Biochimica applicata - come preparare una soluzione

BILANCE

Ci sono due tipi di bilance: le bilance tecniche e le analitiche. La bilancia tecnica è molto simile a

quella che si usa per cucinare, arriva massimo a un kg, con una precisione di un g; le bilance

analitiche sono quelle che si usano per pesare le piccole quantità; devono essere calibrate in maniera

accurata e periodica con dei pesi. Bisogna utilizzare la bilancia adatta per la quantità di materiale

che devi pesare così come il contenitore adatto; deve essere sempre tarata e deve stare su un piano

che non deve vibrare, che si chiama tavolo da bilancia. Sono importanti i contenitori che servono

per pesare le sostanze che possono essere sia vaschette di plastica, piccoli contenitori di vetro,

spatole cucchiai.

SISTEMI AGITATORI

Vengono usati per agevolare la soluzione, e quindi sciogliere le polveri. Ci sono gli agitatori

magnetici, piastra metallica, motore e un magnete dentro al beker che gira e scioglie. Gli agitatori

rotanti per le provette. (il fine è SCIOGLIERE UN SOLUTO IN UN SOLVENTE)

SISTEMI TERMOSTATATI

Possono essere stufe o incubatori termostatati che consentono di mantenere una determinata

tempoeratura. Possono essere a secco (ad aria) o bagnetti (vengono messi nell’acqua e l’acqua viene

mantenuta a tempoeratura); possono essere anche oscillanti (così che la reazione magari possa

continuare e nel frattempo la temperatura viene mantenuta).

Ci sono dei blocchi riscaldanti servono per provette e piccoli volumi; importante poi è la

conservazione a freddo, ci sono gli armadi refrigerati, macchina che produce ghiaccio, camera

fredda; questi contenitori servono sia per la lavorazione e la conservazione. Poi c’è la conservazione

di campioni a +4°, i conelatori a -20, a -80, tutti dotati di allarmi; arriviamo a -196 con l’azoto

liquido.

PH-METRI

Serve per misurare il pH di una soluzione. È fatto d un elettrodo che deve essere immerso nel

liquido da misurare. L’elettrodo di vetro sottile che viene immerso ha una corrente dovuta gli ioni

H+ che viene misurata da un voltametro r mostrata sul display che converte la corrente in unità di

pH. Deve essere calibrato prima di fare la misurazione a seconda del pH che devi misurare. Il pH

varia con la temperatura di conseguenza il pHmetro ha una sonda termometrica. Dentro all’elettrodo

ci deve sempre essere una soluzione sovrasatura di KCl. Bisogna sempre conservarlo in un liquido

quando non si effettuano misurazioni.

CAPPE

Ci sono diversi tipi di cappe che servono per la sicurezza dell’operatore durante le manipolazioni.

Ci sono cappe chimiche, cappe sterili, cape a flusso laminare, cappe di tipo bio-hazard. Le cappe

chimiche hanno un sistema di aspirazione, un vetro di protezione, filtri. Le cappe sterili vengono

usate per manipolare le cellule inn condizioni di sterilità. èer le manipolazioni microbiologiche a

basso rischio è sufficiente usare una cappa a flusso laminare, il cui flusso è unidirezionale

orizzontale o veriticale e servono per la protezione del prodotto manipolato. Poi ci sono le cappe di

biohazard per manipolare campioni di microrganismi potenzialmente patogeni per l’uomo e a

seconda del rischio, la cappa può trovarsi in ulteriori ambienti sterili; per mantenere sterile

l’apparecchiatura vengono irradiati con UV quando non ci sono gli operatori.

CENTRIFUGHE

La centrifuga serve a sedimentare un precipitato, separarlo dal sopranatante, separare diverse

frazioni subcellulari, raccogliere batteri o cellule in sospensione. Sono costituite da un motore a

velocità variabile che gira intorno a un asse a cui viene ancorato un rotore dove ci sono gli

alloggiamenti per le provette e questo rotore può essere confinato in una camera chiusa termostata o

anche sottovuoto. Il valore che viene impostato per far girare si chiama valore RPM (rivoluzioni per

minuto) e si parla sempre di accelerazione centrifura che viene misurata come multipli di

accelerazioni di gravità. C’è la centrifugazione preparativa e analitica a seconda delle dimensioni

del campione e dello scopo della centrifugazione. Poi ci sono le ultracentrifughe che arrivano a 900

mila g.

Mentre si centrifuga si possono controllare anche le temperature.

La centrifugazione oltre che per sedimentare rapidamente particelle in sospensione può essere

impiegata anche per separare (frazionare) macromolecole in soluzione o come metodo analitico per

studiare certe caratteristiche delle macromolecole come il peso molecolare e la forma. Le tecniche

di centrifugazione preparativa in particolare comprendono la centrifugazione differenziale e la

centrifugazione in gradiente di densità.

TECNICHE DI SEPARAZIONE

Le proteine per essere studiate e analizzate in vitro prima devono essere purificate. La purificazione

è resa possibile grazie all’identità chimica di ogni proteina che avrà caratteristiche proprietà

chimico-fisiche diverse rispetto alle altre. Le proteine vengono purificate tramite procedimento di

frazionamento e separazione. La difficoltà che incombono in questi processi variano a seconda del

tipo di proteina, ad es le proteine ampliamente espresse come l’emoglobina nei globuli rossi

vengono isolata con facilità, altre come alcuni fattori di trascrizione invece è più impegnativo. Di

fondamentale importanza è la fonte biologica dalla quale purificare la proteina e la scelta della fonte

deriva dal tipo di tessuto o organello in cui risiede la proteina. Di conseguenza la purificazione di

una proteina è un processo a sé stante che varia di proteina in proteina.

