Biochimica applicata

A

:

frazionare macromolecole in soluzione, in particolare -

Centrifugazione differenziale principalmente usata per il FRAZIONAMENTO

CELLULARE (la migliore purificazione si ottiene con centrifugazioni sequenziali)—-> Gli

organelli di un omogenato cellulare differiscono per densità e dimensioni e sono

separati dalla centrifugazione per la diversa velocità di sedimentazione. Usata

per frazionare le cellule e raccogliere in maniera sequenziale nel precipitato l’organico

di nostro interesse, si ottiene applicando in sequenza forze centrifughe crescenti.

Organuli hanno capacità di sedimentazioni diverse in base alle dimensioni. Usata per

frazionare organuli mai proteine solubili

25 -

Centrifugazione in gradiente di densit à può essere applicata sia alla separazione di

cellule, virus e organelli, sia di acidi nucleici e proteine. Permette di separare

all’interno della stessa provetta cell che hanno caratteristiche di densità e massa

diversa, le separo poi o in funzione della massa o della densità. Usata anche per

separare una miscela es sangue. Ampia gamma di applicazioni -

Centricon concentrano e separano in base a peso molecolare. Provetta da 15ml

.

termina a V usata in centrifugazione -

Cromatografia purifica con varie tecniche una proteina, permettono di arricchire il

campione di un range di prot con caratteristiche simili sfruttando meccanismi di

esclusione molecolare, la purificazione con maggior resa si ha mediante cromatografia

di affinità

METODI DI PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE consentono un arricchimento e . B

isolamento di una frazione di proteine con caratteristiche simili a quella che vogliamo

andare a caratterizzare. Sono tecniche preliminari usate prima di altre metodiche es

cromatografia perché hanno una risoluzione molto bassa. Non forniscono un

elevato grado di purificazione ma eliminano gran parte delle molecole non

proteiche, definendosi quindi come un metodo di ARRICCHIMENTO. Sfruttano

il diverso grado di solubilità delle proteine stesse distinte in base alla presenza di

gruppi ionizzabili (acidi e basici), polari e idrofobici presenti sulla superficie di in una

proteina ovvero AA. In base a composizione AA si determina la solubilità di

una proteina che dipende da vari fattori come ph, concentrazione di sali nel mezzo,

polarità del solvente e temperatura. Proteine diverse hanno, in determinate

condizioni, valori di solubilità profondamente diversi: alcune precipitano, altre restano

.

in soluzione. Questo effetto viene sfruttato per la purificazione delle proteine -

Precipitazione frazionata con Sali—> Avremo alcune proteine che nelle stesse

condizioni andranno a precipitare e altre che avendo diversa solubilità rimarranno in

sospensione. I SALI influenzano la solubilit à di una proteina poich é gli ioni disciolti

interagiscono con i residui carichi esposti sulla superficie della proteina, avremo

soluzioni a basse concentrazioni di sali (bassa forza ionica) aumentano la

solubilità delle proteine → salting in (gli ioni in soluzione promuovono le interazioni

proteina-solvente e impediscono la formazione di aggregati proteici); abbiamo poi le

soluzioni ad elevate concentrazioni in cui alcuni sali (alta forza ionica) riducono la

solubilità delle proteine → salting out (competizione per le molecole di acqua

d’idratazione tra il sale aggiunto e le proteine, le interazioni proteina-proteina nelle

regioni idrofobiche diventano più forti delle interazioni proteina-solvente, causando la

formazione di aggregati). Quelle ad alta forza ionica con elevata quantità di sali attrae

a se acqua e le proteine tendono a interagire fra loro attraverso forze idrofobiche ciò

porterà alla formazione di aggregati che possono essere separati facilmente attraverso

centrifugazione, in questo modo concentriamo e facciamo precipitare proteine in base

a forza ionica e concentrazione di sali solitamente solfato di ammonio e alla solubilità.

La concentrazione di sale necessaria per determinare la precipitazione è differente per

ciascuna proteina: proteine idrofobiche precipitano a bassa concentrazione salina,

quelle meno idrofobiche ad alta concentrazione salina. Il salting out di miscele

complesse di proteine ne causa un arricchimento ma non produce una reale

purificazione, vi sarà la presenza di proteine co-precipitate → per migliorare la

selettività si può combinare la scelta del sale con la sua concentrazione e il pH. Il

salting out fa precipitare le proteine senza denaturarle. Il sale più usato è il solfato di

ammonio → la sua concentrazione si esprime come percentuale di saturazione

(percentuale rispetto a una soluzione satura del sale stesso). Il sale viene aggiunto

lentamente mantenendo la proteina in costante agitazione. Dopo centrifugazione la

proteina potrà essere nel P o nel SN → ripetere la procedura. Tutti i passaggi sono

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generalmente condotti a 4°C. Tale metodica si usa come primo passaggio di

purificazione e prevede una o due precipitazioni sequenziali a percentuale di solfato di

ammonio crescenti. Successivamente il sale viene rimosso tramite la cromatografia

per gel- filtrazione (per piccoli e medi volumi) o tramite dialisi (per volumi maggiori).

