Biochimica

Biochimica

La biochimica cerca di mettere insieme le nozioni già imparate di chimica, fisica, citologia e istologia, darne delle ragioni e spiegare come gli organismi viventi funzionano in base ai principi. Dobbiamo introdurci ai concetti fondamentali delle macromolecole e delle molecole organiche (glucidi, lipidi, nucleotidi, proteine, vitamine, coenzimi). Ci interessa capire quali sono i rapporti delle strutture delle macromolecole con le loro funzioni.

Livelli di specializzazione

Il primo livello di specializzazione è la cellula, il secondo gli organi o tessuti. Le cellule devono tenere conto delle informazioni che si è scambiata con un’altra perché spesso reagisce o risponde a degli stimoli esterni dati spesso da ormoni. Questi poi attivano delle specifiche vie metaboliche che producono sostanze riutilizzabili per altri processi. Gli ormoni non entrano nella cellula, restano a livello dei recettori. Tutte le cellule staminali hanno gli stessi geni, ma non tutte esprimono gli stessi durante il differenziamento cellulare. Alcune vie sono presenti e funzionali, altre no, o sono funzionali solo in alcuni momenti.

Nella cellula abbiamo un nucleo ben definito immerso nel citoplasma dove si trovano anche i vari organuli. La cellula è definita da una membrana plasmatica che la separa da ciò che è all’esterno. La cellula deve regolamentare i rapporti con l’esterno e quindi la membrana è responsabile degli scambi biochimici tra l’interno e l’esterno della cellula. La tipologia di scambio dipende dalla tipologia di membrana, cioè dal doppio strato fosfolipidico.

Struttura della membrana plasmatica

La membrana è composta da un doppio strato di fosfolipidi che fanno passare delle particelle mentre altre vengono bloccate. La membrana è selettiva nei confronti delle molecole che passano per diffusione (come l’ossigeno) in maniera veloce. Le molecole che non passano per diffusione, passano attraverso altri specifici sistemi di trasporto, ma passano in maniera lenta o con degli aiuti. Per gli elementi che non diffondono autonomamente ci sono delle molecole, come per esempio le proteine, che fungono da trasportatori che sono altamente specifici per una determinata molecola.

La membrana plasmatica funge da proteina recettore in grado di riconoscere varie sostanze (anche self e non-self), svolge un ruolo attivo in vari contesti, riesce a far cambiare forma e dimensioni alla cellula o le fa mantenere la forma. Riesce anche a far sì che la superficie cellulare si modifichi in modo che le cellule diverse non si confondano tra di loro interagendo o fondendosi le une con le altre e hanno anche funzione antigienica (gruppi sanguigni). La membrana riesce a modificare le dimensioni cellulari come avviene nei globuli rossi che per passare attraverso i capillari devono ridurre drasticamente il proprio diametro.

Per esempio, nel fegato il glucagone (ormone) si lega al recettore e favorisce la regolazione di glicemia, in quanto il fegato funge da riserva di glucosio, che viene liberato in circolo in seguito allo stimolo subito dal recettore.

Organizzazione cellulare

Il secondo livello di organizzazione cellulare è quello nucleare. La membrana nucleare ha dei pori per il passaggio di varie sostanze. Al di fuori del nucleo abbiamo il comparto citosolico, composto da mitocondri, Golgi, RE, lisosomi ecc., tutti definiti da una propria membrana. In particolare, il RE e il Golgi usano per il trasporto di molecole dei processi di vescicolazione (scambi che non passano attraverso la liberazione di molecole nel comparto citosolico, ma restano compartimentate in varie vescicole).

Lo studio della biochimica analizza gli elementi cellulari singolarmente, isolandoli dal complesso cellulare. Per esempio, per isolare il nucleo dalla cellula, si utilizzano una provetta ed un pestello appositi per rompere la membrana plasmatica, dopo di che si utilizza la centrifugazione per separare i nuclei dal resto e dato che questi sono relativamente pesanti rispetto agli altri componenti cellulari, si depositano sul fondo della provetta. Se per esempio volessi poi separare i mitocondri, una volta rimossi i nuclei dovrei aumentare la velocità della centrifuga per ottenere i mitocondri sul fondo. Una volta raccolti, per raccogliere qualcosa presente nel citoplasma, dovrei eliminare centrifugando tutto quello che non è compreso nel citoplasma, e solo alla fine centrifugo il citoplasma a velocità elevatissima ottenendo le componenti del citosol cellulare separate. A questo punto posso studiare i singoli componenti dal punto di vista biochimico (composizione, funzioni ecc.).

