Biochimica

Architettura delle cellule

Le cellule possono essere procariotiche (più piccole e antiche) o eucariotiche (più evolute). Le eucariotiche hanno un nucleo e sono delimitate da una membrana, possono essere inoltre animali o vegetali. Gli organismi viventi sono sistemi aperti che mantengono l’omeostasi (capacità di autoregolazione), sono composti da cellule, che hanno un ciclo vitale e che mantengono il metabolismo, che possono crescere, adattarsi al loro ambiente, rispondere agli stimoli, riprodursi ed evolversi. Secondo questa definizione i virus, come per esempio i batteriofagi, non sono esseri viventi infatti hanno il DNA circolare a singolo filamento: per riprodursi hanno bisogno dell’apparato biosintetico di un altro organismo cioè non sono in grado di riprodursi autonomamente.

Domini della vita

Esistono tre livelli di organizzazione della vita ovvero 3 domini: batteri, archea e eucaria. I domini classificano gli organismi che sono composti da organelli ovvero componenti con funzionalità diverse (es. ribosomi che sintetizzano le proteine). Per studiare le cellule bisogna rompere la membrana in modo cauto (aumentando la temperatura) così da ottenere una soluzione torbida non ideale dal punto di vista termodinamico (concentrazione diversa dall’attività) detta citosol le cui componenti all’interno si separano per centrifugazione.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica: doppio strato fosfolipidico resistente e flessibile, selettivamente permeabile a molte sostanze. Include proteine di membrana con funzioni di trasporto, trasduzione di segnale e enzimatiche. La parte esterna è polare (quella a contatto con l’ambiente acquoso) e anche quella di confine con l’interno mentre quella centrale è apolare.

Cellule eucariotiche e procariotiche

La cellula eucariotica contiene nucleo, ribosomi, apparato del Golgi, reticolo endoplasmatico (assente nelle procariotiche), membrana plasmatica, mitocondri, citoplasma e lisosoma. Il reticolo endoplasmatico può essere liscio o rugoso (contenuto nella doppia membrana), quello rugoso è costituito da ribosomi nella parte esterna che controllano la modificazione post-traduzionale delle proteine, dopodiché le proteine vanno nel reticolo endoplasmatico liscio in cui avvengono alcune vie biosintetiche come la sintesi dei lipidi. Nell’apparato del Golgi c’è la glicosidazione dei residui peptidici o modificazione post-traduzionale. Tutto questo processo genera dei prodotti di secrezione espulsi con l’esocitosi.

La cellula procariotica contiene una capsula, i ribosomi, il DNA, la parete cellulare, la membrana plasmatica e il citoplasma. Vediamo meglio alcune differenze:

Cellule vegetali e animali

Le cellule vegetali e animali: hanno entrambe un nucleo ma quelle vegetali hanno cloroplasti con la membrana citosolica a doppio strato lipidico, ricoperte da parete cellulare rinforzata con cellulosa (ciò rende le cellule vegetali molto più resistenti di quelle animali). I mitocondri sono la centrale energetica della cellula nonché sede della produzione di ATP, possiedono due membrane, una esterna e una interna ripiegata in creste; contengono quindi due componenti: uno spazio intermembrana e una matrice. Gli enzimi del metabolismo ossidativo sono presenti sia sulla membrana interna sia nella matrice, i mitocondri sono sede della respirazione cellulare con dimensioni 1-2μ, contengono DNA, RNA e ribosomi necessari per la sintesi di alcune proteine specifiche della membrana mitocondriale interna. La membrana esterna dei mitocondri è costellata di pori che permettono lo scambio con l’esterno, la membrana interna è la sede della fosforilazione ossidativa.

Classificazione degli organismi

Gli organismi possono essere classificati in base alla loro fonte di energia (se luce solare o composti chimici ossidabili) e in base alla loro fonte di combustibile per la sintesi del materiale cellulare in fototrofi (autotrofi ed eterotrofi) e chemotrofi (litotrofi e organotrofici).

Classi di biomolecole

• Amminoacidi e proteine
• Zuccheri e polisaccaridi
• Lipidi e membrane
• Nucleotidi e acidi nucleici

Amminoacidi

Sono componenti di proteine, ormoni, neurotrasmettitori e intermedi metabolici. Conosciamo oltre 700 amminoacidi naturali ma solo 20 sono presenti nelle proteine. Contengono un gruppo amminico, un gruppo carbossilico e oltre 20 diverse funzionalità presenti in R.

