Biochimica applicata

La biochimica applicata

La biochimica applicata serve ad impostare degli esperimenti che mi permetteranno di ottenere una risposta alle domande che come ricercatore mi pongo. Per ottenere delle risposte univoche, il ricercatore ha bisogno di adottare un approccio investigativo.

Approccio investigativo

Un approccio investigativo consiste di vari passaggi:

• Disegno sperimentale
• Lavoro di progettazione
• Raccolta ed espressione dei dati

Disegno sperimentale

Una volta scelta la problematica da valutare, è importante formare un disegno sperimentale, osservando ciò che serve per l’esperimento e come si comporta la patologia che deve essere analizzata per capire poi come procedere nell’esperimento. L’ipotesi, ovvero la possibile spiegazione di un evento osservato, parte da un’osservazione di tratti comuni, e va verificata perché diventi una teoria. La validità dell’ipotesi va verificata con un disegno di esperimenti e con l’analisi dei risultati ottenuti mediante opportuni test statistici, che ne permettono la conferma. Se l’ipotesi resiste ai test, viene chiamata teoria.

Nel momento in cui osservo delle contraddizioni, devo ricominciare da capo, cancellando l’ipotesi di partenza e formularne un’altra. Per evitare di incorrere in contraddizioni dovute ad errori nei test, devo adottare un metodo preciso ed efficace, che mi dia la garanzia che i risultati che ottengo siano giusti.

Lavoro di progettazione

Una volta formulata l‘ipotesi, si deve iniziare il lavoro di progettazione, in cui verifico ad esempio che l’aumento di colesterolo è dovuto alla malattia presa in considerazione. Per verificarlo, devo fare una serie di esperimenti e quindi si avrà la progettazione dell’esperimento con tempistiche, materiali, tecniche di analisi in base ai metaboliti implicati nell’analisi e medium di lavoro. Questo passaggio va effettuato mediante esperimenti pilota per capire quali sono le tecniche adatte. Si comincia da un “disegno” dell’esperimento, partendo da piccoli esperimenti pilota, con un’ipotesi semplice e pochi campioni, in modo da verificare che la strada intrapresa è corretta oppure devo andare a modificare delle condizioni.

È importante, poi, tenere un quaderno in cui si annotano tutti i particolari di un esperimento, per fare in modo che sia riproducibile; in particolare, è importante riportare lo scopo dell’esperimento, la descrizione dettagliata di materiali e metodi, le osservazioni dei risultati e conclusioni e suggerimenti per i successivi esperimenti. È importante infatti commentare durante l’esperimento quello che succede, per poter utilizzare accorgimenti negli esperimenti successivi.

Raccolta ed espressione dei dati

I dati devono essere raccolti in maniera coerente e ordinati in modo che siano capibili da chi non è coinvolto nel lavoro, poi bisogna commentarli, anche attraverso l’utilizzo di grafici. Lo scopo di esprimere graficamente i risultati è quello di comunicare informazioni in modo immediato. Pertanto, i grafici devono essere esplicativi e essere corredati da una legenda comprensibile, e le scale degli assi del grafico stesso devono essere proporzionate.

I principali tipi di grafico usati sono:

• Grafico a barre: ha un impatto visivo importante, e permette di osservare quale gruppo di dati è in maggioranza. Oltre ai dati stessi, è importante indicare il numero di campioni analizzati, il luogo dell’esperimento (soprattutto se su larga scala) e deviazione standard (o l’errore standard). È ideale per numeri di dati non troppo elevati. È importante fare attenzione al titolo del grafico, in modo che sia il più possibile coerente con i dati analizzati.
• Retta: questa rappresentazione è utile per rappresentare correlazioni fra parametri (es. dose-effetto), cioè come varia un parametro in funzione di un altro. Questo è visibile grazie a R². Esso deve comunque essere sottoposto a un’analisi statistica, in quanto, per rappresentare al meglio l’esperimento, deve essere statisticamente significativo: R² può anche essere piuttosto basso (es. 0,5), ma nell’analisi statistica di questo parametro si tiene conto di tutte le variabili biologiche, quindi anche un valore basso può essere corretto; questo non può però essere valido nel caso in cui la retta rappresentata sia una retta di calibrazione: in questa situazione R² deve avvicinarsi il più possibile a 1. La retta è utile anche per confrontare due metodi, ad esempio nella preparazione di kit diagnostici, in cui si ha un metodo nuovo da mettere in comparazione con uno già certificato.
• Grafico a torta: è utile per osservare di quanto sono diverse due distribuzioni. In realtà, questo tipo di rappresentazione è poco utile se le differenze fra le distribuzioni sono poco significative.
• Tabella: lo scopo di questa rappresentazione grafica deve essere quello di comunicare informazioni e permettere confronti, non solo raccogliere dati. In realtà, non è la rappresentazione più efficace, soprattutto se si hanno tanti dati da discutere.

