Biochimica Applicata - parte 1

Il gruppo fosfato

Il gruppo fosfato è un derivato dell'H3PO4, possiede un atomo di H e 3 dei quali sono deprotonati, ed è molto carica negativa. Tutti i composti visti sono uniti insieme a generare il nucleotide che compone DNA e RNA. Il monomero è il nucleotide composto da zucchero, fosfato e una base azotata. Lo zucchero, in contatto con la base azotata, a sua volta si lega anche al gruppo fosfato, in modo da generare il monomero per creare il nostro nucleotide che è la base fondamentale del DNA o RNA. Sono tutti legami covalenti molto saldi.

I monomeri del DNA sono 4 tipi diversi e variano in base al legame con la base azotata. Ci sono A, G, C e T. Al centro troviamo un 2-deossiribosio che non presenta l'ossidrile in C2, mentre il C5 va a legarsi, SEMPRE, con il gruppo fosfato generando un legame covalente detto fosfoestere, che avviene tra il C5 e il derivato dell'acido fosforico. Questo legame non varia mai, ciò che effettivamente cambia è il legame in C1.

Che va alegarsi sempre con una base azotata differente tra le 4 citate sopra.

AMP, se adenina

CMP, se citosina

GMP, se guanina

TMP, se timina

Monomeri dell’RNA, in questo caso abbiamo sempre lo stesso legame, in questo caso tra il ribosio e il gruppo fosfato con un legame fosfodiestereo in C5, ciò che varia in questo caso sono le basi azotate che possono essere: A,G,U,C e come prima prendono il nome di AMP,CMP,GMP,UMP in base a quale base si lega.

Nel DNA i monomeri sono legati uno all’altro, mediante un legame in 3’ OH, questo 3’ è molto importante perché va a reagire e formare un legame con il nucleotide adiacente generando un legame fosfodiestereo con il gruppo fosfato dell’altro nucleotide e genero un legame fosfodiestereo in 3’-5’.

Estremità 5’ è quella dove è presepe il gruppo fosfato libero, mentre l’estremità 3’ è quella con OH libero.

STRUTTURA DEL DNA NELLO

SPAZIO:ØNel 1953, venne pubblicata la prima idea di elica 3D con una dimostrazione pubblicata da Watson & Creek.Due catene polinucleotidiche che corrono in modo antiparallele affiancate una all’altra. Le catene essendoorientate 5’-3’ la catena associata al DNA corre in posizione opposta 3’-5’ e per questo vengono definiteantiparallele; le due catene si legano tra loro in base all’associazione delle basi nucleotidiche differenti chevanno a presentare un’interazione. Basi azotate tra una e l’altra creano dei legami H tra G-C e tra A-T,questi legami possono essere 2 tra A-T e tra G-C invece 3.Esiste un’interazione frontale tra le basi azotate, le interazioni sono essenzialmente di natura idrostatica eforma legami H, altre invece sono idrofobiche e le basi superiori e posteriori creano un’interazioneidrofobica tra loro che le conferisce la disposizione ad elica. L’elica è sempre destrogira.- La molecola di SPAZIO:ØNel 1953, venne pubblicata la prima idea di elica 3D con una dimostrazione pubblicata da Watson & Creek.
Due catene polinucleotidiche che corrono in modo antiparallele affiancate una all’altra. Le catene essendo orientate 5’-3’ la catena associata al DNA corre in posizione opposta 3’-5’ e per questo vengono definite antiparallele; le due catene si legano tra loro in base all’associazione delle basi nucleotidiche differenti che vanno a presentare un’interazione. Basi azotate tra una e l’altra creano dei legami H tra G-C e tra A-T, questi legami possono essere 2 tra A-T e tra G-C invece 3. Esiste un’interazione frontale tra le basi azotate, le interazioni sono essenzialmente di natura idrostatica e forma legami H, altre invece sono idrofobiche e le basi superiori e posteriori creano un’interazione idrofobica tra loro che le conferisce la disposizione ad elica. L’elica è sempre destrogira.- La molecola di

DNA può essere denaturata mediante surriscaldamento si va a separare le due eliche, le Temperature sono sempre maggiori di 70/90°C separando le eliche mediante la rottura delle basi. La molecola di DNA è molto resistente e ha di conseguenza una grandissima forza, anche in caso di denaturazione può rinaturare a patto che il campione venga raffreddato e torni esattamente come all'origine.

