Biochimica applicata

Gel elettroforesi di proteine (SDS-PAGE)

SDS-PAGE è uno dei metodi più usati per valutare la purezza di proteine e il loro peso molecolare. SDS: sodio dodecilsolfato, detergente anionico che si lega alle proteine, ne provoca la denaturazione e ne fornisce cariche negative. In questo tipo di elettroforesi tutte le proteine hanno lo stesso rapporto carica/massa. Si muovono all’interno del campo elettrico in base al loro peso molecolare alla stessa velocità (grosse più lente, piccole più veloci). Ciò non accade a causa della massa, ma del setaccio che frena di più.

Ci sono due tipi di gel stratificati uno sull’altro:

• Stacking gel: gel di impaccamento a bassa porosità, pH 6,8. È la parte superiore del supporto, concentra il campione caricato in appositi pozzetti.
• Running gel: gel di corsa ad alta porosità, pH 8,8. È la parte inferiore del supporto e separa il campione.

Il processo è diviso in varie fasi:

Fasi del processo

Start (isotacoforesi): si applica il campo elettrico così gli ioni nel campione iniziano a muoversi nello stacking gel. Ho un cordone di spinta e uno di rallentamento. Gli ioni Cl- si trovano sul cordone di spinta e muovendosi velocemente spingono le proteine SDS, che inizialmente si trovano nel mezzo, in un’unica banda. Invece il cordone di rallentamento costituito dalla glicina (neutra) è quasi ferma. Essa, quindi, si oppone alla corsa dei Cl- e dei complessi SDS.

Separazione: a pH 8,8 del running gel, la glicina acquisisce carica negativa e si muove velocemente verso l’anodo e non oppone più resistenza alla migrazione di SDS che quindi si muovono nel gel in funzione del PM tramite il setaccio molecolare. Il running gel viene tagliato e successivamente separato dallo stacking gel.

Colorazione: il frammento viene sottoposto a colorazione di Coomassie/colorazione argentica per evidenziare le bande proteiche. Infine, si misura la mobilità delle singole proteine standard e si costruisce un grafico cartesiano con mobilità elettroforetica (X) e peso molecolare (Y).

Descrivere le informazioni molecolari delle tecniche di fluorescenza FRET e polarizzazione di fluorescenza

FRET è una tecnica di risonanza in cui le molecole fluorescenti con energie simili possono risuonare in base alla loro distanza. Si può avere risonanza tra due molecole: la donatrice con spettro emissione si sovrappone in parte allo spettro di eccitazione dell’altra molecola, l’accettore. La risonanza fra le due energie fa sì che l’energia del donatore venga trasferita all’accettore. Esso viene eccitato ed emette fluorescenza una volta che torna allo stato fondamentale (meccanismo del pendolo di Newton). La risonanza di fluorescenza si può verificare solo se accettore e donatore sono vicini a 80-100 Å.

Le interazioni molecolari si misurano utilizzando l’equazione di Forster. Attraverso la polarizzazione/ansiotropia di fluorescenza posso stabilire se c’è stato un legame fra ligante e ligando. Principio di fotoselezione: le molecole che assorbono una radiazione sono orientate in modo tale che il dipolo sia disposto parallelamente alla luce di radiazione assorbendo tutta l’energia. Quindi una molecola piccola si muove più velocemente e libera luce poco polarizzata, mentre una molecola grande si muove più lentamente (Es/ antigene + anticorpo) e libera luce polarizzata.

Se la molecola piccola si attacca alla molecola grande avviene un’interazione e si muoverà lentamente.

PCR

PCR è una tecnica evoluta del Southern Blot che permette di ottenere DNA in varie copie in vitro (posso fare numerose sperimentazioni). Prima di tutto si denatura il doppio filamento aumentando la temperatura fino a 95°C. I due filamenti si separano e vengono aggiunti dei primer. Durante l’Annealing si abbassa la temperatura in modo tale da far associare i filamenti di DNA con i primer. La temperatura a cui si fa avvenire l’appaiamento è tra 40°C e 60°C. Successivamente si innalza la temperatura fino a 72°C e si ha la fase di allungamento dei primer in 5’ → 3’ catalizzata dalla DNA polimerasi.

Lo scopo è di avere un nuovo filamento di DNA complementare al DNA stampo. Se si ripete per 30-40 volte, avrò reazione a catena. Grazie ai cicli a catena si avrà la possibilità di amplificare il tratto di DNA desiderato, a differenza del primo ciclo in cui si avranno lunghissimi filamenti di DNA. Si applica in campo forense, biologia molecolare e in campo terapeutico.

Colinesterasi

Colinesterasi è un enzima plasma-specifico epatico che viene immesso in circolo dal fegato. È indice specifico di alterata capacità di sintesi epatica delle proteine. Se si ha una diminuzione, si incontrerà ipofunzionalità epatica. Non è utile nella diagnosi di epatiti acute. Invece è utile nel caso di epatiti croniche e cirrosi, perché i livelli di pseudocolinesterasi si abbassano proporzionalmente al danno epatico.

Esiste anche la colinesterasi atipica che non è in grado di idrolizzare alcuni miorilassanti (es. Succinilcolina) usati in anestesiologia e può indurre un’apnea prolungata. In forma normale dopo più o meno un’ora i miorilassanti smettono di essere attivi e la colinesterasi riprende la sua normale attività.

Legge di Lambert-Beer

A = ε l c (l = cammino luce, C = concentrazione, ε = quantità di luce assorbita da 1 mole di quella molecola, A = assorbanza) la quantità della luce assorbita da un campione a concentrazione c posto in una cella con spessore uguale a l è proporzionale all’intensità della luce stessa e alla concentrazione del campione. La legge di Lambert mi serve per ricavare direttamente la concentrazione di molecole in un campione attraverso la misura dell’assorbimento.

