Biochimica

Digestione

Apparato digerente

Apparato digerente: Demolizione chimica e meccanica, assorbimento di molecole semplici ed escrezione di scarti. Essendo formato da diversi distretti, sono fondamentali i movimenti peristaltici.

Digestione dei glucidi

• Amido: Glucosio legato da legami alfa 1-4 glicosidici, con una sola estremità riducente e molte estremità non riducenti (a queste si legano molte amilasi).
• Cellulosa: Legami β che vengono eliminati totalmente con le feci.
• Intolleranza al lattosio: Mancanza della lattasi, con richiamo osmotico di acqua, causando dissenteria, disidratazione e formazione di H₂.

La digestione delle proteine e dei lipidi inizia propriamente a livello gastrico e intestinale rispettivamente, sebbene la prima azione meccanica avvenga comunque a livello del cavo orale.

Assorbimento

- GLUT 2: Mucosa intestinale, tubulo renale, β pancreas
- GLUT 4: Muscolo scheletrico (funziona solo con insulina)
- GLUT 5: Intestino, ma per il fruttosio.

Trasporto di tipo attivo secondario (orletto a spazzola) + trasporto passivo. Una volta in circolo, i glucidi determinano un aumento della glicemia (60-110 mg/dl) immediatamente dopo i pasti.

• Fase post-prandiale
• Fase glicogenetica: Scissione del glicogeno
• Fase gluconeogenetica: Formazione del glucosio a partire da altri precursori

L’insulina è responsabile del ripristino dei livelli basali di glicemia immediatamente dopo i pasti, tanto che le sue concentrazioni sono direttamente proporzionali a quelle del glucosio. È fondamentale che i livelli di glucosio in circolo rimangano il più costanti possibile, per garantire il funzionamento di SNC e eritrociti.

• Diabete: Glicemia > 125 mg/dl; può determinare anche la glicazione delle proteine (anche Hb) > necrosi
• Glicosuria: Glucosio nelle urine poiché la glicemia è troppo alta

NB: Indice glicemico = Δ glicemia per alimento X / Δ glicemia per il glucosio x 100

• Carico glicemico = Indice glicemico x quantità dei carboidrati / 100

L’entrata di glucosio nelle cellule avviene per lo più grazie a:

• GLUT 2 = Epatocita, eritrocita, SNC
• GLUT 4 = Tessuto adiposo e muscolo; è necessaria ATP + insulina per l’esposizione sulla membrana

Appena internalizzato il glucosio, viene fosforilato a Glucosio-6P: solo in questo modo possiamo mantenere un gradiente di concentrazione tale da favorire una continua entrata di glucosio. La reazione è irreversibile!

• Esochinasi: Tutte le cellule; Km bassa e molto affine per il glucosio => si satura velocemente ed è inibita dal prodotto.
• Glucochinasi: Solo nel fegato; specifica per il glucosio ma con Km più alta (meno affine). Non è inibita dal prodotto e la sua produzione è indotta dall’insulina:
  • Il glucosio stacca una proteina regolatrice dalla glucochinasi, immagazzinata nel nucleo => citosol
  • L’insulina induce un ulteriore produzione di glucochinasi

Il fatto che una parte dell’enzima sia già presente velocizza il processo.

Glicolisi

• Primo processo ossidativo che permette di produrre energia.
• Avviene in tutte le cellule, nel citosol.
• Di per sé, non ha bisogno di ossigeno.
• 10 reazioni: Fase di spesa energetica + fase di produzione energetica.
• Glicolisi anaerobica: Il piruvato viene ridotto a lattato per riossidare NADH in NAD+.

Bilancio energetico = 2 ATP nette; fondamentali per eritrociti e muscoli.

• Glicolisi aerobia: Il piruvato verrà poi trasformato in acetil-CoA => ciclo di Krebs. I NADH vengono trasportati nel mitocondrio con lo shuttle del G3P - fosfodiossiacetone.

