Biochimica Applicata - parte 1

Elettroforesi

Nel corso di una purificazione della proteina, se fatta scorrere su un gel di elettroforesi è possibile vedere lo scorrimento di alcune proteine ad occhio nudo. È necessario colorare la proteina che era stata riposta su un supporto; il colore evidenzia delle macchie blu che sono le proteine che stanno sul supporto rigido. Non vedo la proteina con la sua forma, ma riesco a vedere una banda che mi identifica la proteina di interesse.

Domande comuni sulla purificazione

1. Con il processo di purificazione abbiamo ottenuto tutte le proteine? Ce ne sono altre da trovare? Siamo riusciti a purificare totalmente la nostra?

Se abbiamo 100 proteine nel nostro estratto, purificando dobbiamo sempre valutare quante ce ne rimangono; questo lo si fa grazie all’elettroforesi. Riusciamo a vedere la composizione di sostanze che sono contenute nel nostro campione. In base a quante bande riesco a vedere, ho lo stesso numero di proteine.

Elettroforesi su gel

L'elettroforesi su gel è un processo di spostamento di una molecola all’interno di una carica elettrica. La scarica viene generata da 2 elettrodi che, quindi, generando corrente tramite 2 elettrodi riescono a generare un ddp tra catodo e anodo. È necessario un sale che permetta il passaggio delle cariche a catodo (negativo) e anodo. È presente un contenitore, che prende il nome di cella elettroforetica, che viene riempita di un tampone (elettrolita forte) e questo tampone ha lo scopo di condurre la corrente che viene generata dai 2 elettrodi all’interno del contenitore tra i quali c’è un ddp (catodo vs anodo). Le molecole si spostano in base alla loro carica all’interno del tampone venendo attirate, rispettivamente, verso catodo o anodo.

Generazione del campo elettrico

Il campo elettrico si forma per via della corsa che c’è tra le molecole, questa corsa avviene su un supporto posto tra i 2 elettrodi e corrono per la presenza di cariche spinte dal campo elettrico.

• Il supporto inerte, ha lo scopo di sostenere la corsa delle molecole che scorrono sulla fase liquida. Il supporto viene impregnato dal tampone e le molecole corrono su questo supporto andando da una parte o dall’altra in base all’attrazione del supporto bagnato.

Il campo elettrico (E) viene creato da un generatore. Il campo crea una velocità di migrazione alle molecole cariche (q); c’è la presenza di una certa velocità se il campo varia, allora varia anche la velocità.

Forza di spinta

È quella forza che viene prodotta tra il campo elettrico e carica, senza forza non c’è spinta e quindi le molecole non si muoverebbero. Formula: F=Eq.

• Le proteine, in genere, devono essere dotate di una carica e, quindi, possono muoversi all’interno del campo elettrico sul quale la particella carica genera una certa forza.

La forza di spinta, come abbiamo visto, è data dal prodotto tra campo elettrico e carica. Se esiste la forza di spinta, esiste anche una forza frenante, le componenti che influenzano il frenamento della proteina sono: viscosità, forma e PM. La forma che impedisce di più il movimento è dovuta alla presenza di una proteina fibrosa, quella con una forma più districata. Il PM, può facilitare lo scorrimento, se è maggiore. Le proteine più grandi che corrono su un supporto con una matrice, subiscono una maggiore forza frenante e, quindi, è maggiore tempo impiegato dalla proteina per percorre la strada.

Forza frenante o resistenza frizionale

È quella forza che dipende, anche, dalle dimensioni dei pori del supporto. Il supporto è un reticolo, dove le molecole scorrono lungo un supporto seguendo le altre molecole.

Viscosità del campione

Se il supporto su cui scorre il campione è più viscoso della proteina, allora, il processo fa più fatica a scorrere. Velocità di migrazione della molecola (n), dipende solamente da 2 forze, quella di spinta e quella frenante. Le molecole, in genere, si muovono sempre tenendo conto delle 2 forze, che influenzano il loro percorso. n=Eq/f n —> da questa formula vediamo come sia direttamente proporzionale a Eq e, invece, è inversamente proporzionale ad f, che è il coefficiente direzionale. F dipende da PM, viscosità e porosità del mezzo e forma della proteina.