Analisi spettrofotometrica

La parte di spettro elettromagnetico che interessa le analisi biologiche è quello UV-visibile: in particolare le radiazioni UV hanno una lunghezza d’onda compresa tra i 190 e i 400 nm (maggior lunghezza d’onda, minor energia), mentre lo spettro del visibile va da 400 a circa 750 nm. In particolare, sono rilevate da analisi spettrofotometriche nel visibile delle molecole che possiedono cromofori, gruppi funzionali in grado di dare un colore, che cioè assorbono tutte le radiazioni eccettuata quella del colore che emettono. L’energia cresce in senso opposto a quello della lunghezza d’onda, quindi a 190 nm avremo un’energia maggiore rispetto a 400 nm.

Gli spettri di assorbimento nell’UV e nel visibile sono dovuti a transizioni energetiche degli elettroni esterni della molecola sia non impegnati che impegnati in un legame relativamente poco stabile (legami multipli, doppietti solitari). È importante fare una distinzione fra spettrofluorimetria e spettrofotometria: nella prima, l’interazione della radiazione luminosa con il cromoforo fa sì che esso assorba energia, permettendo a un elettrone di passare allo stato eccitato; quando l’elettrone torna allo stato fondamentale rilascia energia sotto forma di radiazione luminosa con minor energia, quindi con lunghezza d’onda maggiore, e si ha pertanto un assorbimento di energia. Nella seconda, invece, cambia l’intensità della radiazione, non la sua lunghezza d’onda, in quanto la molecola può modificare solamente l’intensità di radiazione (I₀ > I); in questo caso, quindi, le radiazioni uscenti sono di meno ma hanno la stessa λ, e pertanto non viene assorbita energia.

Potrò quindi andare a misurare l’assorbanza e la trasmittanza:

A = log₁₀ (I₀ / I)

T = I / I₀ quindi A = log₁₀ 1 / T

Un cromoforo è un gruppo funzionale di una molecola in grado di assorbire radiazioni luminose, dando origine a picchi distinti in uno di assorbimento. Non è tutta la molecola ad assorbire, ma sono solo gli elettroni poco impegnati nel legame. Questo permette l’analisi di sostanze per mezzo di uno spettrofotometro. Tuttavia, uno stesso cromoforo può essere presente su diverse molecole, e ciò crea delle interferenze nell’analisi; la spettrofotometria, quindi, non è un’analisi altamente specifica, e, nell’effettuare un’analisi quantitativa, bisogna tener conto del fatto che lo stesso cromoforo dell’analita possa essere presente anche in altre molecole completamente diverse, soprattutto se si analizza una miscela. Inoltre, l’assorbanza totale viene data dalla somma di tutti i composti cromofori presenti in una molecola, quindi se ve ne è più di uno, si deve stare attenti a non scambiarlo per altro.

L’energia necessaria per una transizione elettronica diminuisce (es. nel caso di doppi legami coniugati) con un aumento della λ corrispondente a quella in cui il cromoforo presenta il suo picco di assorbimento (effetto batocromico). Una diminuzione di doppi legami o la protonazione di un gruppo, invece, portano a una diminuzione del valore della λ (effetto ipsocromico). Si parla infine di effetto ipercromico o ipocromico quando si osserva rispettivamente un incremento o una diminuzione dei valori di estinzione come il caso della denaturazione al calore di DNA.