Usando una lunghezza d'onda a 260nm riusciamo a valutare il livello di assorbanza e se il campione viene scaldato da 70 a 100°C vediamo in grafico una curva sigmoide che da piatta, arriva una curva fino a un plateau di massimo livello di assorbanza, di norma assorbe molto poco a 260nm, aumentando la temperatura la doppia elica si separa e assorbe di più a 260 quando è a singola elica; quando la molecola di DNA è completamente denaturata si raggiunge un plateau e non aumenta più la sua assorbanza.

- Tm, temperatura di melting che è il valore

di temperatura alla quale il 50% del DNA è denaturato,Tm 3 > di Tm 1 e di conseguenza ha un numero di interazioni tr4a basi azotate maggiore che inTm1.Il gene è una porzione del DNA tipica e specifica che per identifica in modo caratteristico una molecola diRNA o una proteina. Gli alleli sono la duplice copia dei geni e un esempio è dato dai geni cromosomici datiuno dal padre e uno dalla madre che genera il sesso di un singolo soggetto. Se un allele è dominanterispetto all'altro dal punto di vista fenotipico viene espresso e l'altro silenziato.DNA di un batterio è un singolo cromosoma con 46000000 nucleotidi legati l'uno all'altro per un singolocromosoma che presenza 4435 geni differenti, questo è il caso più semplice• COS'È UN CROMOSOMA?È formato da centromero e telomeri (porzioni terminali) questi si stanno studiando in modo molto specificoperché si pensa che i cromosomi si

accorciano con il passare degli anni e sia come un accorciamento biologico e arrivato ad un punto X genera la morte, si sta valutando questo aspetto.

I cromosomi, sono complessati con delle proteine, ossia gli istoni. Esiste il fenomeno d'impacchettamento che fa si che tutto venga compressato e il cromosoma viene inserito in una porzione piccolissima. Il primo passaggio è dovuto all'avvolgimento dell'elica di circa 6-7 volte si riduce. Le molecole istoniche prendono dei nomi specifici; queste sono proteine cariche positive sulla loro superficie come per esempio lisina e istidina, quindi il DNA si associa molto volentieri e forma un ottamero con associazioni di istoni differenti al quale si avvolgono 2 spire della molecola del DNA. Quando una molecola di DNA è associata agli istoni prende il nome di Nucleosoma.

Grazie agli istoni può avvenire un complessamento di 5-6 volte, esistono altri livelli d'impacchettamento che garantiscono

un'ulteriore riduzione. Esistono anche altri livelli d'impacchettamento superiori del DNA e questa garantisce un'ulteriore riduzione delle dimensioni dell'elica facendo si che i nucleosomi si compattano ancora di più e si avvolgono in una chiocciola molto stretta ed è una fibra a 30 nanometri, riducendo così di altre 7 volte la condensazione del DNA causa un avvolgimento insieme ad altre proteine non istoniche con processi più complessi e causa una riduzione di 10 000 volte formano un DNA super-avvolto.

Il superavvolgimento del DNA, è un avvolgimento di un qualcosa che era già stato avvolto. Valutando un cromosoma batterico, riusciamo a valutarli al microscopio e hanno una forma circolare, il DNA superavvolto è quando avviene un multiplo avvolgimento su sé e questa rientri in spazi sempre minori. DNA-polimerasi, è una macchina che funge da copiatore della molecola che va a disavvolgere la doppia elica nella

porzione in cui vuole copiarla e poi torna a richiuderla proseguendo più avanti. Nella porzione incui è presente la bolla di trascrizione troviamo un’apertura in cui avviene la trascrizione di una porzionedell’mRNA; la tensione topologica che si forma a monte è causa dell’aumento della tensione che è dovutaalla creazione di questo rilassamento nelle porzioni in cui è presente la bolla di trascrizione.