Mobilità elettroforetica

La mobilità elettroforetica, invece, dipende da e E, perché come possiamo vedere: U=Eq/fE —> U=(Eq/f) (1/E) —> U=q/f. Muovendo le molecole con una maggior velocità, allora aumenta anche il campo elettrico. Dalla legge di Ohm, che dice che: l’intensità della corrente elettrica è direttamente proporzionale alla resistenza, si riesce a ricavare che il ddp dei voltaggi del processo sono direttamente proporzionali alla resistenza e, la resistenza, è direttamente proporzionale alla potenza che viene dissipata in calore.

• Quindi, se la resistenza si dissipa in calore, può generare diverse problematiche aumentando di molto la resistenza e probabilmente andrebbe incontro a evaporazione del campione e i Sali presenti si concentrerebbero andando ad aumentare la forza frizionale e creare nuovi problemi.

Aumentando la velocità, si ha come conseguenza l’aumento anche della temperatura, che perciò necessita di un tempo vario: almeno 1 h e il voltaggio resta basso.

Tipi di supporti

Esistono 3 diversi tipi di supporti che vengono usati in questa tecnica:

• Acetato di cellulosa: si crea una camera con all’interno questo acetato di cellulosa, che svolge la funzione di supporto inerte che viene inzuppato nel tampone delle proteine che corrono a seconda della fase liquida del supporto. Non è più una tecnica molto usata, né per la diagnosi di alcune patologie, né in laboratori di ricerca, ma viene, ancora oggi, molto usata per l’analisi delle proteine plasmatiche.
• Agarosio
• Poliacrilamide

Tutti questi supporti, sono di natura inerte e non agiscono mai con il campione che viene totalmente imbevuto nel campione di elettroforesi. Una volta impregnato il supporto, il campione può spostarsi nelle maglie del supporto in direzione del campo elettrico. L’acetato di cellulosa, viene veduto in pacchetti. Ogni foglio, flessibile, può contenere un po’ di campioni; questa tecnica viene usata ancora oggi per l’analisi delle proteine plasmatiche. In molti laboratori, però, l’analisi delle proteine plasmatiche avviene mediante la tecnica dell’HPLC.

Preparazione

Il foglietto viene inserito in una vaschetta elettroforetica, piena di tampone per l’elettroforesi. Qui, poi, viene inserito tra i 2 elettrodi. La vaschetta è piena di tampone a circa 8,6; a questo pH tutte le proteine del siero hanno una carica. Se andiamo a variare il pH, allora varierà anche la carica delle proteine. Sulla membrana vengono inseriti 1-2 microlitri di campione in direzione del catodo. Le proteine plasmatiche, in genere, si spostano verso l’anodo eccetto l’albumina che va verso il catodo, tutte le altre vanno verso l’anodo. Il voltaggio è tra i 6 e gli 8 V, in modo che si tolga la striscia. A questo punto, si fa asciugare e vengono colorate le proteine con un colorante che le colora di rosso, e in base all’intensità diversa che hanno, se la banda è molto scura ho più proteina/e e quindi il colorante si lega di più. L’intensità è dovuta anche alla quantità di materiale. La separazione delle proteine dipende dal loro PM, quelle più pesanti si separano prima (vedi le alfa). Quest’analisi viene fatta per la valutazione della quantità delle proteine plasmatiche, l’elettroferogramma converte l’intensità di colore del picco, li trasforma in pixel e genera poi un elettroferogramma, dove il picco più grande è quello dell’albumina, quindi quella che va opposta alla corrente generale, poi successivamente escono i vari picchi che dipendono dalla banda e dall’intensità del colore.

Supporto agarosio: viene molto usato per gli acidi nucleici, DNA o RNA; l’analisi degli acidi nucleici è più approfondito. Viene poco usato come supporto, ma questa molecola è fatta al momento/o al massimo un giorno prima e ha la consistenza gelatinosa del gel. Formata dall’agarosio che è un polimero organico di zuccheri formato da polisaccaridi. Viene estratto dall’agar, che è un’alga. La molecola che viene estratta, è un polisaccaride che viene venduto come polvere secca di agarosio e, successivamente, viene idratata per formare il gel. In questo caso, l’idratazione viene fatta tramite un tampone per l’elettroforesi. Essendo un polisaccaride delle alghe, a temperatura ambiente non si scioglie in acqua; mentre se è a temperatura di ebollizione allora riesce a sciogliersi in acqua, una volta sciolto quando torna a temperatura ambiente si solidifica e forma il gel.

