Biochimica applicata

CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ

La cromatografia di affinità è una tecnica che sfrutta la capacità di interazione dell’analita con unopportuno ligando associato alla matrice, che funge da fase stazionaria. L’interazione è debole, e inparticolare sufficientemente debole da poter essere interrotta da modifiche leggere dellecondizioni, come una variazione di pH o di concentrazione dei sali della fase mobile, masufficientemente forte da poter reggere l’eluizione di molecole interferenti. È una tecnica chepermette la purificazione di una biomolecola sulla base delle sue caratteristiche biologiche.

La fase stazionaria è costituita da una matrice inerte derivatizzata con un opportuno ligando permezzo di un braccio spaziatore; il legame tra matrice e ligando deve essere piuttosto forte. L’analitaviene specificatamente e reversibilmente adsorbito a un ligando immobilizzato su una matrice permezzo di legami.

covalenti. L'interazione deve essere specifica, e pertanto sul ligando deve essere presente un sito di legame che riconosca specificatamente una caratteristica della molecola in esame. L'interazione, inoltre, dipende dalla disponibilità della porzione in grado di interagire con l'analita, quindi l'efficacia dipende da quanto sono disponibili i ligandi al legame con l'analita di interesse: se il ligando è orientato male, non disponibile o alterato strutturalmente, non si può avere l'interazione, e si ha un errore nella cromatografia. Per migliorare al massimo l'interazione è stato inserito uno spacer arm: si tratta di catene alifatiche interposte tra il ligando e la matrice; lo spacer è utilizzato quando il sito attivo è posizionato in posizione sterica sfavorevole nella molecola. Le fasi commerciali (gli spacer sono disponibili in commercio) hanno spacer ottimizzati per ogni specifica separazione. Lo spacer arm,dunque, permette di rendere più disponibile al legame con l'analita il gruppo funzionale ligando. I ligandi sono di due tipi: - Specifici: legano specificatamente una molecola (come il legame antigene-anticorpo o enzima-inibitore); servono per isolare una specifica molecola; esempi di fasi specifiche sono riportate in tabella; - Generici: legano gruppi funzionali specifici presenti su classi di molecole. Servono quindi per isolare molecole che abbiano gruppi funzionali in comune (es. separazione di una classe di cellule). Alcuni tipi di ligando sono riportati nella tabella sottostante: Per la carica e l'adsorbimento del campione usare un flusso di eluente molto basso così da permettere il migliore adsorbimento. Meglio se si ferma il flusso. Si può effettuare anche in provetta. Il basso flusso permette all'analita di "occupare" tutti i siti attivi della colonna. La cromatografia di affinità è l'unico tipo che può

essere effettuato su un campione liquido; è addirittura possibile caricare la fase stazionaria nel campione biologico, per poi lasciarlo riposare per un tempo utile al ligando per reagire con l'analita. Il flusso di eluente deve essere, in questo caso, molto basso, per facilitare l'interazione. Le proteine interagiscono in modo differente con il ligando in modo dipendente dalla loro affinità. Viene poi effettuato un lavaggio per eliminare ciò che non si lega. Il lavaggio si effettua con volumi diversi di opportuna fase mobile, scelta in modo da non alterare il legame tra l'analita e il ligando. Vengono poi eluiti gli analiti con minor affinità per il ligando, quindi aumentando la forza ionica o il pH dell'eluente anche quelli con maggior affinità per la fase stazionaria. Il legame deve essere reversibile.

Metodi di eluizione

L'eluizione dipende da ciò di cui si ha bisogno, e può essere effettuata con metodi diversi:

1. ...

Nel caso più semplice un cambiamento nella composizione del tampone eluisce la sostanza legata senza danneggiare né questa né il ligando, ma solo alterando l'interazione; 2. In altri casi sono richiesti, per l'eluizione, estremi di pH o elevate concentrazioni di agenti caotropici, ma questo potrebbe causare un danno temporaneo o permanente; 3. Si hanno poi metodi più specifici di eluizione, che prevedono l'utilizzo di molecole con affinità maggiore per il ligando, che quindi competono per la sostanza in esame. La molecola scalza l'analita (o il ligando) e si lega al suo posto o al ligando o all'analita. Nel caso in cui la molecola inserita sia più affine all'analita si deve poi riuscire a eliminarla dalla fase stazionaria, per liberare il ligando. Se eseguo la cromatografia in provetta il problema sarà separare il complesso della fase stazionaria e recuperare l'analita. Uno dei sistemi che viene

Utilizzato quello delle particelle magnetiche. La fase stazionaria ha sempre legato il braccio spaziatore ma all'interno della matrice avrò delle microscopiche biglie magnetiche. Una volta caricato il campione, attraverso una piastra magnetica, riuscirò a separare le molecole che si sono legate alle biglie (analita) dai contaminanti. In seguito, utilizzerò i metodi illustrati in precedenza per recuperare l'analita. La provetta permette di utilizzare quantità di analita minori rispetto alla colonna.

