Biochimica applicata

Interazione tra molecole piccole e molecole grandi

Se la molecola piccola si attacca alla molecola grande avviene un'interazione e si muoverà lentamente.

Tecnica PCR

Tecnica evoluta del Southern Blot che permette di ottenere DNA in varie copie in vitro (posso fare numerose sperimentazioni). Prima di tutto si denatura il doppio filamento aumentando la T° fino a 95°C. I due filamenti si separano e vengono aggiunti dei primer. Durante l'Annealing si abbassa la T° in modo tale da far associare i filamenti di DNA con i primer. La T° a cui si fa avvenire l'appaiamento è tra 40°C e 60°C. Successivamente si innalza la T° fino a 72°C e si ha la fase di allungamento dei primer in 5' à 3' catalizzata dalla DNA polimerasi. Lo scopo è di avere un nuovo filamento di DNA complementare al DNA stampo. Se si ripete per 30-40 volte, avrò reazione a catena. Grazie ai cicli a catena si avrà la possibilità di amplificare il tratto di DNA desiderato, a differenza.

del primo ciclo in cui si avranno lunghissimi filamenti di DNA. Si applica in campo forense, biologia molecolare e in campo terapeutico.

4) Colinesterasi: Enzima plasma-specifico epatico che viene immesso in circolo dal fegato. È indice specifico di alterata capacità di sintesi epatica delle proteine. Se si ha una diminuzione, si incontrerà ipofunzionalità epatica. Non è utile nella diagnosi di epatiti acute. Invece è utile nel caso di epatiti croniche e cirrosi, perché i livelli di pseudocolinesterasi si abbassano proporzionalmente al danno epatico. Esiste anche la colinesterasi atipica che non è in grado di idrolizzare alcuni miorilassanti (ex. Succinilcolina) usati in anestesiologia e può indurre un'apnea prolungata. In forma normale dopo più o meno un'ora i miorilassanti smettono di essere attivi e la colinesterasi riprende la sua normale attività.

5) Legge di Lambert-Beer: A= e l c (l=cammino luce, C= concentrazione,

e= qnt di luce assorbita da 1 mole di quellamolecola, A=assorbanza) la quantità della luce assorbita da un campione a concentrazione cposto in una cella con spessore uguale a l è proporzionale all’intensità della luce stessa e allaconcentrazione del campione. La legge di Lambert mi serve per ricavare direttamente laconcentrazione di molecole in un campione attraverso la misura dell’assorbimento.

A= -log T e T= i / i0 la trasmittanza è la frazione di luce che attraversa il campione senzaessere assorbita. Può avere valori compresi tra 0 (assorbe tutta la luce) e 1 (non assorbe laluce ma la trasmette totalmente). Questi valori valgono anche per A.

6) Struttura anticorpi

La struttura di un anticorpo (per esempio le immunoglobuline G) è simile a una Y. E’ compostoda una catena leggera e una pesante. Esse si legano all’antigene nella zona N-terminale. Alivello della “deviazione” delle due catene ci sono dei ponti

disolfuro che le tengono unite. L'anticorpo può essere suddiviso in regioni: fc (parte cristallizzante) e fab (specifica per ogni anticorpo nei confronti di un dato antigene). Ogni anticorpo quindi può legare due antigeni. L'anticorpo può essere "digerito" in frammenti precisi da enzimi come la pepsina e la papaina. La papaina: scinde da Fc. La pepsina divide le catene pesanti al di sotto dei due ponti disolfuro originando un unico frammento Fab (2) formato da quattro catene, le due leggere e le due catene pesanti fino al punto di divisione.

7) Southern Blot. Tecnica che consente di trasferire il DNA (-) su membrane di nylon o nitrocellulosa (+). Questa fu la prima tecnica utilizzata per separare il DNA su gel. Prima di trasferirlo bisogna trattare il gel con HCl e poi con una soluzione alcalina per ottenere la denaturazione del DNA (singolofilamento). Si può identificare il DNA attraverso la sequenza nucleotidica. Il DNA aperto viene trasferito

Sul Nylon e immobilizzato. Successivamente vengono inserite le sonde. Esse sono sequenze marcate di sintesi, complementari al DNA che si vuole identificare. La sonda si legherà al DNA (ibridizzazione) rendendolo fluorescente e permettono l'identificazione della sequenza. In seguito viene lavato il Nylon per eliminare le sonde non ibridate ottenendo una lastra fotografica che mette in evidenza che la sonda ha legato il DNA genomico. Il fingerprinting è un'applicazione del Southern blot ed è usato per risolvere indagini: confrontato DNA presente sulla vittima e quello dei sospettati. Quello più simile, sarà quello del colpevole.

8) Enzimi nelle diagnosi delle malattie epatiche

Durante l'epatite virale si ha mobilizzazione degli enzimi della lisi, AST e ALT. Il rapporto AST / ALT dal valore normale di 0,7 si abbassa per circa un mese per poi normalizzarsi. Se rimangono costanti si passa da acuta a cronica. Epatite con colostasi: ittero causato

Dal ristagno della bile, associato ad un aumento dell'attività ALP e della g-6T ovvero enzimi della colostasi.