Esistono 2 enzimi che vanno a risolvere la tensione topologica grazie alle topoisomerasi che vanno adiminuire la tensione a cui è sottoposta. Questi enzimi sono di tipo 1 e 2.

Tipo 1, risolvono tensione topologica a monte causando un rilassamento della molecola del DNA dove nonè più fisiologicamente tesa. Questi enzimi non usano mai energia per sciogliere la tensione

Tipo 2, sono anche dette girasi introducono tensione topologica creando avvolgimenti. Se le topoisomerasidi tipo 1 non è dispendioso, questo

Invece crea un grande dispendio di energia perché è un processo non naturale e sfruttando ATP per svolgere lavoro. Topoisomerasi sono bersaglio di numerosi farmaci e vanno a limitare la trascrizione di materiale e tutti i processi fisiologici degli acidi nucleici, la. Mancata funzione di questi enzimi crea una problematica a livello cellulare.

Farmaci che inibiscono le topoisomerasi:

• Antibiotici chenolonici, come acido nalidixico che è molto antico e inibisce questi e nasce dalla ciprofloxacina che è un antibatterico molto usato
• Anche in malattie neoplastiche

La replicazione del DNA è dovuto alla presenza degli enzimi che generano la replicazione di questa elica del DNA:

La produzione di 2 molecole di DNA, variano a partire da 2 molecole progenitrici e aprendosi fa da stampo per la molecola di DNA sintetizzata, ed è esponenziale la riproduzione.

Replicazione semiconservativa perché una elica è sempre parentale e essendo lo stampo

La replicazione del DNA è un processo semiconservativo perché avviene la duplicazione di una sola elica alla volta. Tutti i cromosomi vengono coinvolti e lo scopo è quello di generare un corredo cromosomico nuovo, per comodità.

La replicazione circolare del DNA batterico segue gli stessi step di altre replicazioni, mantenendo il processo stabile e senza cambiamenti né enzimi né niente. Tutto parte dall'origine di replicazione, dove il punto in cui si apre la doppia elica genera una struttura simile a un cerchio nella zona in cui inizia la duplicazione. Qui, i punti delle due eliche sono separate e i nucleotidi sono pronti alla riproduzione.

In questo punto avviene il processo di duplicazione e qui è presente la presenza delle forcelle replicative, dove troviamo in senso orario e antiorario la capacità di riprodurre. Queste forcelle sono alle estremità. Nel cromosoma batterico c'è un solo punto, negli altri ci sono diversi punti e sono i punti in cui è

facile la replicazione del DNA, legami tra dinina e timina sono più stabili e rende più facile la riproduzione per la presenza di ricchezza di timina e dinina. Dopo la replicazione avvenuta da entrambi i lati si ha la formazione delle molecole figlie, una delle 2 eliche deriva dal cromosoma parentale. L'origine di replicazione è ricca di adenina e timina, ma chi si occupa dell'apertura? La dna-replicasi che è replicata al legame di origine di replicazione andando a riempire quello strato formando la bolla di replicazione, una volta aperta la doppia elica tende a chiudersi per la stabilità, ma la presenza di proteine dette single strand binding protein che non si legano mai al filamento doppio solo al singolo e vanno a impedire la chiusura della bolla di replicazione. Immagine, che indica una delle due sfere che rappresentano la DNA elicasi che è un enzima che disavvolge nel punto di replicazione le eliche che poi vengono stabilizzate dalla

single streght banding protein che bloccano la richiusura delle eliche. I singoli filamenti che si vengono a creare sono sempre orientati in senso 5’ da un lato e 3’ dall’altro