Questa struttura si trova esclusivamente in fase gassosa, perché di solito avviene una reazione intramolecolare di tautomerizzazione che porterà alla formazione di una specie caratteristica detta specie isoelettrica o zwitterionica. Infatti, in acqua la struttura riportata sopra non esiste per diverse ragioni:

• A differenza delle ammine alifatiche e degli acidi carbossilici, gli amminoacidi sono solidi cristallini, non volatili che fondono a temperature elevate (100-300 °C).
• Sono insolubili in solventi apolari (benzene, etere…) ma sono invece solubili in acqua.
• Le loro soluzioni acquose si comportano come soluzioni di sostanze ad alto momento dipolare.
• Le costanti di acidità sono più alte rispetto a quelle degli acidi carbossilici semplici (Ka=10^-2 M) e quelle di basicità più basse rispetto alle ammine alifatiche (Kb=10^-4 M).

Tutte queste considerazioni ci portano a formulare una struttura ionica dipolare del tipo:

Classificazione

I gruppi apolari rendono la superficie della proteina adatta a solubilizzarsi nella parte apolare della membrana cellulare. La prolina ha la catena R legata al gruppo amminoacidico quindi è un’ammina secondaria non primaria come negli altri (imminoacido). Fenilalanina, tirosina e triptofano presentano gruppi R aromatici. Tra quelli polari la serina ha un gruppo R che è un alcol primario mentre la treonina ha un gruppo R che è un alcol secondario. Tra quelli carichi positivamente l’istidina è semi-aromatica ed è riconoscibile nel gruppo R l’anello dell’imidazolo. Tra quelli carichi negativamente il glutammato è un acido più debole dell’aspartato.

Gli amminoacidi sono chirali (tranne la glicina) ma soltanto la serie L è presente nelle proteine (infatti il sistema D/L è preferito a quello R/S). In particolare, l’isoleucina e la treonina hanno 2 centri chirali e quindi 4 possibili stereoisomeri ma solo 1 è presente negli amminoacidi naturali. In generale gli amminoacidi della serie D sono anche R tranne che per la L-cisteina che corrisponde alla R-cisteina.

Il meteorite Murchison che cadde nel 1969 in Australia contiene alcuni degli amminoacidi comuni presenti nelle proteine in miscele racemiche delle configurazioni L e D.

Per lo studio degli amminoacidi si usano spettrofotometri che sfruttano la legge di Lambert-Beer infatti tutti i saggi di analisi biologica sfruttano tale legge: lo spettro di assorbimento dipende dall’ambiente in cui si trova il cromoforo e dalla denaturazione o non denaturazione della proteina, che è un processo reversibile.

Proprietà acido-base

Possiamo distinguere due forme di amminoacidi: una non ionica e una zwitterionica. Le costanti di acidità sono più alte rispetto agli acidi carbossilici semplici, quindi sono più acidi, (2,2) quelle di basicità più basse rispetto alle ammine alifatiche semplici (4,4). Questo fatto è dovuto all’effetto induttivo dovuto cioè alla presenza di due sostituenti (amminico e carbossilico) entrambi elettronattrattori. Il grado di ionizzazione di un amminoacido dipende dal pH, il valore di pH a cui è massima la concentrazione della specie isoelettrica (zwitterionica) è detto punto isoelettrico e si calcola a partire dalle due costanti di dissociazione che prendono parte all’equilibrio.

• pI > pH: forma cationica
• pI = pH: forma zwitterionica
• pI < pH: forma anionica

Cioè quando il pH è minore del valore in cui ho la specie zwitterionica avrò la specie cationica, quando è maggiore avrò quella anionica. Nel grafico si vede l’andamento della concentrazione delle varie specie col pH per la glicina: a pH bassi prevale la forma cationica, man mano che aumenta il pH inizia a esserci una certa percentuale di forma zwitterionica finché, in prossimità del pK1=2.34, le due specie sono presenti in uguali quantità; aumentando ulteriormente il pH prevale la forma zwitterionica finché in prossimità del pK2=9.60 la forma zwitterionica e anionica sono in uguali quantità, aumentando ancora il pH prevale la forma anionica. Questo discorso vale per tutti gli amminoacidi neutri, infatti per quelli acidi o basici (tirosina, cisteina, lisina, arginina, istidina, ac. Aspartico e glutammico) c’è un calcolo a parte infatti non abbiamo o più 3 specie ma 4: si titola il gruppo carbossilico, poi la catena R e infine il gruppo amminico protonato (caso del glutammato), in questo caso scelgo le due pK agli estremi del multiequilibrio (a destra e sinistra della forma zwitterionica).

