione acquosa in presenza di un solvente organico e in presenza di una percentuale di acido (di solito si usa l'ACIDO TRIFLUOROACETICO). Questa soluzione di matrice viene miscelata con il campione di proteine o peptidi da analizzare e si lavora in condizioni tali per cui la matrice sia in largo eccesso rispetto ai peptidi o alle proteine in analisi. Una piccolissima quantità di questa miscela (parliamo di quantità dell'ordine

di0,5microlitri) viene deposta su una specifica piastra metallica, questa piccola goccia di matrice viene poifa-a cristallizzare, l’acqua e il solvente evaporano e si formano dei cristalli, così il nostro campione cheprima si trovava in soluzione adesso viene preparato per l’analisi in forma cristallina. Una volta o-enu7ques7 cristalli, che sono una miscela di campione, proteine e matrice, questa piastra viene inserita nellasorgente dello spe-rometro ed è pronto per essere so-oposto al processo di ionizzazione.

Quella in basso grigia è la piastra metallica, il supporto, e quello sopra è il nostro cristallo dove sonopresen7 tante molecole di matrice che è quellorappresentato in azzurro e le molecole dei nostrianali7 proteici o pep7dici. Il nostro campione vienecolpito con la luce del laser che viene assorbitadalla matrice, perché la cara-eris7cafondamentale di queste matrici è quella diassorbire la lunghezza d’onda

specifica emessa dalla laser. La matrice assorbe energia e la trasferisce all'analita che in seguito viene desorbito cioè passa dallo stato solido allo stato gassoso. Durante questo desorbimento l'analita viene anche ionizzato, è la matrice stessa che trasmette energia e che determina la protonazione dell'analita. L'importanza della matrice sta proprio nel fatto che permette che il campione venga colpito con un'energia inferiore a quella che avrebbe il laser se lo colpisse in maniera diretta, cioè la matrice trasferisce un'energia meno intensa al campione proteico e questo permette che il campione proteico non venga degradato. Una fase molto importante in questa ionizzazione è che si formano specie ioniche mono caricate, cioè per ogni peptide o proteina presente nel nostro campione si forma lo ione molecolare costituito dalla molecola a cui viene aggiunto un protone. Un altro punto importante è che si tratta di una ionizzazione a intermittenza,

un particolare range di rapporto massa/carica, possono essere misurati i rapporti di massa/carica all'interno di un determinato range e per il tempo di volo questo range è molto ampio e ci permette di analizzare specie proteiche che essendo delle macromolecole avranno dei valori di massa/carica molto alti. La sensibilità è la capacità di rilevare piccole quantità di analita e il sistema MALDI+TOF ci permette di rilevare piccolissime quantità (ordine picomoli o fentomoli). La risoluzione è la capacità di un sistema di separare degli analiti, e nel caso dello spettrometro di massa ci indica la capacità di separare ioni con valori di massa/carica diversi. La risoluzione numericamente corrisponde al rapporto tra la massa del picco e la lunghezza del picco misurata alla metà della sua altezza; più un picco è alto e stretto, maggiore sarà la sua risoluzione dell'analizzatore. Abbiamo un esempio che ci fa capire

Cos'è avere una buona risoluzione e una meno buona. A sinistra abbiamo uno spettrometro con un analizzatore a bassa risoluzione, vediamo che ci sono 2 segnali che differiscono per 1 Dalton, la risoluzione è bassa vediamo che il primo picco è più allargato e i due picchi non sono efficacemente separati. Se dovessimo analizzare le stesse specie ioniche però con un analizzatore con una risoluzione maggiore, possiamo vedere come i due picchi vengono separati e ciascuno dei due vediamo che è molto più stretto rispetto alla figura a sinistra. Si considerano strumenti ad elevata risoluzione quei strumenti che hanno una risoluzione R 5000. L'accuratezza ci indica quanto il valore di massa misurata si discosta dal valore di massa esatta. La massa teorica viene calcolata come il rapporto: e si misura in parti per milione massa teorica (ppm). L'analizzatore TOF così come l'abbiamo descritto non ha

un’elevata risoluzione, cioè un sistema di analisi che ci perme-e di avere un’elevata sensibilità ma una risoluzione rela7vamente bassa. Sono sta7 sviluppa7 strumen7 a cui sono sta7 apportan7 delle modifiche che hanno permesso di o-enere una risoluzione moltopiù alta. Sostanzialmente per migliorare la risoluzione le modifiche strumentali sono 2: una è l’estrazione ritardata e l’altra è l’inserimento di un sistema di riflessione. Per quanto riguarda l’estrazione ritardata quello che si fa è ritardare l’applicazione del campo ele-rico, del voltaggio che fa accelerare gli ioni verso il tubo di volo, ritardare rispe-o all’impulso del laser che genera la nube di ioni. Quindi quando si applica un’estrazione ritardata il laser colpisce il campione sia spe-a che si sia formata la nube di ioni e poi con un minimo ritardo si applica il campo ele-rico in questo modo è possibile far si che tuJ gli ioni che