Biochimica 4: respirazione cellulare (decarbossilazione del piruvato, ciclo di Krebs, fosforilazione ossidativa)

CICLO DI KREBS

Il ciclo di Krebs o ciclo dell’acido citrico o ciclo degli acidi carbossilici (TCA), è la via

metabolica che l’acetil-CoA, prodotto dalla decarbossilazione del piruvato o da altre vie

metaboliche riguardanti acidi grassi o scheletri carboniosi degli amminoacidi, prende per

produrre grandi quantità di ATP in seguito alla fosforilazione ossidativa mediata dai coenzimi

ridotti prodotti dal ciclo di Krebs stesso.

Il ciclo di Krebs, sostanzialmente, è la produzione di energia sotto forma di coenzimi ridotti

(NADH e FADH₂) tramite ossidazioni e decarbossilazioni a partire da una molecola di citrato; è

per questo che si hanno, come prodotto di scarto, due molecole di CO₂.

Il ciclo di Krebs è chiamato anche ciclo dell’acido citrico poiché quest’ultimo è il primo

intermedio di questa via metabolica. Il citrato si ottiene dalla condensazione del gruppo

acetile (acetato), fornito dall’acetil-CoA, con l’ossalacetato.

Citrato - Il citrato, oltre che fungere da primo intermedio del ciclo di Krebs, è importante

biochimicamente per molte altre cose: esso funge, infatti, anche da fornitore di atomi di C per i

processi biosintetici, oltre che da inibitore della fosfofrutto-chinasi-1 (e quindi della glicolisi) e

da attivatore della biosintesi degli acidi grassi. Esso è anche un importante fornitore di

equivalenti riducenti per reazioni di biosintesi che ne hanno bisogno.

Bilancio netto del ciclo di Krebs - Un giro di ciclo di Krebs produce tre molecole di NADH, una

₂

di FADH e una di GTP. Inoltre, come prodotto di scarto, vengono prodotte due molecole di

CO₂. Partendo da una molecola di glucosio, i giri di ciclo sono due, poiché le molecole di

acetato (proveniente dall’acetil-CoA, che a sua volta proviene dal piruvato) sono due. Così,

avremo 6 NADH, 2 FADH₂, 2 GTP e 4 CO₂.

Tappe del ciclo di Krebs - Essendo un ciclo, il ciclo degli acidi tricarbossilici vede come

substrato della prima tappa il prodotto dell’ultima.

• Nella prima tappa, l’acetato proveniente dall’acetil-CoA si condensa con una molecola di

ossalacetato, prodotto dell’ultima tappa, per formare acido citrico. La reazione è

catalizzata dalla citrato-sintasi. Viene sfruttata una molecola d’acqua e viene liberato il

CoA.

• Nella seconda tappa, il citrato viene isomerizzato in isocitrato dall’enzima aconitasi. La

reazione si svolge attraverso due emireazioni e prevede la produzione di un intermedio

detto cis-aconitato. L’aconitasi, dapprima, toglie un atomo di idrogeno e un gruppo OH

dal citrato, formando appunto cis-aconitato, per poi legarli nuovamente sul cis-aconitato

in maniera invertita, formando isocitrato.

• Nella terza tappa, l’isocitrato viene ossidato e decarbossilato ad α-chetoglutarato (α-

chetoacido coniugato del glutammato). La reazione è catalizzata dall’enzima isocitrato-

deidrogenasi e porta alla produzione di una molecola di CO₂. Da questa tappa deriva la

prima molecola di coenzima ridotto, che può essere NADH o NADPH a seconda

dell’utilità (NADH per produrre energia e NADPH per reazioni di biosintesi).