Bilancio energetico = 2 ATP + 2NADH (che divengono FADH₂ nel mitocondrio) = 2 ATP + 4ATP = 6 ATP.

Regolazione

1. Fruttosio-6P —> Fruttosio-1,6P = Catalizzata dalla fosfofruttochinasi 1 con consumo di ATP. [ATP] bassa si lega al sito catalitico e fa avvenire la reazione; alte [ATP] fungono da inibitore allosterico.

   Il Fru-2,6P a livello epatico è il più potente attivatore della fosfofruttochinasi 1 => + glicolisi. È possibile ottenere Fru-6P grazie alla Fru-2,6-bifosfatasi.

   • Insulina = Attiva una protein fosfatasi => desfosforilazione del complesso => fosfofruttochinasi 2.
   • Glucagone => cAMP e PKA => fosforilazione del complesso => Fru-2,6-bifosfatasi.
2. PEP —> piruvato = Catalizzata dalla piruvato chinasi.
   • + Insulina e Fru-1,6-bifosfato
   • — Glucagone (agisce tramite una PKA), ATP, acetil-CoA, acidi grassi, alanina, citrato

Glicogeno

Glicogeno = Glucosio legati da legami alfa-1,4 glicosidici + ramificazioni alfa-1,6 glicosidici = un’estremità riducente + tante estremità non riducenti, a cui si legano gli enzimi = contenuto in granuli insieme agli enzimi deputati al suo metabolismo.

Sintesi

L’enzima ramificante stacca le ultime 6-7 molecole di GLU dalla catena lineare per attaccarle da un’altra parte creando una ramificazione e un’altra estremità riducente su cui potrà agire di nuovo la glicogenosintetasi. Sintesi de novo del glucosio = primer glicogenina (proteina con residui tirosinici) sui cui viene aggiunta le prime 7 molecole di glucosio => il glicogeno ha un core proteico.

Degradazione

• Glicogeno fosforilasi + [piridossal fosfato] => distacco di singole molecole di Glucosio-1P (fino a 4 Glu dalla ramificazione)
• Enzima deramificante: Stacca le ultime 3 molecole di Glu che riposiziona a cavallo della catena lineare = stacca il Glu legato tramite alfa-1,6 => Glucosio

Regolazione

• Effettori allosterici:
  • Sintesi del glicogeno = ATP e glucosio-6P
  • Degradazione = AMP e Ca++ (muscolo)
• Modificazioni covalenti:
  • Fosforilazione = Degradazione <= Glucagone e adrenalina (cAMP dipendente -> PKA)
  • Defosforilazione = Sintesi <= Insulina (regola entrata e fosforilazione del GLU)

GSK3, se attivo, fosforila la glicogeno sintetasi (inattivandola) dopo l’azione di CKII.

• CKII (caseina chinasi 1): Fosforila una serina specifica (sito di priming)
• GSK3: Si può ora posizionare in maniera corretta e funzionare; se inattiva, la fosforilazione a livello di una Ser estermina un cambiamento conformazionale dell’enzima che non sarà più in grado di legarsi alla glicogeno sintetasi e fosforilarla

PP1 (proteina fosfatasi 1) può essere legata:

• GM: L’insulina promuove l’attivazione di questo residuo => PP1 attiva
• Inibitore: Adrenalina -> PKA che fosforila in due punti GM; si stacca e lascia il posto a un inibitore

La glicogeno fosforilasi è inibita da [GLU] elevate: l’enzima espone i due residui fosforilati (che la attivano) a cui si lega il glucosio => cambiamento conformazionale e inattivazione. Di contro può essere in forma attiva anche se non fosforilata per effetto degli effettori allosterici.

Tutti questi processi di signaling si caratterizzano per un’amplificazione del segnale.