Epatite cronicizzante: cirrosi, associata ad una progressiva diminuzione della colinesterasi.

9) Cromatografia liquida di Gel-filtrazione

Per questa metodologia viene utilizzata una colonna di vetro che ha il fondo chiuso da un rubinetto, una resina (fase solida), un filtro che supporta la fase solida e una parte liquida. La separazione consiste nell'attraversamento della fase solida da parte delle molecole. Ciò permette la separazione di molecole in base alla loro forma e al loro peso molecolare. Facendo scorrere la fase liquida, le varie sostanze della miscela, in funzione della loro dimensione molecolare, si inseriranno all'interno dei canali. Se le molecole hanno piccole dimensioni rispetto alle particelle della fase solida, esse possono infilarsi nelle insenature rallentando il percorso. Quindi una molecola piccola interagisce molto con la fare solida.

Lamolecola grossa, al contrario, non riescono ad entrare nelle insenature, perciò scendonovelocemente ai lati della colonna. Quindi interagisce poco con la fase solida. Concludendousciranno per prima le molecole di dimensioni maggiori. La fase solida (resina) varia in base al“cut off” ovvero alla sua caratteristica fisica (determinata porosità). Al di sotto della colonnac’è un serbatoio che raccoglie le molecole.

10) Produzione anticorpi monoclonaliPrima di produrre anticorpi monoclonali devo produrre quelli policlonali. Essi vengono creatitramite la tecnica degli ibridomi cioè ibridi di cellule somatiche ottenuti con fusione tralinfociti B e cellule di una linea derivata da cellule tumorali di mieloma multiplo. Si procedeattraverso l’ Immunizzazione di un animale (topo) con un protocollo simile a quello deipoliclonali ma senza l’uso dell’adiuvante di Freund. Dopo circa 70 ore dall’ultimaimmunizzazione viene

Sacrificato l'animale. L'ultima immunizzazione serve a sincronizzare il ciclo delle plasmacellule con quelle del mieloma che verranno poi impiegate in modo che i linfociti B e le plasmacellule mielomatose siano nella fase S del ciclo cellulare. La fusione di questi ultimi con le plasmacellule mielomatose ha lo scopo di trasformarli in una linea cellulare ibrida, immortale. Per formare gli anticorpi monoclonali (derivano da un unico clone plasmacellulare e che presentano un'identica struttura della regione costante e variabile) si devono clonare le cellule ibridate ottenute con la policlonazione attraverso la diluizione in piastra Petri con la successiva divisione in pozzetti per formare vere e proprie colonie a loro volta formate da anticorpi uguali.

11) Polimorfismi

Oltre a catene di DNA che codificano in modo uguale nella maggior parte delle persone, esistono anche lunghe catene di DNA che non codificano nulla e che si trovano in regioni codificanti e che quindi possono mutare.

RFLP: sono regioni polimorfiche distinte, perché se vengono usati enzimi di restrizione uguali danno frammenti di lunghezza diversa per ogni individuo. La sequenza corretta viene riconosciuta e tagliata dall'enzima di restrizione mentre quella mutata non viene riconosciuta dall'enzima. Il riconoscimento degli RFLP può essere effettuato mediante Southern Blot o mediante PCR.

SNP: riguardano la sostituzione di singoli nucleotidi in diverse posizioni del genoma e derivano da una mutazione puntiforme che converte un nucleotide in un altro.

VNTR: polimorfismi in sequenze ripetute la cui diversa lunghezza è dovuta alla presenza di un numero diverso di sequenze ripetute.

STRP: corrispondono a microsatelliti in cui le sequenze ripetitive sono molto corte e possono corrispondere a semplici unità dinucleotidiche o tetranucleotidiche.

12) Infarto del

La diagnosi precoce si basa sul monitoraggio delle attività della Creatinfosfochinasi (CK), che aumenta nel sangue già nelle prime ore, e della Troponina T e l, una proteina strutturale dell'apparato contrattile del miocardio che viene rilasciata se c'è un danno.

LDH: in seguito a un danno ad un cardiomiocita si ha una fuoriuscita di materiale citoplasmatico e quindi necrosi cellulare. LDH1 si alza dalle 24/48 ore dopo e rimane apicco per qualche giorno. Successivamente si abbassa lasciando una cicatrice. Il rapporto LDH2/LDH1 normalmente superiore a 1 si inverte.

AST (altro indice di infarto): non accerta un infarto avvenuto ma una complicanza cardiaca. L'AST nel fegato aumenta perché a causa di un danno cardiaco, il cuore non pompa correttamente e quindi si ha un ristagno venoso del sangue che porta ad insufficienza epatica.

13) Definire il fenomeno di fluorescenza

Fenomeno di risposta all'assorbimento di una radiazione elettromagnetica.