Lo spettrofotometro

Lo spettrofotometro è costituito da:

• Sorgente luminosa: generalmente gli spettrofotometri sono dotati di due lampade, una che emette nel visibile (tungsteno) e una che emette nell’UV (deuterio). Può essere anche allo xeno che emette sia visibile che UV.
• Monocromatore: serve per selezionare una o poche lunghezze d’onda; la sorgente luminosa, infatti, emette una radiazione policroma, che viene scomposta dal monocromatore, che in seguito seleziona la radiazione monocroma di interesse; la scomposizione della luce in componenti monocromatiche è in pratica impossibile. Per quanto la larghezza della fenditura d’uscita sia piccola, infatti, uscirà sempre un intervallo di componenti monocromatiche. Questo intervallo di lunghezze d’onda costituisce la banda passante del monocromatore.
• Alloggiamento delle cuvette: le cuvette, riposte in questa parte dello spettrofotometro perché vengano colpite dalla radiazione selezionata, sono piccoli parallelepipedi in cui viene inserito il campione da analizzare. Sono costituite da materiale diverso a seconda della radiazione che si deve usare nell’analisi; questo perché il vetro non permette il passaggio dei raggi UV, quindi per analisi di questo tipo si deve optare per una cuvetta in quarzo. Quelle più utilizzate per il visibile sono quelle di plastica.
• Fotomoltiplicatore: amplifica il segnale in modo che sia registrato.
• Registratore.

Esiste un altro tipo di spettrofotometro, il cosiddetto diodearray, utile soprattutto per analisi in HPLC. In questo tipo di macchinario la cuvetta è posta prima del monocromatore, in modo da vedere tutte le interazioni che il campione può avere con le radiazioni, permettendo l’identificazione di più cromofori. Grazie a questo saremo in grado di ottenere uno spettro di assorbimento. Lo spettro di assorbimento evidenzia come varia l’assorbanza di un campione in base alla variazione di lunghezza d’onda. Nel grafico rappresentato a fianco, la molecola assorbe nell’UV. Se si tratta effettivamente di una sola specie, questa possiede due gruppi funzionali che assorbono o lo stesso cromoforo che assorbe a lunghezze d’onda diverse; in alternativa lo spettro rappresenta una miscela di molecole diverse che assorbono. Osservando lo spettro non si può capire quale delle due sia l’alternativa corretta; questo fatto, detto limite della determinazione o della tecnica, comporta la necessità di utilizzare tecniche analitiche diverse per verificare quale sia l’ipotesi giusta. I picchi di assorbimento, in ogni caso, rappresentano gruppi funzionali che assorbono.

Esempi di applicazione

Un esempio di applicazione della spettrofotometria riguarda la denaturazione del DNA, cioè il processo nel quale si rompono i legami a idrogeno tra le basi azotate del DNA e le due semieliche si separano. La denaturazione avviene semplicemente aumentando la temperatura a cui si trova il DNA, ma per valutare a che livello si è spinta viene utilizzata la spettrofotometria, poiché non è visibile. Infatti, si verifica un effetto ipercromico legato all’effetto cooperativo dei legami a idrogeno, per il quale, all’aumentare della temperatura, aumenta l’assorbanza (o densità ottica) alla lunghezza d’onda di 260 nm, cioè quella classica del DNA. All’aumentare della temperatura, l’assorbanza aumenta fino a un valore massimo, che corrisponde alla condizione in cui tutto il DNA è stato denaturato.

Dal grafico è possibile ricavare un valore di temperatura specifico, la temperatura di melting (Tm), cioè la temperatura alla quale si è denaturato il 50% del DNA. La Tm dipende dalla composizione in basi del DNA. Infatti, ogni adenina si lega a una timina con 2 legami a idrogeno, mentre ogni guanina si lega a una citosina con 3 legami a idrogeno; quindi, rompere un’interazione G-C richiede più energia e una temperatura maggiore e la denaturazione comincia dalle zone del DNA ricche di A-T. Si può quindi dire che, maggiore è la Tm, minore sarà il numero di coppie A-T in quel segmento di DNA, e minore è Tm, maggiore è il numero di coppie A-T. Tuttavia, per avere l’esatta composizione in basi del DNA, è necessaria un’altra tecnica che permetta di sequenziarlo.

Un altro esempio è lo spettro tra deossiemoglobina e ossiemoglobina. La forma ossigenata presenta 3 picchi abbastanza distinti con λ a max 415, 542 e 577 nm, mentre la forma deossigenata ne presenta solo 2 a 430 e 555 nm. Quindi, analizzandole in campioni in cui si trovano divise, riuscirò a capire in quale campione è contenuta una e in quale l’altra. Se avrò entrambe le forme in un campione, avrò la somma delle assorbanze e quindi non riuscirò a distinguerle.