Elettroforesi

Una tecnica utilizzata in passato prevedeva la rottura dei legami peptidici (idrolizzabili) in condizioni estreme (100°C in acqua acidificata con HCl 1M) e si attendeva il tempo necessario al completamento del processo da cui si otteneva una miscela degli amminoacidi che componevano quella proteina. Successivamente si analizza per elettroforesi cioè ponendo su un foglio di cellulosa contenente la fase stazionaria (acqua tamponata a un certo pH) la miscela di amminoacidi, agli estremi del foglio di cellulosa un anodo e un catodo applicano un campo elettrico che fa muovere gli amminoacidi attraverso la fase stazionaria perché attratti dal polo di segno opposto rispetto alla propria carica e cioè in base al proprio pI: per esempio se pI > pH l’amminoacido sarà in forma cationica e quindi attratto dall’anodo. Amminoacidi diversi possono essere anche distinti in base alla propria velocità di migrazione se si muovono entrambi verso lo stesso polo. Alcuni amminoacidi sono prodotti biologicamente ma non sono componenti di proteine, ad esempio l’acido amminobutirrico che è un neurotrasmettitore, l’istidina che è un importante ormone nella risposta immunitaria, la dopamina che è anch’essa un neurotrasmettitore e un importante ormone, la tirosina o ormone tiroideo e una serie di proteine derivate come l’adrenalina che deriva dalla fenilalanina per una serie di reazioni di idrossilazione.

Modificazione post-traduzionale

Modificazione post-traduzionale di alcuni amminoacidi: durante la sintesi proteica avviene la copiatura di un filamento di DNA dall’mRNA e la sua trascrizione. Dopo la sintesi proteica anche prima che la proteina vada verso il fenomeno di folding intervengono degli enzimi modificanti che agiscono sulla struttura proteica per diverse utilità, tali modificazioni possono avvenire post-traduzionalmente. Per esempio, l’ubiquitazione è un tipo di modificazione che avviene sulla lisina per segnalare che la proteina vecchia dev’essere degradata.

Il legame peptidico

La lunghezza del legame C-N è di circa 1,32 A a metà fra un legame singolo (1,99 A) e uno doppio (1,27 A). Il legame peptidico è planare perché c’è risonanza nell’ibridazione del carbonio. L’energia di torsione è di 85 KJ/mol. Il legame peptidico è un ibrido fra due forme limite di risonanza:

In condizioni biologiche la rotazione intorno a questo legame è proibita dal punto di vista energetico. L’atomo di ossigeno carbonilico ha carica negativa parziale e l’azoto ammidico ha una parziale carica positiva generando così un dipolo elettrico nell’ibrido di risonanza. Virtualmente tutti i legami peptidici nelle proteine sono presenti nella configurazione trans. La catena polipeptidica presenta una direzionalità da sinistra (N-terminale) a destra (C-terminale).

Le proteine

Le proteine si dividono in semplici e coniugate ovvero contenenti un gruppo prostetico (non proteico) di vario tipo, in base al tipo di cofattore hanno diversa specificità:

• Lipidi: lipoproteine
• Carboidrati: glicoproteine
• Fosfato: fosfoproteine
• Heme: emoproteine
• Nucleotidi flavinici: flavoproteine
• Metalli: metalloproteine

Le proteine sono soggetti macromolecolari che hanno dimensioni varie, alcune proteine sono costituite da un'unica catena polipeptidica, altre da diverse catene che possono essere uguali fra loro o diverse e legate covalentemente o non covalentemente. Le proteine si dividono in semplici (catena polipeptidica nuda che poi si riavvolge nella sua configurazione nativa) o coniugate (proteine semplici associate in modo covalente o non covalente a un cofattore di varia natura chimica che globalmente si chiama gruppo prostetico).

