Biochimica applicata

Biochimica Applicata

L’indagine biochimica e biomolecolare ha lo scopo di indagare la natura e le interazioni che

si stabiliscono tra le molecole biologiche in modo da comprendere i fenomeni biologici a

livello molecolare

I risultati delle indagini biochimiche e biomolecolari trovano applicazione in vari campi, dalla

diagnostica alla terapia di patologie, a vari settori dell’industria. Essi permettono per

esempio di:

• determinare struttura e funzione di proteine coinvolte in processi fisiologici e patologici

• identificare nuovi marcatori molecolari da impiegare nella diagnostica molecolare

• disegnare farmaci sempre più efficaci e specifici per il bersaglio molecolare di interesse

• comprendere la causa di malattie genetiche e metaboliche

Estrazione e Purificazione delle proteina

Purificare una proteina vuol dire estrarla dalla matrice biologica che si trova e ottenere una

preparazione in cui è presenta solo una specie proteiche che deve essere stabile e

omogenea

Perché purificare una proteina?

• Per studiare la proteina e comprenderne le funzione biologica

• Per studiare le sue interazioni con ligandi

• Per studiare proteine patologiche

• Per applicazioni biocatalitiche degli enzimi

• Per produrre proteine con attività terapeutica (insulina)

• Per progettare un farmaco efficace definire la fonte

La prima cosa da fare quando si vuole purificare una proteina è da dove

viene estratta la proteina, che nella maggiormente le proteine si trovano all’interno della

cellula, e quindi la fonte sono i tessuti o coltura di cellule

La fonte va scelta in modo che la fonte sia disponibile e che sia una fonte in cui la proteina

di interesse è presenta in una certa quantità

Se la fonte naturale è difficile da reperire o è in concetrazioni bassi, si può produrre delle

proteine ricombinate

proteine sotto forma di

Si utilizzano delle tecniche di biologia molecolare in modo tale da inserire il gene della

proteina di interesse in una cellula ospite. Questa cellula ospite deve essere in grado di

sovrascrive la proteina di interesse (si usano molto spesso colture batteriche)

quantità

Si deve anche capire la di proteina che si vuole ottenere

grado di purezza

È importante anche il

Ad esempio se si vuole capire la struttura tridimensionale della proteine bisogna avere un

elevato grado di purezza

Invece se bisogna purificare un enzima per valutare la sua attività catalizza ci si può anche

avere una purezza anche inferiore

Quindi il grado di purezza varia in base a ciò che bisogna fare

Nella maggior parte dei vasi si purica la proteina nella sua struttura nativa

Tappe per estrarre e purificare una proteina:

Questo processo di estrazione e purificazione della proteina non è facile e veloce

Infatti c’è bisogno di più passaggi:

1. La prima tappa è estrarre le proteine dalla loro matrice biologica

2. Poi si identifica un sotto insieme in cui è contenuta la proteina di interesse

3. Poi si continua a tappe

Più tappe si fa e più la proteina sarà più purifica

Per ogni proteina deve essere messo appunto uno schema di purificazione preciso

Non c’è uno schema generale, perché nelle cellule ci sono tantissime proteine eterogenee

Sono diverse per dimensione, composizione amminoacidica e sequenza, la localizzazione

cellulare (citoplasmatiche e di membrana)

• LISI CELLULARE

• SEPARAZIONE SOLIDO/LIQUIDO eliminazione di cellule, detriti e particolati: centrifugazione

• PURIFICAZIONE PRELIMINARE isolare e concentrare: precipitazione con sali, ultrafiltrazione

• PURIFICAZIONE AD ELEVATA EFFICIENZA:

• Cromatografia a bassa risoluzione

• Cromatografia ad alta risoluzione

• CONCENTRAZIONE

Procedure preliminari per la purificazione delle proteine

soluzione di estrazione,

La prima cosa da fare è quello di prepara una cioè una soluzione

dove le proteine sono trasferite dalla matrice biologica alla soluzione di estrazione

Questa soluzione deve essere preparata accuratamente perché deve accogliere le proteine

che passano in un ambiente che non è più fisiologico

Infatti il comportamento cellulare viene tutto rotto

Dopo l’estrazione dall’ambiente cellulare, le proteine diventano instabili e possono andare

incontro a:

• Denaturazione = perdita di struttura e attività

• Proteolisi = perché gli enzimi proteolitici vengono liberati dai lisosomi e sono liberi di agire

• Ossidazione temperatura

Per mantere la funzione e struttura delle proteine bisogna lavorare a

controllata, 4°C,

di circa così da diminuire il rischio la denaturazione e l’attività degli enzimi

proteolitici pH fisiologico,

Bisogna anche mantenere il perché a pH acido le

proteine potrebbero denaturarsi sistemi tampone

Per mantenere il pH si sfruttano i

Però il potere tampone è funzionante solo in un certo range di pH

Inoltre il potere tamponante è maggiore quanto più il valore di pH è

vicino a quello di pKa

Le proteine sono funzionanti a pH neutro

tampone fosfato, tampone acido

I sistemi tamponi utilizzati sono il

carbonico e bicarbonato tampone di proteine e proteinati

e

Quando si lavora in laboratorio si devono utilizzare dei sistemi tamponi

che hanno un potere tamponante attorno a 7 pH

tampone TRIS

Si utilizza il quando non si può utilizzare il tampone fosfato

forza ionica

Bisogna anche tenere conto della della soluzione ionica in cui si lavora

Quindi si utilizzano delle soluzione tampone saline, con una forma ionica che va dagli 0,05

ai 0,01 molare

La forza ionica viene mantenuta con l’aggiunta di NaCl

Tuttò ciò viene fatta per mantenere le proteine in soluzione

Può essere aggiungo anche il saccarosio è utile per mantenere una osmolarità fisiologica

(che serve per mantere integri gli organelli cellulari) e mantiene solubile le proteine che

sono abbastanza idrofobiche e quindi in ambiente acquoso sono difficile da mantenere in

soluzione inibitori di proteasi

Ci devono essere anche

In ogni soluzione si aggiunge un cocktail di inibitori, perchè ogni inibitore di proteasi

riesce a inibire una specifica classe, quindi ce ne servono di vari tipi nella solzione

EDTA EGTA

e = sono inibitori che sono degli agenti chelanti, quindi sequestrano gli ioni

bivalenti che possono andare a legarsi ai tioli liberi delle proteine e provocare una alterazione

agenti riducenti

Si utilizzano

Perché le proteine possono andare incontro a ossidazione quando si spostano del ambiente

cellulare alla soluzione di estrazione

Perché si possono formare dei ponti di solfuro tra le cistene

libere, e questa formazione può essere negativa nello scopo

di purificare una proteina

Quindi si aggiungono dei riducenti tiolici (SH libero) per

evitare la formazione di ponti di solfuro indesiderati

detergenti

Si utilizzano i

I detergenti sono molecole che hanno una testa polare e una coda idrofobica, sono

molecole anfipatiche, cioè hanno una parte idrofila e una idrofoba

Hanno la funzione di evitare l’aggregazione delle proteine, perché può succede che le proteine

espongono delle zone apolari. Queste zone apolari poi possono interagire tra di loro e questo

porta a formare degli aggregati, che tengono a non stare più in soluzione

Per l’estrazione di proteine si utilizzano i detergenti non ionici e zwitterionici. I detergenti

ionici possono portare alla denaturazione delle proteine, quindi è meglio non usarli

LISI CELLULARE

Visto che le proteine da purificare si trovano all’interno della cellula, bisogna andare a

rompere le membrane cellulari così che il contenuto cellulare sia riversato nella soluzione

di estrazione

Prima bisogna capire da che cellula bisogna estrarre la proteina, perché ci sono cellule che

oltre la membrana cellulare si ha anche la parete, come le cellule vegetali

Quindi il metodo di lisi cambia in base al tipo di cellula

Ci sono due metodi di lisi: meccaniche e non meccanica

Lisi meccaniche

forze di taglio

Si utilizzano

Si utilizzano omogeneizzatori a

mescolamento che riescono a

rompere le cellule (funzionano

come dei frullatori) forze di attrito

Si utilizzano anche omogenizzatori che utilizzano le

(funzionano tramite dei pestelli che è poco più piccolo del tubo)

Questi due omogenizzatori sono utili per le cellule dei tessuti

forte pressione

Invece per i microrganismi si utilizzano delle che

fanno scoppiare la cellula ultrasuoni,

Si utilizza ultrasonicazione che utilizza gli e che va bene per qualsiasi cellula