Ciclo muscolo-fegato o ciclo di Cori

Il lattato, prodotto dalla glicolisi anaerobia a livello muscolare, viene processato ed eliminato dal fegato. Non si crea un ciclo futile tra l’entrata e l’uscita del glucosio dal momento che:

• Gli enzimi agiscono in sedi diverse (RE ≠ citosol)
• Il Glu-6P regola gli scambi = ad alte concentrazioni facilita la GLU-6 fosfatasi e quindi la sua uscita

Ciclo dei pentoso-fosfati

• Produzione di zuccheri pentoso => sintesi di nucleotidi e di acidi nucleici
• Produzione di NADPH => biosintesi degli acidi grassi e riduzione del glutatione (Hb a Fe++)

Dove? Citosol; infatti non ha uno scopo energetico.

1. Fase ossidativa = Irreversibile, porta alla produzione di ribosio.
2. Fase non ossidativa = Si riottiene GLU-6P, soprattutto nel momento in cui non è necessario ribosio.

Favismo: Deficit della Glu-6P deidrogenasi => ridotta produzione di NADPH => più metaglobina Fe⁺⁺⁺.

Altri glucidi importanti

• Galattosio: Il meccanismo di assorbimento è identico a quello del glucosio. È un epimero del glucosio a livello di C4.
  • Galattosemia: Mancanza della galattosio-1P-uridil trasferasi; accumulo generalizzato di Gal che non viene più assorbito => ipergalattosemia = glicazione delle proteine in circolo.
• Fruttosio: Entrando nel processo glicolitico dopo il passaggio Fru-6P —> Fru-1,6P, controllato dalla fosfofruttochinasi, questo metabolismo non è sotto il controllo dell’insulina. Viene metabolizzato a livello epatico.
  • La fruttochinasi ha una Km molto bassa => molto più veloce ed efficiente della glucochinasi; le due reazioni competono quindi per ATP.
• Acido glucuronico: Forma ossidata del glucosio in C6; la reazione è però assicurata dal legame con UDP. È usato nei processi di sintesi dei polisaccaridi e dell’eparina, coinvolto nei processi di detossificazione epatica.

Decarbossilazione ossidativa

A carico del piruvato, un importante crocevia metabolico:

• Glicolisi aerobia, dal glucosio 6-P
• Glicolisi anaerobia, dal lattato
• Transaminazione di alanina, serina, cisteina
• Biosintesi degli acidi grassi, dal malato e dall’ossalacetato

Sono tutte reazioni reversibili => il piruvato può dare origine a tutti i composti sopra citati. Dove? Nel citoplasma.

Una volta prodotto, il piruvato può essere internalizzato nel mitocondrio dove può:

1. Decarbossialzione ossidativa => acetil-CoA
2. Produzione di ossalacetato => gluconeogenesi

Queste sono reazioni irreversibili.

Trasporto del piruvato nel mitocondrio

• Due subunità
• In competizione con la conversione in lattato
• Regolazione: trascrizionale -> post-trascrizionale -> post-traslazionale (acetilazione) -> controllo allosterico

L’enzima piruvico deidrogenasi (PDH)

• E1 = Piruvico deidrogenasi [tiamina pirofosfato - TPP]; specifica
• E2 = Diidro-lipoil-trasacetilasi [lipoato]; struttura dell’enzima
• E3 = Diidro-lipoil-deidrogenasi [flavoproteina]; aspecifica comune a tutte le alfa-chetoacido deidrogenasi
• Subunità regolatorie

Il vantaggio del complesso multi-enzimatico è quello di non perdere intermedi durante il processo.

Coenzimi di PDH

• TPP = Derivato della vit B1
• Lipoato = Ancorato alla Lys di E2 con legame amminico formando una sorta di braccio mobile
• Coenzima A = Attivazione di tutte le molecole di natura lipidica; SH - acido pantotenico - adenosina

NB: Legami ad alta energia: vi sono legami con energia di idrolisi molto alta, energia che può essere sfruttata per far avvenire reazioni ad esse accoppiate (es produzione di ATP da PEP -> piruvato). Dal momento che il costo finale è 0, l’andamento della reazione dipende solo dalle concentrazioni si substrati e reagenti.