Miscele e preparazione dei supporti

MISCELAZIONE CON AGAR SECCO E TAMPONE: in questi casi la % varia tra l’1 e il 3 di agarosio nella beuta in base all’analisi da fare. Se le molecole sono grandi, allora l’agarosio è vicino all’1 e viceversa. Dopo aver pesato l’agarosio, lo si mette in beuta e poi lo si mette a bollire in un forno a microonde. Quando è avvenuta l’ebollizione nella beuta, vedo che si è sciolto e la lastrina si è svuotata, ma vedo che ci sono delle macchie con le stesse dimensioni che c’erano nella cella elettroforetica. Più la % di agarosio è alta e più piccoli sono i pori nel gel e, viceversa, se è più piccola la % più grandi sono i pori. In genere, i pori sono abbastanza regolari ma possono avere delle dimensioni che possono variare. Una volta tolta la copertura si formano i pozzetti. Una volta seminato il tampone nei pozzetti, che successivamente correrà. I pozzetti si formano prima della solidificazione grazie all’utilizzo di macchine con dentini specifici. Il DNA in genere è pieno di gruppi negativi dati dai gruppi fosforici e, quindi, i pozzetti vanno riposti verso il catodo perché poi, di norma, i gruppi corrono verso l’anodo.

Analisi del PM con SDS

Visione filmato elettroforesi su SDS: è possibile conoscere il PM delle proteine non note? Dello standard conosco il PM e posso calcolare la distanza tramite una misurazione andando a formulare un grafico con in (X) cm e in (Y) i PM, riesco a valutare in base alla retta di taratura come varia la situazione. In base all’interpolazione riesco anche a calcolarmi in modo ottimale, tramite la misurazione delle bande in base alla distanza, quale sia il suo PM. In base alla costruzione di una retta riesco a calcolare anche il PM.

• Elettroforesi con buffer discontinui o con tamponi diversi, oltre a chiamarsi SDS-PAGE si chiama anche così.

Il gel di poliacrilamide, per essere un SDS è un gel verticale che presenta al di sopra dei pozzetti portacampione e viene preparato con 2 tamponi diversi. ¾ del gel prende il nome di “gel di corsa”, la parte in alto contenente i pozzetti, invece, si chiama gel d’impaccamento. Ecco spiegato come mai i gel sono posti uno sopra l’altro e hanno due funzioni differenti. Sono costruiti in modo differente; la poliacrilammide viene formata con un tampone e un pH diverso dall’altro.

Differenze nei gel di poliacrilammide

Differenze:

• pH a cui avviene la polimerizzazione del campione
• % di poliacrilammide usata per le due composizioni

Nel gel d’impaccamento, il pH è sempre uguale a 6.8 e ha una % di poliacrilammide che è sempre circa il 5%, che è sempre costante. La % è molto bassa e quindi i pori sono molto larghi. In effetti questa parte non serve per la separazione del campione, ma serve per far depositare i campioni nel gel, in modo che passino nel pozzetto e in questa regione avviene la prima entrata del campione a livello del supporto. L’altro gel ha un pH pari a 8.8 e la % è variabile a seconda delle proteine che voglio analizzare. È sempre >5%, ma compresa tra 6 e 20%. Ecco spiegato perché si chiama buffer discontinui. Si prende lo stampino e lo si mette in verticale, si miscela poliacrilammide per la formazione del gel di corsa con aggiunta di PMS e tenneds, e successivamente quando ho occupato i ¾ dello stampino dopo la polimerizzazione della parte in basso, si inserisce la poliacrilammide ai valori del gel d’impaccamento e così formo i 2 gel. Alla fine della formazione dei gel ho i 2 diversi tipi necessari per il buffer discontinuo.

• Il gel ha funzione di accogliere il campione nel gel in una prima regione molto lassa e a pH 6.8, precedentemente come abbiamo visto era stato purificato il campione.
• Il gel di corsa, invece, ha una % variabile e qui avviene la vera separazione del campione in base al PM.

Il campione risulta blu per la presenza di blu di bromofenolo e glicerolo in miscelazione che genera densità e il colore al campione. Sul fondo troviamo l’elettrodo positivo; l’analisi viene condotta ad un voltaggio variabile ma comunque medio-basso, spesso a 120V dato dal conduttore di elettricità. Tutto avviene all’interno di un forte elettrolita, un tampone che è pieno di questo. Il tampone è formato da tris-HCl, glicina a pH 8.3, SDS. È un sale tricloridrato; a contatto con HCl genera il sale della molecola, che è cloridrato a pH 8.3, importanza del cloridrato perché per la carica – viene influenzato dalla carica verso il polo; mentre la componente glicina SDS è ciò che interviene nella separazione.