C’è una sonda che produce degli ultrasuoni, e questa sonda viene inserita nella soluzione,

e quando gli ultrasuoni si propagano nella soluzione questo provoca delle bolle di vuoto

che tendono a implodere, e questo crea degli sbalzi di pressione che fanno scoppia la

cellula si sviluppa calore

Lo svantaggio di tutti questi metodi è che

Lisi non meccaniche

Sono metodi più blandi

schock osmotico

Si utilizza lo che è efficace solo con le cellule animali, quindi quelle

prove di pareti

Le cellule sono messe prima in una soluzione ipertonica e poi si mettono in soluzione

ipotonico dove tendono ad internalizare l’acqua. Questo fa aumentare il volume della

cellula così tanto che fa scoppiare la cellula

cicli di congelamento e scongelamento

Un altro metodo è quello di fare abbastanza

rapidi così da formare degli strati di ghiaccio nella membrana che portano ad alterarla

enzimi litici

Si utilizza l’azione di che sono in grado di degradare le membrane cellulari

lisozima,

Uno degli enzimi più utilizzati è il perché riesce a idrolizzare la parete cellulare

batterica (che è costituita da peptoglicano), quindi è utilizzato molto nei batteri

grezzo o omogenato

Quello che si ottiene dalla lisi è l’estratto

SEPARAZIONE SOLIDO/LIQUIDO

Dalla lisi si ottiene l’estratto grezzo o omogenato tutto

Questo estratto grezzo è un brodo eterogeneo che contiene il contenuto cellulare e

porzioni del tessuto delle cellule che non sono stati completamente solubilizzate

Quindi il primo passaggio è separate ciò che è solubile e insolubile

Poi bisogna capire quale proteina bisogna analizzare perché poi cambia il processo da

eseguire

Tecniche di centrifugazione centrifigurazione

Ora bisogna fare delle tecnica di per separe la frazione solubile dalla

frazione insolubile

Molto spesso le proteine che si trovano nella frazione insolubili sono quelle da scartare, ma

in alcuni casi (con proteine ricombinanti) si possono formare degli aggregati di proteina

molto grandi che difficilmente stanno in soluzione, e sono chiamate corpi di inclusione,

però contengono la proteina di interesse (ma può essere una cosa positiva)

Le tecniche di centrifugazione sono tecniche separative che permettono di separe

dimensione densità

particelle in un liquido in base a differenze di e di

Si separano facendo ruotare il campione a velocità molto elevate così da essere

forza centrifuga

sottoposti a una

La centrifugazione sfrutta il fenomeno della sedimentazione che avviene grazie solo alla spinta

della gravità, ma la centrifigurazione accelera questo fenomeno di sedimentazione perché si

avrà una forza maggiore alla forza di gravità (quindi velocizza il processo di sedimentazione)

precipitato

Dopo questo processi si forma sul fondo il sopranatante

Invece la porzione che rimane solubile si chiama

Per separe queste due parti si può usare una pipetta per aspirare il sopranatante

Com’è fatta la centrifuga: rotore

C’è un motore che fa ruotare il

Il rotore ha degli alloggiamenti che servono per contenere il campione biologico

Il rotore ruota ad una velocità impostata imprimendo ai campioni una accelerazione centrifuga

che viene mantenuta per un tempo variabile

Quali sono le forze che entrano in gioco durante una certificazione e qual è la velocità:

forza centrifuga

Si ha la che fa si che le particelle si muovono verso il fondo del contenitore

Però ci sono due forze opposte alla forza centrifuga:

forza idrostatica

• = perché il contenuto per andare in fondo deve spostare le particelle

del liquido

forza frizionale

• = è opposta al movimento della particella verso il fondo

campo centrifuga G

Il è dato:

La velocità di rotazione non è espressa come velocità angolare, ma

RPM = rivoluzioni per minuto

si utilizza

In genere il campo centrifugo viene espresso come

campo centrifugo relativo RCF, che sta a indicare

quando il campo centrifugo utilizzato è più grande del

campo gravitazionale

Questa formula serve per convertire il RCF a RPM

Quindi la forza centrifuga dipende dalla sua massa e dalla velocità con cui il rotore gira

