Biochimica

Introduzione

Legami chimici

Legami covalenti: C-C

Legami non covalenti:

• Interazioni elettrostatiche
• Legami o ponti idrogeno
• Interazioni idrofobiche
• Interazioni di van der Waals: due atomi privi di carica se vicini l'uno all'altro influenzano le loro nuvole elettroniche. Le variazioni casuali della posizione degli elettroni possono indurre un dipolo elettrico transitorio che induce a sua volta la formazione di un altro dipolo elettrico ma opposto a questo: si creano così nei punti di interazione massima e repulsione minima le interazioni di van der Waals e ciascun atomo ha un proprio raggio di van der Waals.

Tutti questi legami esercitano un effetto cumulativo che può essere molto significativo e addirittura superiore rispetto al semplice legame covalente. La stabilità della reazione di legame varia esponenzialmente con l'energia di legame: per separare due molecole associate tramite interazioni multiple deboli, occorre romperle tutte nello stesso momento e dato che si assume che sia impossibile, la struttura maggiormente stabile è quella in cui il numero di interazioni deboli è il più elevato.

Acqua: la componente principale delle cellule

Tutte le caratteristiche strutturali e funzionali delle cellule sono adattate alle proprietà fisiche e chimiche dell'acqua, quindi le molecole di acqua e i prodotti della sua ionizzazione (H⁺ ed OH^-) influenzano profondamente la struttura, la reattività e le proprietà di tutti i costituenti cellulari.

La disposizione tetraedrica consente a ogni molecola, in particolare negli orbitali dell'ossigeno, di formare legami a idrogeno con altre 4 molecole vicine. L'osmosi è il passaggio dell'acqua attraverso una membrana semipermeabile sotto la spinta della pressione osmotica. Le molecole di acqua sono polari e si ionizzano: quando un acido debole viene sciolto in H₂O, la sua ionizzazione arricchisce la soluzione di [H⁺], mentre le basi deboli invece consumano [H⁺] ionizzandosi.

La concentrazione totale di ioni H⁺ prodotti è misurabile sperimentalmente ed espressa dal pH della soluzione. La posizione all'equilibrio in una qualsiasi reazione chimica è espressa dalla costante di equilibrio K_eq, che per l'H₂O a una temperatura di 25°C è: pH = [H⁺] [OH^-] = 55.5M [H₂O]

Quando [H⁺] = [OH^-] = 10^-7 M, come nell'acqua allo stato puro, allora si ha un pH neutro; le soluzioni alcaline hanno pH >7 (basiche), mentre le soluzioni acide hanno pH <7. L'equazione di Henderson-Hesselbach permette di calcolare il valore del pK_a conoscendo il pH della soluzione e il rapporto molare tra il donatore e l'accettore di protoni:

In generale il pH biologico cellulare è 7.4.

Gruppi funzionali

Aminoacidi e proteine

Le proteine sono il prodotto del flusso dell'informazione genetica e sono macromolecole polimeri di amminoacidi in cui ogni residuo amminoacidico è unito a quello vicino da uno specifico legame covalente. Il termine "residuo" sottolinea la perdita degli elementi di una molecola di acqua quando un amminoacido si unisce a un altro.

Il numero e l'ordine dei 20 aa che costituiscono le proteine dà origine a infinite combinazioni di tipi di proteine diverse; le proteine sono le macromolecole più abbondanti e sono anche le più funzionali.

Caratteristiche di un amminoacido

1°. C: centro chirale legato a 4 gruppi atomici differenti: il gruppo carbossilico COOH, l'idrogeno H, il gruppo amminico NH₂ e la catena laterale R, il quale si differenzia per dimensione, struttura e carica e quindi influenza anche la solubilità dell'amminoacido in acqua.

Questi gruppi possono disporsi nello spazio in 2 diverse conformazioni dette enantiomeri, immagini speculari non sovrapponibili e otticamente attive:

• L-Ala = ruota la luce polarizzata verso sinistra
• D-Ala = ruota la luce polarizzata verso destra

Tutti gli aa delle proteine sono L-aa. Questa convenzione descrive la configurazione nello spazio degli stereoisomeri, formula in prospettiva, in cui i legami cuneiformi solidi si proiettano sopra il piano del foglio, mentre i legami indicati con un cuneo tratteggiato puntano sotto il piano del foglio.