I peptidi e i polipeptidi biologicamente attivi si trovano in una vasta gamma di dimensioni, non si possono fare quindi generalizzazioni per i loro pesi molecolari in relazione alla funzionalità. I peptidi presenti in natura variano in lunghezza da due a molte migliaia di residui di amminoacidi, anche i peptidi più piccoli possono avere effetti biologicamente importanti. Un dipeptide importante è l’aspartame (ac. aspartico + fenilalanina modificata con il suo metil-estere), un dolcificante non saccaridico sostituto dello zucchero ma 200 volte più dolce e con un trascurabile apporto calorico. Si sta studiando la possibilità di un utilizzo continuo perché il gruppo -OCH3 terminale viene idrolizzato dagli enzimi esterasi nel nostro corpo generando il dipeptide e metanolo, tale residuo è dunque molto dannoso perché viene ossidato a formaldeide (neurotossico). Inoltre, introdurre questo dipeptide in un soggetto che soffre di fenilchetonuria (assenza di fenilalanina idrossilasi) equivale ad introdurre fenilalanina che accumulandosi produce gravi sintomi (ritardo mentale).

Tra i peptidi più importanti il glutatione (GSH) è un antiossidante che previene i danni alle componenti cellulari (membrane) causati da specie reattive dell’ossigeno come i radicali liberi e i perossidi. È costituito da cisteina e glicina, legate da un normale legame peptidico, e glutammato, che invece è legato alla cisteina con un legame isopeptidico tra il gruppo carbossilico della catena laterale del glutammato (γ-carbossilico) e il gruppo α-amminico della cisteina. Il GSH è un antiossidante: cioè si ossida e catalizza la reazione verso la formazione di acqua a partire da perossido di idrogeno piuttosto che verso la formazione del radicale. GSH entra poi nel ciclo del pentoso-fosfato.

[I coenzimi della nicotinammide sono coinvolti in molte reazioni redox. Sono navette di elettroni che traportano come ioni idruro (NAD⁺ si riduce a NADH). NAD è un dinucleotide (base azotata + zucchero a 5 termini + residuo acido fosforico esterificato). Il ribosio è legato con un legame N-glicosidico alla porzione imidazolica dell’adenina e il gruppo fosforico è esterificato al carbonio 5’ della matrice ribosidica. Un derivato del NAD⁺ è NADP⁺ in cui l’ossidrile del ribosio legato all’adenina è esterificato col fosfato e si trova nelle vie anaboliche, mentre i NAD nelle vie cataboliche.]

Poiché il nostro corpo è un ambiente estremamente ossidato può succedere che un elettrone si leghi a una molecola di ossigeno formando un radicale superossido che può dismutare in acqua ossigenata e ossigeno molecolare (c’è addirittura un enzima che fa ciò) molto dannoso perché è instabile e attacca la membrana fosfolipidica. Dall’acqua ossigenata un altro elettrone può generare OH radicalico (pericolosissimo). Può intervenire un enzima chiamato glutatione perossidasi che usando gli elettroni forma il substrato glutatione ossidato, riducendo l’acqua ossigenata che quindi non diventa OH radicalico. Il glutatione viene ridotto poi dal NADPH (vedi figura).

L’ossitocina e vasopressina sono due ormoni prodotti dalla ghiandola pituitaria sono oligopeptidi che contengono grossomodo gli stessi amminoacidi ma in posizione 8 l’ossitocina ha una leucina (apolare), la vasopressina ha arginina (carico), questa carica in più genera effetti biologici diversi: l’ossitocina agisce su muscolatura liscia dell’utero (contrazione durante parto), la vasopressina aumenta il riassorbimento d’acqua dal sangue al rene (concentra metaboliti nel sangue e aumenta pressione arteriosa).

Insulina

Insulina: eterodimero covalente (ha due catene differenti legate intercatena covalentemente da due ponti disolfuro inter/intra catena); è un enzima che abbassa il livello di glucosio nel sangue. È formato da due catene: la catena A è quella più corta (20 amminoacidi) il cui residuo N-terminale è la glicina e quello C-terminale è asparagina, la catena B è più lunga (30 amminoacidi). Nella catena A c’è un ponte disolfuro intracatena, tra le catene A e B ci sono due ponti disolfuro intercatena.

Il meccanismo della maturazione prevede l’attuazione/deattuazione della proteina all’interno del corpo umano, nel caso dell’insulina partiamo dalla preproinsulina:

• Traduzione e traslocazione nel reticolo endoplasmatico
• Folding, ossidazione e taglio del peptide segnale, si ottiene così la proinsulina che però ancora non ha l’attività biologica