Affinity tags

Il metodo degli affinity tags è molto usato per isolare proteine ricombinanti fatte produrre da microorganismi. Si modifica in questo caso il gene della proteina, in modo che oltre al gene venga prodotto un altro frammento, chiamato tag (piccole sequenze di amminoacidi che creano una porzione di proteina riconosciuta dal ligando). Tra i tag più comuni vi sono GST, che lega glutatione, MBP, che lega maltosio, biotina, che lega avidina.

poli-His (coda di istidina tipica di proteine contenenti Zinc Fingers), che lega nichel e zinco, e proteina A, che lega anticorpi. Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolate per cromatografia di affinità con ligandi legati alla colonna. I tag sono porzioni non fisiologicamente presenti nella proteina, quindi a seguito della separazione devono essere eliminati, ma in un primo momento permettono di separare una proteina ricombinante dalle altre proteine fisiologicamente prodotte dal microorganismo ospite. Per eluire la proteina legata alla fase stazionaria si utilizza una fase eluente contenente una proteasi specifica che taglia il tag dall'analita. Il tag rimane nella fase stazionaria, mentre la proteina viene eluita.

Applicazioni: Questo metodo cromatografico è utilizzato ad esempio per separare proteine che legano amminoacidi fosforilati si prepara una matrice con spacer e amminoacidi fosforilati; la proteina si lega a questi, mentre tutte le altre, a meno che non

abbiamo affinità per gli amminoacidi fosforilati, no. La IMAC, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography si basa sull'interazione tra alcuni residui superficiali delle proteine (istidina, cisteina) e cationi di metalli di transizione che formano chelati (Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+). Per capire quando si ha l'eluizione di un analita, bisogna accoppiare alla cromatografia un rivelatore; in questo caso, ad esempio, si usa un diode array che permette di analizzare tutto lo spettro. Tuttavia, per sapere se ciò che eluisce è l'analita di interesse, bisogna utilizzare altri metodi di analisi più specifici e precisi. Un'altra applicazione è l'immunoaffinità, una cromatografia di affinità che sfrutta le capacità immunogeniche di una proteina. In generale vengono impiegati degli anticorpi specifici che vengono fissati sulla colonna e in seguito viene aggiunto il campione in cui è presente la molecola di interesse.che si lega all'anticorpo. Si esegue poi un lavaggio per eliminare gli interferenti e si procede con l'eluizione in modo che venga rilasciata la proteina di interesse. Bisognerà utilizzare un metodo di diluizione molto brusco quindi la proteina potrà perdere le sue funzioni. Una delle principali applicazioni della gel filtrazione è la purificazione di anticorpi monoclonali. Questi, infatti, possono essere separati per immunodiffusione, che però non è un sistema preparativo, perché non permette che gli anticorpi vengano estratti dalla matrice, dà solamente un'idea della loro presenza. Oppure può essere utilizzata una SDS-PAGE, che è però, come nel caso precedente, per lo più un metodo analitico, non preparativo, quindi permette l'identificazione. Per isolare in modo quantitativo l'anticorpo, quindi, bisogna usare la cromatografia di affinità: tutta la proteina caricata puònormale o diretta: in questa modalità, la fase mobile è costituita da un solvente non polare, mentre la fase stazionaria è polare. Le sostanze più polari si legano maggiormente alla fase stazionaria e si muovono più lentamente, mentre le sostanze meno polari si muovono più velocemente. Fase inversa: in questa modalità, la fase mobile è costituita da un solvente polare, mentre la fase stazionaria è non polare. Le sostanze meno polari si legano maggiormente alla fase stazionaria e si muovono più lentamente, mentre le sostanze più polari si muovono più velocemente. La cromatografia di ripartizione è una tecnica molto utilizzata in biochimica e biologia molecolare per separare e purificare le proteine.

Per fase diretta (SP) si intende una fase stazionaria polare da utilizzare con eluenti relativamente poco polari. Le molecole polari sono trattenute in colonna in funzione della forza delle loro interazioni con i gruppi polari della fase stazionaria. Quindi i composti apolari eluiscono prima di quelli polari. Questo metodo non è ottimale per la separazione di molecole apolari, ma lo è per molecole polari.

Spesso le fasi normali sono costituite da gel di silice e i silanoli (Si-OH) sono i gruppi polari. Altre fasi normali consistono in gel di silice funzionalizzato con altri gruppi polari, come -CN, -NO2 o -NH2 (fasi legate); gli eluenti usati sono generalmente apolari o di media polarità (esano, diclorometano, cloroformio). In questo caso le interazioni fra analita e fase stazionaria non avvengono più con i gruppi silanolici ma con le fasi legate. La fase diretta è meno utilizzata rispetto a quella inversa (circa il 20% delle cromatografie), ma è

più efficace per isolare isomeri strutturali, quindi questa è la sua principale applicazione.

Nella cromatografia a fase inversa (RP) la fase stazionaria è apolare,