• Nella quarta tappa, l’α-chetoglutarato viene decarbossilato ossidativamente a

succinil-CoA ad opera dell’enzima α-chetoglutarato-deidrogenasi. La reazione consiste

in un’iniziale decarbossilazione e ossidazione dell’α-chetoglutarato, con liberazione di

₂ ⁺

una molecola di CO e riduzione di NAD a NADH; successivamente, ciò che rimane del

substrato viene condensato con il coenzima-A, attraverso un legame ad alto contenuto

energetico, formando il succinil-CoA.

• Nella quinta tappa, si ha una fosforilazione a livello del substrato: il succinil-CoA viene

scisso in succinato + CoA, con liberazione di energia derivante dal legame succinato-

CoA; l’energia è sfruttata per la fosforilazione accoppiata di una molecola di GDP in

GTP. Tale GTP può essere subito convertito in ATP; l’enzima che catalizza questa

reazione è la succinil-CoA-sintetasi: questo enzima fosforila il succinil-CoA facendo

staccare il CoA e producendo succinil-fosfato; in seguito, il succinil-fosfato si lega

all’enzima e lega nuovamente il fosfato ad esso, staccandosi come succinato (prodotto);

infine, l’enzima fosforila una molecola di GDP a GTP.

• Nella sesta tappa, il succinato viene deidrogenato a fumarato ad opera dell’enzima

succinato-deidrogenasi (quest’ultimo è l’unico enzima del ciclo di Krebs a non essere

situato nella matrice mitocondriale, bensì a livello della sua membrana interna). In

questa reazione, due carboni adiacenti del succinato vengono deidrogenati, e questi H

vengono trasferiti al FAD, con formazione di FADH₂. Il succinato deidrogenato è, ora,

fumarato.

• Nella settima tappa, il fumarato viene idratato, cioè gli viene aggiunta una molecola

d’acqua, e diventa malato. L’enzima che si occupa di catalizzare questa reazione è la

fumarasi.

• Nell’ottava tappa, il malato viene deidrogenato, e si ha la produzione di una molecola di

NADH. Il prodotto di questa tappa non è altro che il substrato della prima tappa:

l’ossalacetato.

Intermedi metabolici del ciclo di Krebs - Alcuni intermedi del ciclo di Krebs possono prendere

altre vie metaboliche e produrre altre molecole importanti.

• Il citrato può essere un importante fornitore di atomi di carbonio o equivalenti riducenti

per reazioni di biosintesi di acidi grassi o steroidi.

• L’ossalacetato può essere transaminato per produrre il suo amminoacido coniugato,

ossia l’aspartato, che poi può essere, a sua volta, complessato ulteriormente per produrre

asparagina. In alternativa, l’ossalacetato può anch’essere decarbossilato per produrre

piruvato o anche fosforilato per produrre fosfoenol-piruvato nella gluconeogenesi.

• L’α-chetoglutarato può essere transaminato a glutammato che poi può divenire

glutammina.

• Il succinil-CoA, oltre che essere scisso a succinato nel ciclo di Krebs, può essere

incanalato nella biosintesi delle porfirine o essere coinvolto nel metabolismo dei corpi

chetonici.

Intermedi limitanti del ciclo di Krebs - In virtù del fatto che alcuni intermedi del ciclo di Krebs

sono utilizzati anche per altri scopi, tali intermedi vengono impoveriti (ne viene diminuita la

concentrazione) e divengono intermedi limitanti. L’esempio più calzante è quello

dell’ossalacetato, il quale, dato che viene utilizzato anche per la produzione di piruvato o di

aspartato e asparagina, cala in quantità e diviene limitante dell’intero ciclo di Krebs, essendo il

substrato della prima tappa: esso fa scendere la soglia di concentrazione di acetil-CoA alla

quale quest’ultimo rappresenta un eccesso. L’eccesso di acetil-CoA che non può prendere la via

del ciclo di Krebs viene incanalato verso la sintesi mitocondriale dei corpi chetonici, altra

importante fonte di energia.