Reazione

1. Caricamento del piruvato su TPP di E1 e liberazione di CO₂; si forma idrossietil-TPP.
2. Trasferimento dell’acetile sul lipoato di E2, in corrispondenza del ponte disolfuro che lo lega alla lisina. Il legame si riduce, l’acetile viene caricato sulla Lys e poi sul CoA-SH.
3. E3 riossida il ponte disolfuro della Lys producendo NADH.

Regolazione

• Subunità regolatrici = Fosforilate -> inattive; defosforilate -> attive
• Inibizione da prodotto (sull’enzima attivo defosforilato) = I prodotti sono anche inibitori allosterici mentre i reagenti effettori allosterici; competono tra loro per il sito allosterico => dipende dalla concentrazione
• Rapporto NADH/NAD = Nel mitocondrio è sempre elevato, al contrario del citoplasma
  • Adeguato apporto di ossigeno e basso NADH/NAD => attivazione PDH e ciclo di Krebs
  • Scarso apporto di ossigeno => aumento NADH/NAD mitocondriale => inibizione PDH

=> Patologie mitocondriali: Alto NADH/NAD -> inibizione PDH -> produzione lattato -> acidosi
=> Una minor attività della PDH può anche essere determinata da carenza vit B1 o mutazione E1.

Ciclo di Krebs

• Via ciclica che si autosostiene per cui l’ossidazione di acetil-CoA è indipendente da [ossalacetato].
• Completa ossidazione del glucosio => produzione di 2 CO₂.
• Processo ossidativo che avviene in condizioni aerobiche nella matrice mitocondriale.

1. Ossalacetato -> citrato: Spostata verso il citrato poiché si libera molta energia dal legame tioestereo.
2. Citrato (III) —deidratazione-> Cis-aconitato —idratazione—> Isocitrato (II). È una reazione stereoselettiva.
3. Isocitrato —ossidazione—> [ossalsuccinato] —decarbossilazione—> alfa-chetoglutarato.
4. Catalizzata da un complesso enzimatico identico a quello della PDH.

Al termine di queste reazioni abbiamo ottenuto la completa ossidazione del glucosio. A questo punto seguono altre reazioni con lo scopo di ripristinare l’ossalacetato. I due C liberati come CO₂ non sono esattamente quelli dell’acetil-CoA.

5. Reazione a ping pong: Pi viene progressivamente trasferito su C carbonilico -> Hys -> GDP => GTP. Il GTP (=> gluconeogenesi) viene poi convertito ad ATP in una fosforilazione a livello del substrato.
6. La Succinato-deidrogenasi è il complesso II della catena respiratoria => coenzima Q.
7. Reversibile e dipende solo dal rapporto substrato/prodotto.
8. Reversibile.

Bilancio energetico

• Bilancio reazioni esoergoniche e endoergoniche: ΔG = -13 kcal/mol => calore.
• In realtà l’energia liberata è di più poiché vengono prodotti 3 NADH + FADH₂ + GTP => ΔG = -207 kcal/mol; se considerassimo il sistema come indipendente dal contesto cellulare (in provetta): ΔG = -228 kcal/mol.
• Riusciamo però a tradurne solo 70 kcal/mol in ATP => la resa energetica della catena fosforilativa è del 33%.
• Per ogni acetil-CoA ossidato otteniamo 10 ATP.

Se considerassimo tutto il processo di ossidazione del glucosio: sebbene il numero di ATP prodotte dai due processi sia molto differente, la resa energetica non è così diversa.

Regolazione

A carico delle tappe irreversibili:

• Citrato sintasi = Regolata dalla concentrazione di substrati e prodotti:
• Due decarbossilazioni (Isocitrato e alfa-chetoglutarato DH) = Carica elettrica come ADP/ATP o NAD/NADH.