Differenze tra cellule eucariote e procariote

Il processo di differenziamento cellulare è un processo continuo che non avviene solo in un momento specifico. I mitocondri sono composti da due membrane, la membrana esterna biochimicamente è relativamente permeabile, mentre quella interna è molto selettiva. Inoltre, sulla sua superficie si svolgono molti processi biochimici. La quantità di membrana mitocondriale interna (il numero di creste mitocondriali) varia in base alla cellula in cui si trova il mitocondrio e alla fase in cui è il mitocondrio. Minore è la superficie della membrana interna, minore è l’efficienza del mitocondrio nei processi di O₂ dove c’è produzione di ATP.

Il DNA mitocondriale non è organizzato in cromatina ma è un DNA circolare che ricorda il DNA procariotico. Questo sostiene la teoria secondo la quale i mitocondri siano procarioti inglobati da una cellula eucariote. Il numero di copie di DNA è elevato e variabile e codifica solo per alcune proteine che formano i mitocondri, mentre le altre proteine per la divisione mitocondriale, che non avviene necessariamente in contemporanea alla divisione cellulare, sono codificate dai geni del DNA nucleare. I mitocondri variano di numero nella cellula a seconda dei momenti funzionali della cellula stessa (non è costante né per tipo di cellula né per tipo di fisiologia dell’organismo).

Composizione della membrana

Com’è possibile che la compartimentazione riesca a soddisfare tutti i suoi ruoli (composizione della struttura della membrana e la natura fisico-chimica degli elementi che la attraversano)? La membrana plasmatica è composta da un doppio strato fosfolipidico. Ogni fosfolipide ha una testa (polare) rivolta verso il solvente e una coda (idrofobica) che si andrà ad associare ad un altro fosfolipide. La membrana viene attraversata da molecole di diversa natura, soprattutto proteine, che possono essere immerso nello strato, sporgere verso l’interno o verso l’esterno, o attraversano la membrana biologica. Il tratto transmembrana dovrà essere stabile dal punto di vista chimico perché deve essere idrofobico. Se così non fosse, questa proteina non potrebbe essere transmembrana ma dovrebbe essere dentro o fuori.

I fosfolipidi tendono ad appaiarsi tra di loro. Questo stabilisce la stabilità della membrana biologica. Il problema è che se una membrana è troppo stabile perde la sua fluidità e diventa rigida. [I globuli rossi si devono modificare per passare attraverso i capillari. Se la membrana non fosse fluida, il globulo non si riuscirebbe a modificare e andrebbe ad occludere il capillare]

La coda è composta da due catene di acidi grassi, una però presenta un doppio legame cis che fa piegare la coda in quel punto verso destra. Da lì la distanza tra le code va ad aumentare. La catena di acidi grassi con il legame è insatura. I fosfolipidi possono essere glicerofosfolipidi (gli acidi grassi sono fatti da una molecola di glicerolo a tre atomi di carbonio con tre gruppi OH, due dei quali formano dei legami esteri) oppure sfingolipidi. In queste due famiglie ci sono altri gruppi, dipende da che molecola viene portata. Molecole come il colesterolo si localizzano nella membrana, nel doppio strato. Si va ad inserire tra due fosfolipidi e così la rigidità della membrana diminuisce. La fluidità è maggiore soprattutto nella parte bassa perché i fosfolipidi, separati dal colesterolo, in quella parte sono lontani.

Se abbiamo un gruppo di molecole immerse in acqua, le teste si disporranno verso il solvente e le code si avvicineranno tra di loro escludendo il liquido (acqua). Formano una micella lipidica. Se invece abbiamo un doppio strato fosfolipidico messo in acqua, la situazione è questa.