Ricostituzione degli intermedi del ciclo di Krebs - Dall’altro versante, esistono anche delle reazioni

in cui gli intermedi del ciclo di Krebs, quando scarseggiano, vengono ricostituiti a partire da altri

substrati. Esse non sono altro che le reazioni inverse di quelle poc’anzi citate riguardo gli altri

destini di citrato, ossalacetato, α-chetoglutarato e succinil-CoA, ossia, rispettivamente,

degradazione di acidi grassi o steroidi, deaminazione dell’asparagina e poi anche

dell’aspartato o carbossilazione del piruvato e defosforilazione del fosfoenolpiruvato, e

deaminazione della glutammina e poi anche del glutammato.

Piruvato carbossilasi - La carbossilazione del piruvato è catalizzata da un enzima detto piruvato

carbossilasi. La piruvato-carbossilasi è un enzima che richiede, come coenzima, la biotina.

₂

Quest’ultima, in una reazione che richiede ATP come questa, si lega alla CO formando

carbossinil-biotinil-enzima (in questo caso carbossinil-biotinil-piruvato-carbossilasi) per poi

cedere tale gruppo carbossilico all’altro substrato.

Produzione di succinil-CoA - Il succinil-CoA, importante substrato della quinta tappa di

fosforilazione a livello del substrato del ciclo di Krebs, può essere incanalato nel ciclo in un

altro modo oltre che in seguito a decarbossilazione ossidativa dell’α-chetoglutarato. Quest’altro

modo riguarda la β-ossidazione: durante la β-ossidazione gli acidi grassi vengono scissi

attraverso un numero di reazioni pari alla metà - 1 del numero di atomi di C presenti nell’acido

grasso stesso, poiché ogni reazione priva l’acido grasso di due atomi di C sotto forma di acetil-

CoA. Quel “- 1” esiste in virtù del fatto che, una volta rimasti 4 atomi di C, l’ultima reazione

produce due acetil-CoA, quindi il numero di molecole di acetil-CoA prodotte dalla β-ossidazione

è pari, invece, alla metà degli atomi di C dell’acido grasso. Ma cosa c’entra allora il succinil-

CoA? Quando gli atomi di C di un acido grasso sono in numero dispari, l’ultima reazione non

produce due molecole di acetil-CoA, bensì una di acetil-CoA a due atomi di C e una di

propionil-CoA a tre atomi di C. Questo propionil-CoA può essere convertito in metil-malonil-

CoA e, poi, in succinil-CoA pronto ad essere incanalato nel ciclo di Krebs.

Regolazione del ciclo di Krebs - Le reazioni del ciclo di Krebs sono altamente regolate in

maniera complessa:

• la citrato-sintasi, enzima che catalizza la prima tappa di condensazione dell’acetato e

dell’ossalacetato a citrato, è inibita da citrato, succinil-CoA, ATP e NADH, mentre è

stimolata da ADP e NAD⁺;

• l’isocitrato-deidrogenasi, enzima che catalizza la terza tappa di decarbossilazione

ossidativa dell’isocitrato ad α-chetoglutarato, con produzione di una molecola di NADH

o NADPH e di una di CO₂, è inibita da ATP e stimolata da ADP, quindi regolata dal

rapporto ATP/ADP;

• l’α-chetoglutarato-deidrogenasi, enzima che catalizza la quarta tappa di

decarbossilazione ossidativa dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA, con produzione di

una molecola di NADH e di una di CO₂, è inibita da succinil-CoA, NADH e GTP e

stimolata da Ca²⁺; ciò significa che nel muscolo in attività, dove la concentrazione di

Ca²⁺ è elevata, l’attività del ciclo di Krebs è stimolata, essendo necessaria tanta

energia in poco tempo.

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

La fosforilazione ossidativa è l’ultimo step del catabolismo dei glucidi, ma anche di altre

biomolecole che confluiscono nel ciclo di Krebs. La fosforilazione ossidativa consiste nella

produzione di ATP in grandi quantità