Calcolo della forza idrostatica:

forza idrostatica

Per calcolare la si semplifica

la particella a una sfera, e quindi il suo volume

è dato dal volume di una sfera

Al peso della proteina bisogna sottrarre il peso

del acqua (mezzo) che sposta

Calcolo della forza di attrito:

forza di attrito

La è data dalla legge di Stokes

All’inizio il rotore inizia a girare e questo fa aumentare la velocità, ma aumentando la velocità

si aumenta anche la forza di attrito, finché non si arriva al equilibrio

All’equilibrio la forza centrifuga è bilanciata dalle forze opposte

Quindi si può dire, a un certo punto, che la forza centrifuga effettiva è data dalla forza

di attrito

All’equilibrio la particella avrò una velocità costante

Da questa equazione si può dedurre che la velocità di sedimentazione di una particella

Questa velocità è è proporzionale alla sua dimensione, alla differenza tra la densità della

particella e del mezzo, ed al campo centrifugo applicato

Quindi più la particella è grande ed è densa e più sarà veloce la velocità di sedimentazione

Ma più il coefficiente di viscosità è grande e minore sarà la velocità di sedimentazione

In questa equazione non si considera la forma della particella

Perché se una cellula è più allungata è sottoposta a maggior attrito e quindi è più lenta

rispetto una particella di stessa massa ma più stretta

coefficiente di sedimentazione

Si utilizza il che è espresso in secondi

È indipendente dalla centrifuga e dalle condizioni sperimentali

Non si usa la velocità di sedimentazione ma questo coefficiente

I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono molto

piccoli e, per comodità, viene presa come unità di misura il valore di 10^-13 secondi, che

viene definito come “unità di Svedberg” (S)

Il coefficiente di sedimentazione indica quanto rapidamente sedimenta una particella

sottoposta a forza centrifuga. Poiché particelle o molecole di dimensioni diverse hanno

valori di coefficiente di sedimentazione diversi, la centrifugazione ne permette la separazione

Tipologie di centrifughe:

Il rotore è agganciato a un motore che imprime il moto rotatorio, e si trova

all’interno di una camera d’acciaio

Ci sono sistemi che prevedono un sistema di refrigerazione, così che l’attrito

che si sviluppa quando il rotore gira viene raffreddato

Se il rotore deve girare ad alte velocità ci sono sistemi che fanno il sotto vuoto

In generale, le centrifughe sono classiche in base a tre parametri:

• Velocità massima che possono raggiungere

• Se hanno o meno un sistema di raffreddamento

• La capacità, cioè la quantità di materiale che può essere centrifugazione

Centrifughe da banco

Hanno velocità bassa e vengono utilizzate per far precipitare

le cellule o per separe dei materiali grossolani insolubili

Microcentrifughe

Raggiungono velocità più elevate

Centrifughe ad alta velocità

Vengono utilizzate per purificare cellule e organuli cellulari

Ultracentrifughe

Raggiungono dei campi centrifughi molto elevati

provette da centrifuga

Le sono sia provette piccole che vanno nelle

microcentrifughe sia provette che servono per centrifughe di grandi dimensioni

Quindi hanno una misura molto variabile in base a cosa dobbiamo separare

bilanciare

Per non creare danni alla centrifuga, bisogna la centrifuga, cioè i campioni

devono essere posti diametralmente opposti così da avere un peso uniforme

Ci sono vari tipi di rotori:

Rotori ad angolo fisso

• = la provetta ha una inclinazione rispetto al asse di rotazione

Rotori ad angolo verticale

• Rotori a braccio oscillante

• = si usano quando si ha bisogno di una maggiore capacità

centrofugativa, perché durante la centrifugazione la provetta cambia l’inclinazione,

passando da prima verticale a poi orizzontale

Altri tipi di centrifughe

Centrifugazione analitica: utilizzata per studiare alcune caratteristiche delle macromolecole

come massa molecolare o grado di purezza

PURIFICAZIONE PRELIMINARE

Frazionamento

Fare un frazionamento si intende creare dei sottoinsiemi in modo tale da raccoglienti in

ogni sottoinsieme caratteristiche comuni

delle proteine che hanno delle

Queste tecniche di separazione sono basate sulle diverse proprietà chimico-fisiche delle

proteine = solubilità, polarità, carica ione, legame specifico, peso molecolare, idrofobicità

Ci sono varie tappe di frazionamento per ogni proprietà chimico-fisiche

Infatti, ad esempio, all’inizio si separano le proteine in base alla propria solubilità