Membrana biologica

Una membrana biologica da chi è attraversata? Immagino due comparti pieni d’acqua separati da una membrana con il doppio strato di fosfolipidi. Se metto da una parte la specie A e dopo un po' è anche nell’altro comparto, questo vuol dire che A attraversa la membrana. Posso anche sapere qual è la selettività della membrana nei confronti di una molecola e anche il tempo di diffusione. I fosfolipidi all’interno della membrana possono diffondersi lateralmente, avere movimenti di flip-flop, ruotare o flettersi. In alcuni momenti, i fosfolipidi si potrebbero raggruppare grazie alla diffusione laterale. Così si formano strutture chiamate lipid raft e sono dove ci sono associate alcune proteine che non attraversano totalmente la membrana pur restandone associate. Queste sono formate grazie all’aggiunta di alcune code lipidiche che si associano.

La formazione di una vescicola inizia con l’accumulo del materiale nel doppio strato lipidico. Uno dei due strati, quello più esterno, inizia a formare la vescicola che poi si staccherà completamente.

Componente glucidica

Nella membrana abbiamo anche una componente glucidica che può essere associata al doppio strato fosfolipidico. Le cariche negative sono dal lato citosolico della membrana. Molte proteine transmembrana hanno solo funzioni recettoriali. Se la membrana è molto selettiva, abbiamo bisogno di un sistema di riconoscimento extracellulare in modo che quando avviene il riconoscimento si avvii una certa via metabolica o un certo processo interno alla cellula. Questi recettori fanno parte del corredo proteico della membrana.

Trasporto di membrana e meccanismi di selettività

Le membrane separano l’interno della cellula dall’esterno e dividono anche i vari comparti cellulari interni. Per mantenere le particelle con cariche positive o negative all’interno della membrana, ci servono dei meccanismi che possono essere attivi o passivi. Possiamo provare a far attraversare la membrana a varie molecole di diverse dimensioni e caratteristiche.

L’idrofobicità e le piccole dimensioni fanno sì che le molecole entrano ed escano dalla membrana senza difficoltà. Se le molecole sono piccole ma non idrofobiche, hanno bisogno di altri sistemi per attraversare la membrana e non basta la permeabilità della membrana. Se le molecole sono polari ma più grandi, diffondono ma con una velocità più lenta. Se prendo delle specie ioniche, piccole ma con una carica, non passano attraverso il doppio strato fosfolipidico. Maggiore è la permeabilità della molecola, maggiore è la velocità con la quale le molecole attraversano la membrana biologica.

Nella membrana ci sono dei riconoscitori cellulari che legano la particella che deve attraversare la membrana. Il recettore (trasportatore) si apre e ingloba la molecola che poi rilascia dall’altra parte della membrana aprendosi. Un canale invece è una porta aperta o chiusa. I canali per essere aperti devono riconoscere la specie della molecola per la quale sono specifici fino a quando la concentrazione della specie da un lato e l’altro sarà in equilibrio. Questo vale anche per i trasportatori. Entrambi sono di natura proteica e sono immersi nel doppio strato fosfolipidico. Questo rappresenta il trasporto passivo perché si muovono secondo il gradiente di concentrazione, cioè dal lato dove ce n’è di più a quello dove ce n’è di meno. Si può andare anche contro gradiente di concentrazione (da dove ce n’è meno a dove ce n’è di più) ma serve energia (ATP), si consuma ATP.

Nelle piante alcuni sistemi funzionano senza l’uso di ATP ma grazie alle radiazioni luminose. Il trasporto passivo prevede dei cambi conformazionali del trasportatore indotti dal legame della molecola con la parte proteica. I cambi avvengono solo se ho la specificità delle molecola e del recettore.

Il sistema di trasporto se trasporta una specie si chiama uniporto. Se trasporta due specie dipende: se viaggiano entrambe contemporaneamente nella stessa direzione avrò un simporto, se viaggiano contemporaneamente in direzioni opposte avrò un antiporto. Se la diffusione è semplice la velocità tenderà ad aumentare. Se ho un trasportatore ho un massimo di velocità.

A volte c’è il potenziale di membrana, cioè io posso misurare una differenza di potenziale tra un lato e l’altro della membrana. Per il trasporto passivo, quando vi è un potenziale di membrana in gioco, bisogna considerare anche la concentrazione di carica. La velocità di ingresso viene influenzata dalla distribuzione di cariche negative e positive. Questo è il gradiente elettrico chimico.

Affinità e trasporto del glucosio

Per capire se il soluto entra per diffusione o con trasportatori aumento progressivamente la quantità della specie che sto studiando:

• Se la specie entra per diffusione più ne metto più ne entra, relazione lineare tra velocità e la concentrazione di soluto.
• Se la specie entra con i trasportatori, fino ad un certo punto la relazione è lineare, poi la velocità è limitata dalla quantità di trasportatori, quindi l'andamento tende a un valore di velocità (V_max) che indica l'esistenza di un sistema di trasportatori.