Solventi nell’analisi spettrofotometrica

I solventi per l’analisi spettrofotometrica vanno scelti in modo che non interferiscano con l’assorbimento dell’analita. Il solvente ideale dovrebbe sciogliere tutti i composti presenti nel campione ed essere trasparente alla λ di esercizio. L’acqua distillata si avvicina a questa condizione, ma non è adatta per composti organici apolari. Ad eccezione dell’acqua, tutti i solventi mostrano una λ critica (detta di cut-off), nella regione UV, sotto la quale assorbono troppo per consentire misure sul campione. Con i solventi volatili è consigliabile l’uso di una cella con tappo per prevenire l’evaporazione che altera la concentrazione dell’analita.

Assorbanza e legge di Lambert-Beer

L’assorbanza, cioè la capacità di una molecola di assorbire, varia con la temperatura; è quindi importante a temperatura ambiente.

Legge di Lambert-Beer

È un’equazione matematica che correla l’entità dell’assorbimento con la concentrazione di analita. È applicabile soltanto a molecole pure in soluzione o a molecole con un cromoforo che sia assente in tutte le altre molecole della soluzione (non devono esserci interferenze).

Dove:

• A: è l’assorbanza o estinzione;
• I₀: è l’intensità della radiazione in entrata e I è quella in uscita;
• l: è il cammino ottico, dato dalla lunghezza della cuvetta (di solito 1 cm);
• C: è la concentrazione dell’analita;
• k: è la costante di assorbimento (tabulata).

La costante di assorbimento può essere espressa in due modi:

• ε (coefficiente di estinzione molare): è l’assorbanza di una soluzione 1 M in un cammino ottico di 1 cm e in condizioni standard di λ, solvente e temperatura. Si esprime in L/(mol*cm). Si usa quando è noto il peso molecolare dell’analita;
• E% (coefficiente di estinzione percentuale): è l’assorbanza di una soluzione contenente 1 g di analita in 100 ml di solvente, in un cammino ottico di 1 cm e in condizioni standard di λ, solvente e temperatura. Si esprime in 100 ml/(g*cm). Si usa quando non è noto il peso molecolare dell’analita o si ha una miscela di analiti. E% è utilizzato per contenere l’errore di misurazione di miscele di composti simili, con peso molecolare simile (es. collageni).

Non devo cambiare la lunghezza d’onda quando faccio le analisi, perché a lunghezze d’onda differenti il cromoforo della mia molecola ha assorbanze differenti. La Lambert-Beer può essere applicata solo alle sostanze pure e/o in assenza di altre sostanze che assorbono a quella lunghezza d’onda. Più alto è il valore di k, maggiore è la capacità del cromoforo di assorbire, cioè maggiore è la sensibilità del sistema, perché aumenta la risposta del campione; la costante di assorbimento, quindi, dà un’idea della sensibilità del sistema.

I valori di k sono tabulati ad una specifica λ, che è solitamente quella di massimo assorbimento della molecola. Nell’analisi spettrofotometrica, allora, è importante utilizzare quella lunghezza d’onda, in modo da non commettere errori. Si ricordi che assorbanza, estinzione e densità ottica sono termini equivalenti. Ad esempio, se si ha ε = 40000 L/(cm*mol), A = 0.65 e l = 1cm, la concentrazione sarà uguale a C = A/(ε × l) = 16 M. Lo spettro di assorbimento in questo caso è il classico spettro di una molecola con 3 doppi legami coniugati.

Lo strumento dà sempre una risposta che non dice direttamente la concentrazione, e spesso non dà una risposta linearmente correlata alla concentrazione; normalmente si ha solo un intervallo di concentrazione in cui la proporzionalità è diretta e lineare.

Analisi quantitativa

L’analisi quantitativa è il procedimento per il quale la risposta derivante dalla miscela in esame viene confrontata con quella ottenuta da una miscela di uguale composizione, ma contenente una concentrazione nota dell’analita da determinare (soluzione di riferimento).

I requisiti essenziali di un’analisi quantitativa sono:

• Specificità: possibilità di dosare un analita senza avere interferenze da parte di altre sostanze presenti in miscela.
• Limite di determinazione: la più piccola quantità di analita che può essere misurata ad un livello stabilito di confidenza statistica (S/N=3).