Il ciclo di Krebs è però anche una via anfibolica importante, con una serie di reazioni anaplerotiche:

• Citrato = Trasferimento dell’acetil-CoA (prodotto solo nel mitocondrio) nel citoplasma => sintesi dei lipidi.
• Alfa-chetoglutarato = Alfa-chetoacido corrispondente al glutammato.
• Succinil-CoA <= propionil-CoA (β-ox dispari); è l’unico modo in cui un acido grasso può generare glucosio => precursore dell’anello porfirinico => il GTP che si libera può essere usato nella gluconeogenesi, proteine G, sintesi proteica.
• Fumarato <=> Aspartato, fenilalanina, tirosina <=> ciclo dell’urea; è quindi in grado di attraversare la MMI.
• Malato = Sistema di trasporto per l’ossalacetato attraverso la MMI.
• Ossalacetato => Alfa-chetoacido corrispondente all’aspartato => PEP e gluconeogenesi.

Oltre a questo, il ciclo è correlato alle esigenze energetiche della cellula:

• Iperglicemia e benessere energetico = Accumulo del citrato -> trasferimento nel citoplasma. Così l’energia in eccesso viene accumulata come acidi grassi. Avviene in fegato e tessuto adiposo
• L’ossalacetato potrebbe essere riconvertito in malato e tornare nel mitocondrio. (Non esiste un trasportatore per l’ossalacetato sulla MMI)
• Ipoglicemia = Ossalacetato/malato —> PEP => gluconeogenesi e glucosio, dal piruvato (mitocondrio).

Sintesi dell’ossalacetato

L’enzima è formato da 4 subunità identiche; la sua attivazione dipende da acetil-CoA che lo attiva. È in competizione con piruvico deidrogenasi PDH = produzione di glucosio da substrati non glucidici (aminoacidi).

Gluconeogenesi

Quando? In condizioni di digiuno prolungato, quando abbiamo già finito le scorte di glicogeno.

Processo opposto alla glicolisi, fatta eccezione per le tre tappe irreversibili:

1. Piruvato —> ossalacetato —> PEP. Nella glicolisi: PEP + ADP —> piruvato + ATP.
2. Fruttosio-1,6-bifosfato —> Fruttosio-6P ad opera di una Fru-1,6-P fosfatasi. Nella glicolisi: Fruttosio-6P + ATP —> fruttosio-1,6-bifosfato + ADP; catalizzata dalla fosfofruttochinasi.
3. Glucosio-6P —> Glucosio + Pi ad opera della Glucosio-6P fosfatasi (fegato). Nella glicolisi e non solo la fosforilazione del glucosio era catalizzata dalla glucochinasi (fegato) e dalla esochinasi.

La Glu-6P fosfatasi si trova a livello della membrana del RE, soprattutto a livello di fegato, intestino, reni. Avviene se: non c’è glucosio, molto PEP, ciclo di Krebs e fosforilazione ossidativa funzionanti = AA glucogenetici.

Substrati

• Alanina —> Piruvato
• Aspartato —> Ossalacetato
• Glutammato, prolina, ornitina, istidina —> Alfa-chetoglutarato -> ossalacetato
• Treonina, isoleucina, valina, metionina —> Succinato => ossalacetato
• Glicerolo (lisi dei trigliceridi) —> Gliceraldeide-3P

Regolazione

• - ADP / AMP, NAD+, insulina = scarsità energetica o abbondanza glucidica
• + ATP, NADH, acetil-CoA, citrato, acidi grassi, acido lattico, cAMP (glucagone) = benessere energetico ma scarsità di glucidi.

Lipidi

Digestione dei lipidi

I lipidi che introduciamo sono per lo più trigliceridi (90%), colesterolo, fosfolipidi. La loro digestione inizia a livello intestinale, sebbene ci siano piccole modifiche anche nel cavo orale e nello stomaco. La colipasi ha la funzione di attivare la lipasi pancreatica, formando un complesso.