Cambia la concentrazione del substrato alla quale ottengo V_max. Per facilitare l'analisi osservo qual è la concentrazione alla quale ottengo 1/2 V_max. Questo andamento della velocità al variare della concentrazione indica il concetto di affinità. La costante di affinità ci dà indicazione sulla quantità di substrato necessaria per raggiunge 1/2 V_max. Maggiore è il suo valore, minore è l’affinità di quella specie se quella, a parità di trasportatore, raggiunge 1/2 V_max a concentrazione minore.

Posso usare un sistema di simporto accoppiando il trasporto del glucosio con il trasporto di qualcosa presente in grande quantità all'esterno, e poco all'interno, come lo ione sodio. Questa situazione si verifica nelle cellule dell’epitelio intestinale che cercano di assorbire dall’intestino. Il citosol ha una carica negativa, quindi il Na⁺ ha una maggior tendenza ad entrare nella cellula. Quindi il simporto con il Sodio permette l'ingresso contro gradiente del glucosio. Questo sistema di trasporto viene attivato dalla tendenza del sodio ad entrare nella cellula, trascinando con sé il glucosio. Il glucosio viene rilasciato secondo gradiente di concentrazione nei fluidi extracellulari.

Con il tempo perderei la differenza di [Na⁺], pertanto il sodio introdotto va pompato fuori attivamente contro gradiente, grazie ad una pompa sodio/potassio che consuma ATP. Un sistema simile è la pompa Ca²⁺ che raccoglie il calcio nel REL contro gradiente.

Energia e trasporto attivo

Per fornire energia che poi verrà consumata sotto forma di ATP, uno dei modi è avere il trasportatore la cui variazione di conformazione è indotta a spese di consumo di ATP. Si consuma ATP per forzare il sistema a lavorare contro gradiente. Nelle piante non si usa ATP ma la radiazione luminosa. Un sistema di trasporto può essere un sistema complesso, ovvero formato da più complessi proteici. Questi complessi sono componenti che regolano l’attività della proteina stessa.

All’interno delle nostre cellule, come abbiamo detto diverse volte, vi sono diversi compartimenti. Per esempio, nel reticolo sarcoplasmatico, vi è una grossa concentrazione di calcio, mentre nel citosol vi è una bassa concentrazione dello stesso ione. Ci sono delle modalità che regolano l’uscita del calcio dal reticolo sarcoplasmatico, oltre a queste regolazioni vi sono anche dei meccanismi che regolano il gradiente di concentrazione fra i diversi compartimenti. Se non ci fossero questi meccanismi, si andrebbero a perdere tutte le caratteristiche della cellula.

Invece, quando c’è bisogno di trasportare calcio da una zona a bassa concentrazione, ad una zona ad alta concentrazione c’è bisogno di compiere un lavoro attivo, ovvero con consumo di ATP. Questo trasporto muoverà gli ioni calcio. In tutti questi sistemi di trasporto vi è una modificazione nella conformazione delle proteine.

Quindi i vari step di questo meccanismo sono i seguenti:

• Coesione tra lo ione calcio e la proteina trasportatrice.
• Una volta legata, grazie ad un meccanismo che attua il consumo di ATP per fosforilare il dominio della proteina su un amminoacido specifico.
• Variazione della conformazione della proteina per il rilascio.
• Rilascio nel comparto desiderato dello ione calcio.

Un esempio di trasporto attivo con consumo di ATP indiretto è dato dalla pompa Na-K. La sua funzione è quella di ripristinare le condizioni iniziali, ovvero porta fuori il sodio che è entrato con il trasportatore del glucosio e porta dentro il potassio per ripristinare il gradiente elettrico. Nel fare questo lavoro consuma ATP. Questa pompa può essere inibita da farmaci, che si legano a questo sito nel quale il sodio e potassio devono passare.

Concentrazione fisiologica

Se la concentrazione fisiologica, tra l’esterno e l’interno della membrana, non viene mantenuta tale si possono creare diverse situazioni:

• In una situazione isotonica si avrà la normalità, ovvero quando le pressioni...