2°. Ogni amminoacido ha una curva di titolazione acido-base che comporta l'aggiunta o la rimozione graduale di protoni a gruppi funzionali ionizzabili (carbossilico e amminico). Il pH caratteristico al quale la carica netta è zero è detto punto isoelettrico o pH isoelettrico = pI. Più il pH della molecola aa sarà lontano dal suo pI, maggiore sarà la carica netta della molecola

A pH fisiologico, l'amminoacido è uno zwitterione, ovvero non esisteranno le forme –COOH o –NH₂ ma quelle ionizzate.

Classificazione degli amminoacidi in base alle loro catene laterali R

Ci sono 5 classi principali distinte dalla polarità di R, ovvero dalla tendenza di interagire con l'acqua a pH fisiologico.

• Gruppi alifatici, non polari
• Gruppi aromatici
• Gruppi carichi positivamente
• Gruppi carichi negativamente
• Gruppi polari non carichi

I gruppi sulfidrici –SH di amminoacidi come la Cys e la Met, possono ossidare spontaneamente formando il ponte disolfuro, un legame covalente tra i due zolfi.

Oltre ai 20 amminoacidi comuni che si riscontrano nelle proteine ci sono anche altri amminoacidi importanti come la selenocisteina e la pirrolisina, oppure amminoacidi che non costituiscono proteine ma che funzionano come neurotrasmettitori come l'istamina, l'eparina, la tiroxina:

Gli aminoacidi si legano quindi a formare peptidi tramite il legame ammidico chiamato legame peptidico che si viene a formare tra il gruppo carbossilico e il gruppo amminico attraverso deidratazione (reazione di condensazione):

È grazie a una sequenza di questi legami che si vengono a costruire i dipeptidi, i tripeptidi, gli oligopeptidi e poi le catene lineari delle proteine.

In un peptide il residuo amminoacidico con cui termina la catena polipeptidica, il residuo amminoterminale (N-terminale) ha il gruppo amminico libero, mentre il residuo all'altra estremità ha un gruppo carbossilico libero ed è per questo che è detto residuo carbossiterminale (C-terminale).

Il legame peptidico è sempre in posizione TRANS, perché l'ossigeno carbossilico possiede una parziale carica negativa mentre l'azoto ammidico una parziale carica positiva, che genera un dipolo elettrico rigido, sullo stesso piano e planare. La forma CIS non sarebbe possibile infatti perché le catene laterali degli amminoacidi creerebbero ingombro sterico: solo la Pro lo può consentire!

Il legame è stabilizzato per risonanza al fine di avere un basso contenuto energetico ed essere stabile. La sequenza di una proteina si legge dall'estremità amminoterminale verso quella carbossiterminale. Tutte le proteine hanno lo scheletro del polipeptide uguale formato dai C e dai piani rigidi del legame peptidico.

Struttura delle proteine

È grazie alla conformazione proteica, che essa stessa svolge le sue determinate funzioni.

Struttura primaria

Descrive la sequenza di amminoacidi che compongono la proteina. È l'informazione più semplice e importante perché permette il confronto tra proteine evidenziando omologie e differenze: ciascun tipo di proteina ha una specifica sequenza amminoacidica e se si altera la struttura primaria di una proteina si altera anche la sua funzione.

Ad esempio proteine con la stessa funzione in animali diversi, come le mioglobine, nell'uomo e nel capodoglio presentano entrambe una sequenza di 153 aa, ma di cui solo 25 aa sono diversi, infine 13 aa dei quali sono sostituzioni conservative, ovvero sono dovute al corso dell'evoluzione e alla specializzazione degli organismi.

Quindi le proteine aventi la stessa funzione e con sequenza aa in comune, si deduce facciano parte della stessa famiglia di proteine aventi un antenato in comune: sono proteine omologhe.

D'altra parte bisogna tener conto che si osservano le variazioni di amminoacidi (1aa = tripletta di DNA) che sono accettabili per la vita.