A = -log T e T = I / I₀ La trasmittanza è la frazione di luce che attraversa il campione senza essere assorbita. Può avere valori compresi tra 0 (assorbe tutta la luce) e 1 (non assorbe la luce ma la trasmette totalmente). Questi valori valgono anche per A.

Struttura anticorpi

La struttura di un anticorpo (per esempio le immunoglobuline G) è simile a una Y. È composta da una catena leggera e una pesante. Esse si legano all’antigene nella zona N-terminale. A livello della “deviazione” delle due catene ci sono dei ponti disolfuro che le tengono unite.

L’anticorpo può essere suddiviso in regioni: Fc (parte cristallizzante) e Fab (specifica per ogni anticorpo nei confronti di un dato antigene). Ogni anticorpo quindi può legare due antigeni. L’anticorpo può essere “digerito” in frammenti precisi da enzimi come la pepsina e la papaina.

La papaina scinde da Fc. La pepsina divide le catene pesanti al di sotto dei due ponti disolfuro originando un unico frammento Fab (2) formato da quattro catene, le due leggere e le due catene pesanti fino al punto di divisione.

Southern Blot

Southern Blot è una tecnica che consente di trasferire il DNA (-) su membrane di nylon o nitrocellulosa (+). Questa fu la prima tecnica utilizzata per separare il DNA su gel. Prima di trasferirlo bisogna trattare il gel con HCl e poi con una soluzione alcalina per ottenere la denaturazione del DNA (singolofilamento). Si può identificare il DNA attraverso la sequenza nucleotidica.

Il DNA aperto viene trasferito sul Nylon e immobilizzato. Successivamente vengono inserite le sonde. Esse sono sequenze marcate di sintesi, complementari al DNA che si vuole identificare. La sonda si legherà al DNA (ibridizzazione) rendendolo fluorescente e permettono l’identificazione della sequenza. In seguito viene lavato il Nylon per eliminare le sonde non ibridate ottenendo una lastra fotografica che mette in evidenza che la sonda ha legato il DNA genomico.

Il fingerprinting è un’applicazione del Southern blot ed è usato per risolvere indagini: confrontato DNA presente sulla vittima e quello dei sospettati. Quello più simile, sarà quello del colpevole.

Enzimi nelle diagnosi delle malattie epatiche

Durante l’epatite virale si ha mobilizzazione degli enzimi della lisi, AST e ALT. Il rapporto AST / ALT dal valore normale di 0,7 si abbassa per circa un mese per poi normalizzarsi. Se rimangono costanti si passa da acuta a cronica.

Epatite con colostasi: ittero causato dal ristagno della bile, associato ad un aumento dell’attività ALP e della g-6T ovvero enzimi della colostasi.

Epatite cronicizzante: cirrosi, associata ad una progressiva diminuzione della colinesterasi.

Cromatografia liquida di gel-filtrazione

Per questa metodologia viene utilizzata una colonna di vetro che ha il fondo chiuso da un rubinetto, una resina (fase solida), un filtro che supporta la fase solida e una parte liquida. La separazione consiste nell’attraversamento della fase solida da parte delle molecole. Ciò permette la separazione di molecole in base alla loro forma e al loro peso molecolare.

Facendo scorrere la fase liquida, le varie sostanze della miscela, in funzione della loro dimensione molecolare, si inseriranno all'interno dei canali. Se le molecole hanno piccole dimensioni rispetto alle particelle della fase solida, esse possono infilarsi nelle insenature rallentando il percorso. Quindi una molecola piccola interagisce molto con la fase solida. La molecola grossa, al contrario, non riesce ad entrare nelle insenature, perciò scende velocemente ai lati della colonna. Quindi interagisce poco con la fase solida. Concludendo usciranno per prima le molecole di dimensioni maggiori. La fase solida (resina) varia in base al “cut off” ovvero alla sua caratteristica fisica (determinata porosità). Al di sotto della colonna c’è un serbatoio che raccoglie le molecole.

Produzione anticorpi monoclonali

Prima di produrre anticorpi monoclonali devo produrre quelli policlonali. Essi vengono creati tramite la tecnica degli ibridomi cioè ibridi di cellule somatiche ottenuti con fusione tra linfociti B e cellule di una linea derivata da cellule tumorali di mieloma multiplo. Si procede attraverso l’Immunizzazione di un animale (topo) con un protocollo simile a quello dei policlonali ma senza l’uso dell’adiuvante di Freund. Dopo circa 70 ore dall’ultima immunizzazione viene sacrificato l’animale.

L’ultima immunizzazione serve a sincronizzare il ciclo delle plasmacellule con quelle del mieloma che verranno poi impiegate in modo che i linfociti B e le plasmacellule mielomatose siano nella fase S del ciclo cellulare. La fusione di questi ultimi con le plasmacellule mielomatose ha lo scopo di trasformarli in una linea cellulare ibrida, immortale.

Per formare gli anticorpi monoclonali (derivano da un unico clone plasmacellulare e che presentano un’identica struttura della regione costante e variabile) si devono clonare le cellule ibridate ottenute con la policlonazione attraverso la diluizione in piastra Petri con la successiva divisione in pozzetti per formare vere e proprie colonie a loro volta formate da anticorpi uguali.

Polimorfismi

Oltre a catene di DNA che codificano in modo uguale nella maggior parte delle persone, esistono anche lunghe catene di DNA che non codificano nulla e che si trovano in regioni codificanti e che quindi possono mutare. Queste regioni vengono dette polimorfiche.