vantaggio del solfato di ammonio e che indipendentemente dalla concentrazione non

denatura le proteine usato x studio di enzimi. La precipitazione in solfato di ammonio

avviene durante centrifugazione a soluzione vengono aggiunti brandelli di solfato di

ammonio in granelli, agitazione, tutto trasferito in provetta e refrigerato. Per

rimuovere solfato di ammonio e isolare proteina usiamo tecnica della dialisi, si basa

sul passaggio di ioni dal nostro tubicono di plastica in cui mettiamo soluzione con cui

abbiamo precipitato prot in solfato di ammonio, viene messo in beker con soluzione

ipotonica e in base al taglio molecolare del sacco da dialisi tutti gli ioni che hanno

dimensioni inferiori al taglio molecolare tendono a uscire dal sacchettino fino a che la

concentrazione interna e esterna al sacchettino è all’equilibrio , dunque con diversi

passaggi rimuovo tutti i sali. Nel beker in cui avviene dialisi deve essere posto in

agitazione serve biretta magnetica e dipende da concentrazione sale tempo di

procedura per dialisi. Maggiore sarà la quantità di acqua maggiore sarà la quantità di

sali che potrà uscire da sacchetto da dialisi. Se non abbiamo ottenuto adeguata

.

rimozione del contenuto salino la procedura va ripetuta -

Precipitazione con solventi organici—>si tratta generalmente di alcoli. Anche in

questo caso si sfrutta la diversa solubilità delle proteine qualora si trovino in soluzioni

miste di acqua e alcoli a catena alifatica lunga e corta es butanolo o acetone, etanolo

questi precipitano le proteine in quanto abbassano la costante dielettrica del solvente,

riducendone il potere di dissolvere ioni (come le proteine), e favorendo le interazioni

elettrostatiche (anziché idrofobiche) proteina-proteina innescando la precipitazione.

L’applicazione di questi solventi può essere usata in maniera isolata o in combinazione

con salting out, e si basa sulla diversa capacità dei solventi organici di favorire la

dissoluzione di ioni e la precipitazione di proteine variandone la solubilità . Questo

fenomeno però richiede temperature vicino allo zero, o inferiori, per evitare l’effetto

denaturante che i solventi organici hanno a temperature più alte e ciò non avviene con

precipitazioni con sale di ammonio. Alcuni solventi come la N,N dimetilformamide

(DMF) o il dimetilsulfossido (DMSO), non riescono a precipitare prot perché ne

aumentano la solubilità -

Precipitazione al calore—> sfrutta la differente stabilit à delle proteine al calore : il

calore denatura le proteine alterandone la struttura terziaria. Si tiene in

considerazione termostabilità e termolabilità delle prot, normalmente calore altera

struttura 3D delle prot e le denatura. Denaturando una prot si ha l’esposizione di

residui idrofobici che tende a formare aggregati proteici che interagiscono fra loro

proprio attraverso questi residui idrofobici dati da un aumento della temperatura

stessa, la formazione di aggregati causa la precipitazione della proteina. Se non si

controlla bene la temperatura però si ha una completa denaturazione della prot,

dobbiamo vedere quindi qual è la temperatura di denaturazione della proteina che ci

interessa in modo da farla solo precipitare e non denaturare totalmente. Si stabilisce

su un piccolo volume di campione la temperatura alla quale la proteina di interesse

denatura, poi si usano temperature di 5-10 °C inferiori alla temperatura di

denaturazione per 15-30 min. Mediante centrifugazione vengono poi rimosse le

proteine precipitate. Non è una metodica conveniente, viene utilizzata per proteine

particolarmente stabili al calore (es. proteine ricombinanti di organismi termofili).

Viene usata come strategia per inattivare le proteasi presenti in un omogenato di

.

tessuto

ANALISI DELLA RESA, verifica qualità e quantità prot purificata. ANALISI .

3

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QUALITATIVE E QUANTITATIVE DELLA MISCELA PROTEICA MEDIANTE NUMEROSE

TECNICHE (es. metodi spettrofotometrici, elettroforesi ecc..), possono essere usate

tecniche analitiche quantitative x valutare la concentrazione della proteina nel

nostro campione rispetto alla conc di partenza o tecniche qualitative per vedere se

sono presenti delle proteine contaminanti quindi vedere il grado di purezza della prot

che volevamo isolare. A tali scopi si utilizzano metodiche analitiche valide anche per

.

analizzare la proteina purificata

Tecniche quantitative: per la determinazione più o meno precisa della -

.

concentrazione della proteina -

Tecniche qualitative: per verificare la presenza della proteina di interesse nel

campione e vedere il grado di purezza

Alcune di tali tecniche consentono anche di determinare alcune proprietà delle proteine

come il punto isoelettrico e massa molecolare. Sono: ELETTROFORESI, METODI

.

SPETTROFOTOMETRICI, TECNICHE IMMUNOCHIMICHE (successivamente trattate)

Le tecniche di purificazione delle proteine sono diversificate per sfruttare le proprietà

delle proteine stesse: la dimensione (PM) e forma, il contenuto in aminoacidi acido o

basici, la carica di una proteina (somma delle cariche (+) e (-) ad un dato pH sulla

superficie), il punto isoelettrico, la distribuzione di carica (ci può essere una distribuzione

non uniforme sulla superficie), solubilità (influenzata da pH, forza ionica), densità

(lipoproteine<proteine<fosfoproteine), idrofobicità (numero e distribuzione dei residui

idrofobici), capacità a legare metalli o altre molecole, capacità di associazione e

dissociazione