Struttura secondaria

Descrive unicamente la posizione di 1aa di 1 catena rispetto all'amminoacido che lo segue o che lo precede (un tratto breve). Si riferisce a un tratto o a un segmento polipeptidico della proteina e descrive l'organizzazione spaziale della catena principale/scheletro senza dover tenere conto delle catene laterali. La disposizione spaziale dipende dalla capacità di rotazione dei legami, ma poiché il legame peptidico è polare e abbastanza rigido, ciò limita considerevolmente il numero delle conformazioni che la catena polipeptidica può assumere e gli unici legami che potranno ruotare si avranno tra:

• Y [psi] = angolo determinato da: C_α - C = O
• Φ [phi] = angolo determinato da: C_α - N_α

In linea di principio Φ e Y possono avere qualsiasi valore compreso tra -180 e +180, ma molti valori non sono permessi a causa degli ingombri sterici tra gli atomi dello scheletro carbonioso: i valori permessi sono riportati nel grafico di Ramachandran in cui i valori degli angoli sono riportati in funzione di Φ e Y.

Una struttura secondaria regolare si ha quando un angolo Φ e Y rimane invariato all'interno del segmento della proteina, ma solo poche strutture hanno questa stabilità:

• Random coil = struttura irregolare e casuale in cui non è possibile individuare una sequenza di valori degli angoli
• α-elica = (phi = -57° psi = -47°) è la più semplice organizzazione (regular coil) che una catena polipeptidica possa assumere tenendo conto della planarità dei legami peptidici, in cui lo scheletro carbonioso si avvolge attorno a un asse immaginario che attraversa longitudinalmente la parte centrale della spirale, mentre i gruppi R dei residui amminoacidici sporgono all'infuori dello scheletro elicoidale.

L'unità che si ripete a ogni giro dell'elica è detta passo dell'elica = 5.4Å: 1Å descrive la distanza intratomica ed è approssimabile alla lunghezza di un legame C-H = 0.1nm. Ogni giro dell'elica inoltre contiene 3.6 residui. L'α-elica possiede un vantaggio termodinamico per cui quasi tutte le proteine la preferiscono, infatti in questa la disposizione dei legami a idrogeno è la migliore possibile. La struttura è stabilizzata dai legami a idrogeno che intercorrono tra (N-H) l'atomo di idrogeno legato all'azoto elettronegativo di un legame peptidico e l'atomo di ossigeno carbonilico (C=O) del quarto amminoacido successivo nella direzione dell'estremità amminica (in posizione +4). Ciascun giro di elica quindi è legato ai giri adiacenti da 3/4 legami a idrogeno che conferiscono stabilità alla struttura.

In linea di principio infine gli L-aa che si trovano in natura possono formare eliche sinistrorse e destrorse (regola della mano), ma le eliche sinistrorse sono in teoria meno stabili e non sono state osservate nelle proteine.

Non tutte le proteine la preferiscono:

• Pro e Gly sono incompatibili perché l'elica si romperebbe oppure la renderebbero troppo dinamica
• Radicali liberi di aa che ostacolano la formazione (ingombro)
• Aa carichi elettricamente la destabilizzerebbero a causa della troppa vicinanza degli R o per la troppa repulsione
• R idrofobici instaurerebbero interazioni idrofobiche (aa aromatici)

β-Conformazione = (phi = -119° psi = +113°) lo scheletro della catena si estende in una conformazione a zig zag, grazie alla quale le catene possono essere disposte l'una accanto all'altra a formare una struttura che prende il nome di foglietto β, che presenta una serie di pieghettature e in cui i legami a idrogeno si formano tra regioni adiacenti delle catene polipeptidiche. Anche in questo caso le catene laterali sono disposte esternamente o sotto o sopra.

Le catene polipeptidiche adiacenti di un foglietto possono essere o parallele o antiparallele, possono avere cioè lo stesso orientamento ("corrono nello stesso verso") o un orientamento opposto ("corrono in verso opposto") del legame carbamidico NH-CO. È anche possibile anche se scarsamente frequente che avvenga l'affiancamento di foglietti provenienti da polipeptidi diversi.

β-Ripiegamenti = ripiegamenti che si trovano nelle proteine globulari a 180° di una sequenza di 4 residui amminoacidici che conferisce la forma a "U" e si verifica solo in presenza in posizione +2 o +3 di Pro o Gly. Sono stabilizzati dai legami a idrogeno tra 1° e 4° residuo.