Nello spostamento delle molecole delle proteine, oltre all’azione passiva del setaccio molecolare della poliacrilammide, intervengono il Cl e la glicina che hanno anche loro un ruolo importante nella separazione della proteina. All’interno dei pozzetti troviamo la proteina, l’SDS, il blu di bromofenolo, il glicerolo (aumenta la densità della soluzione). Stabilendo le cariche elettriche (sotto +) e si accende la scarica elettrica, vediamo che la corrente elettrica spinge verso il basso il complesso, gli ioni Cl- che derivano dal complesso, tendono a spingersi verso l’anodo, mentre la glicina, al pH 6.8, non ha carica visto che è il suo pI.

Nel campo, troviamo subito gli ioni Cl- che sono i più piccoli, poi i complessi SDS-proteina e infine la glicina che non ha carica. Se rimane la glicina, sembra che aumenti la resistenza alla corsa dovuta alla glicina senza carica. Il complesso proteina-SDS entra nella cella e si concentra in una sottile striscia nell’interfaccia tra gel d’impaccamento e gel di corsa. Così facendo, la banda si concentra e si impacca per il suo effetto; questo processo è fondamentale per far sì che le proteine entrino nello stesso momento nel gel di corsa, perché così riescono a separarsi in modo corretto e nello stesso tempo.

La resistenza alla corsa deve essere risolta, perché quando entra in quello di corsa al pH del gel di corsa la glicina si carica negativamente e superata la fase critica, quando entra in quello d’impaccamento si carica e viene spostato dal campo elettrico. Infine la separazione nel gel di corsa avviene senza resistenza della glicina ma solo per via dei PM di complessi SDS-proteina.

Soluzioni coloranti

2 tipi di soluzioni coloranti: il Coomassie Blu si lega alle proteine per interazioni elettrostatiche, dove ci sono le proteine si lega il colorante e forma un colore blu; se non ci sono, resta bianco. Può essere considerato se la conc. delle proteine è di circa 100 ng (poco sensibile).

Se le proteine sono di conc. inferiore, devo usare la colorazione silver staining, o colorazione all’argento. Questo colorante si lega con la presenza di nitrato di argento, che si trasforma in Ag+ colore metallico e non blu. Usata se il campione proteico è molto poco concentrato e devo usare un colorante più preciso. Analisi qualitativa sulla miscela delle proteine, una volta trovato il gel faccio tutte le mie considerazioni sulle bande ecc.

Il gel di poliacrilammide si disidrata in modo rapido diventando secco, quindi in genere viene svolto uno scanner e si usa per l’analisi di periodi successivi e dopo qualche giorno viene buttato.

Tecnica aggiuntiva: il Western Blotting

Tecnica aggiuntiva sul gel di poliacrilammide (il Western Blotting) è fondamentale perché quando carico il campione e dopo l’elettroforesi voglio capire quale sia la mia banda e che nell’estratto sia presente la mia categoria di proteine, devo usare questa tecnica. Il motivo per non fare l’analisi sul gel è dovuto al fatto che sia molto sottile e delicato e il maneggiamento è pericoloso; un secondo motivo è che seccano velocemente. In caso di un’immunodecorazione, e devo analizzare un corpo devo trasferire il tutto da un gel ad una membrana più rigida. Questo processo prende il nome di Western blot, elettroforesi dell’estratto poi faccio scorrere la proteina senza colorazione che viene poi immediatamente trasferito dal gel alla cellulosa. La nitrocellulosa è una fotocopia di ciò che era prima, stessa posizione.

Membrane e transferimento

Membrane: nitrocellulosa o PVDF, sono supporti di fogli un po’ più resistenti della carta e servono per il trasferimento delle proteine dal gel.

2 tecniche: elettroblotting, trasferimento su una cella elettro che prende il nome di elettrocella per Western Blotting, in questo caso il campo elettrico perpendicolare al gel e quindi si forma un “sandwich”; il gel viene messo a contatto con la membrana di nitrocellulosa e poi vengono messi dei pezzi di carta per mantenere il gel aderente alla nitrocellulosa e poi un supporto in plastica che fa pressione per le due. Un campo elettrico da negativo a positivo; dopo la corsa le proteine subiscono il campo e si spostano dal gel alla nitrocellulosa. Alla fine del processo, sandwich buttato eccetto la membrana di nitro che contiene le proteine separate; questa membrana prende il nome di blot. Durata circa 1 ora ed è il processo più usato.