-il primo passaggio della purificazione di una proteina è la rottura delle cellule che le

contengono, procedura chiamata lisi cellulare. È una procedura che deve avvenire in un

opportuno mezzo, ossia una soluzione tampone, che preservi la struttura nativa delle proteine.

SOLUZIONE TAMPONE: le soluzioni impiegate devono avere una composizione capace di

preservare il più possibile la struttura nativa delle proteine e la loro attività biologica. La

formulazione di queste soluzioni è basate sulle caratteristiche chimico-fisiche dei tessuti biologici in

particolar modo considerando il pH. Il mantenimento del pH è essenziale per preservare la struttura

e la funzionalità della proteina. I tamponi comunemente usati sono costituiti da acidi deboli (acido

carbonico, acido fosforico, acido acetico) e da alcuni tipi di ammine e aminoacidi. Bisogna

considerare oltre al pH anche il valore di pressione osmotica che deve essere analogo a quello

intracellulare e quindi capace di prevenire lo shock osmotico, per questo frequentemente si impiega

uno zucchero come il saccarosio a concentrazione 0,25 M. Nelle soluzioni tampone vengono

disciolti anche altri composti del tipo se si vogliono purificare proteine citosoliche bisogna

incorporare composti tiolici che sono fondamentali per mantenere i gruppi sulfidrilici delle proteine

e impedire la formazione di legami di solfuro impropri.

I metodi di lisi variano a seconda della localizzazione cellulare della proteina. Ad es nel caso delle

proteine di membrana che non sono solubili in soluzioni acquose, queste devono essere prima tratta

con detergenti con natura amfipatica di modo da renderle solubili grazie alle caratteristiche

idrofobiche e idrofiliche. Nel caso invece di proteine extracellulari presenti nel siero o secrete nel

brodo di coltura da batteri o lieviti, la procedura di estrazione è molto più facile, si utilizza solo una

filtrazione.

Le cellule batteriche o di lievito che vengono fatte crescere in sospensione devono essere separata

dal mezzo di coltura mediante un processo di sedimentazione come la centrifugazione e poi devono

essere risospese nel tampone.

I METODI DI ROTTURA SONO VARI e dipendono dalla presenza o meno della parete cellulare e

dalla natura chimica di questa. Questi metodi possono essere meccanici o non meccanici. I tessuti

devono essere inizialmente omogeneizzati tramite metodi meccanici, quindi sottoposti a processi

che disintegrano il tessuto, trasformandolo poi in un materiale omogenato. È preferibile eseguire la

lisi delle cellule mantenendo il campione in ghiaccio e conducendo tutti i successivi passaggi di

purificazione alla temperatura di 4°. Inoltre a prescindere dal metodo di estrazione scelto, bisogna

accuratamente scegliere il mezzo in cui immergere il campione ovvero la soluzione tampone.

Tra i metodi meccanici più usati:

-FRENCH PRESS: tecnica applicabile a microrganismi quali batteri e lieviti. La sospensione

cellulare viene messa in una camera di compressione di acciaio inox, dotata di pistone, mano a

mano che si abbassa il pistone aumento la pressione; dopodichè si apre lentamente la valvola a

spillo cosicchè le cellule possano uscire e causa dello shock pressorio che subiscono uscendo dalla

valvola scoppiao e si frantumano

-OMOGENEIZZATORI POTTER: le membrana sono rotte da forze frizionali che un pestello in

vetro o teflon esercita contro le pareti di un contenitore di vetro in cui è contenuta la sospensione

cellulare. È un metodo che mi permette di mantenere integri gli organuli, questo perché

fondamentale la distanza tra il teflon e il vetro.

Tra i metodi non meccanici:

-LISI PER OSMOSI: cellule fragili come i globuli rossi si lisano semplicemente sospendendole in

acqua distillata, in tal modo si crea una differenza di pressione osmotica tra l’ambiente

extracellulare e l’intracellulare tale da causa l’entrata di acqua nella cellula e quindi la sua

esplosione.

-DIGESTIONE ENZIMATICA: la parete cellulare dei batteri e dei lieviti può essere digerita con

enzimi litici che vanno disciolti nel tampone in cui sono disciolte le cellule. Se il tampone è

ipotonico rispetto all’ambiente intracellulare, l’acqua comincia a uscire dalle cellula e si ha lisi per

osmosi.

-successivamente alla lisi ci sono delle tecniche di frazionamento: si utilizzano per isolare

proteine o organelli gli uni dagli altri sfruttando le caratteristiche diverse come dimensione, densità

e forma. Nel caso del frazionamento delle proteine, la tecnica consente di ottenere una frazione di

un gruppo di proteine aventi proprietà simili sfruttando le differenze rispetto a solubilità, stabilità al

calore e al pH, idrofobicità, dimensioni, e capacità di legare ligandi o macromolecole.

Una tecnica utilizzata per frazionare è la centrifugazione in particolare la centrifugazione

differenziale e la centrifugazione in gradiente di densità.

1) centrifugazione differenziale : è quella applicata più di frequenta per frazionare in quanto i

vari organelli presenti nell’omogeneato cellulare presentano varie velocità di

sedimentazione oltre che di densità e dimensioni. In questa tecnica il materiale da frazionare

è sottoposto a centrifugazioni sequenziali, in cui in passaggio successivo s