Struttura terziaria

Descrive la posizione nello spazio di tutta la proteina, di tutti gli atomi, quindi si considerano anche le catene laterali R. È la struttura che ci dà l'idea delle proteine, poiché tiene conto delle relazioni "a lungo raggio" della sequenza amminoacidica. I segmenti della catena polipeptidica vengono mantenuti nelle loro caratteristiche posizioni tipiche della struttura terziaria tramite diversi tipi di interazioni deboli e talora anche tramite legami covalenti, come ponti disolfuro che si instaurano tra segmenti diversi di una proteina. Altri tipi di interazioni che la stabilizzano sono interazioni elettrostatiche, interazioni van der Waals e interazioni idrofobiche. La forma terziaria più classica è la proteina globulare di forma compatta, mentre la proteina filamentosa è costituita da un filamento lungo ed è molto semplice della globulare in generale.

La perdita della struttura tridimensionale terziaria porta alla denaturazione della proteina, che rompe tutte le interazioni che la stabilizzano: può essere dovuta a reagenti chimici, alle alte temperature o a concentrazioni ioniche maggiori. Nell'esperimento di Anfinsen si denatura e rinatura successivamente delle ribonucleasi A: la proteina denaturata in urea con agente riducente (β-mercaptoetanolo), con la rottura dei 4 ponti disolfuro degli 8 residui di Cys e scindendo le interazioni idrofobiche, permette di notare che la proteina perde il suo potere catalitico. Quindi allontanando l'urea e il riducente, la proteina riacquista la struttura terziaria spontaneamente: si dimostra quindi che pur essendo complessa la struttura terziaria dipende comunque dalla struttura primaria della sequenza degli aa.

Nelle cellule infine esistono delle proteine dette chaperonine che sono in grado di aiutare le altre proteine ad assumere la propria conformazione terziaria accelerando il processo.

Struttura quaternaria

Descrive un livello di organizzazione superiore (nello spazio) strutturale solo per quelle proteine costituite da più subunità polipeptidiche (es. emoglobina). Le interazioni tra le subunità possono essere di tipo elettrostatico, ponti idrogeno, van der Waals e anche ponti disolfuro. Considerando questi livelli strutturali diventa conveniente classificare le proteine secondo le funzioni strutturali e le proprietà, in 2 classi: proteine fibrose o filamentose, aventi catene polipeptidiche disposte in lunghi fasci o foglietti, e proteine globulari, che hanno invece catene polipeptidiche ripiegate e assumono forme sferiche.

Le proteine fibrose sono costituite in gran parte da un unico tipo di struttura secondaria e la struttura terziaria è relativamente semplice, mentre le proteine globulari contengono più tipi di struttura secondaria.

Proteine filamentose

Le proteine fibrose hanno proprietà tali da conferire resistenza e/o elasticità alla struttura di cui fanno parte. Tutte sono insolubili in acqua data l'elevata concentrazione di amminoacidi idrofobici sia all'interno sia sulla superficie delle proteine.

α-Cheratina

Si trova solo nei mammiferi dove rappresentano la quasi totalità del peso secco dei capelli, lana, penne, unghie, artigli e corna; è la rappresentante della famiglia di filamenti intermedi nel citoscheletro delle cellule animali. È costituita da circa 300 aa avvolti a formare un'α-elica destrorsa organizzata in una struttura avvolta. Successivamente due α-eliche con la stessa direzionalità, ovvero con gli amminoacidi amminoterminali alla stessa estremità, si avvolgono una sull'altra a formare un superavvolgimento (coiled coil) avente un andamento elicoidale sinistroso che ne aumenta la resistenza. Tale superavvolgimento è possibile grazie agli amminoacidi idrofobici che si trovano in corrispondenza dei punti in cui le superfici delle due eliche si toccano, i cui R si inseriscono l'uno vicino all'altro con un'alleanza perfettamente regolare permettendo un avvicinamento massimo.

Fibroina della seta

È la proteina della seta prodotta da insetti e ragni, avente catene polipeptidiche esclusivamente nella conformazione β, ricche di residui di Ala e Gly (circa 1/2 di aa), che permettono di avvicinare di molto le catene tra loro e di formare un foglietto compatto con le catene R che si integrano perfettamente. La struttura complessiva è stabilizzata da molti legami a idrogeno tra i gruppi peptidici delle catene laterali e dall'ottimizzazione delle interazioni di van der Waals tra i foglietti differenti.

Collagene

È presente nel tessuto connettivo come il tendine, la cartilagine e la matrice organica ossea e si è evoluto per resistere quindi alle tensioni. L'elica del collagene...