biochimica metabolica

Biochimica metabolica

Componenti chimici degli organismi viventi

• Macromolecole biologiche
• Metaboliti (composti a basso peso molecolare) che subiscono continue trasformazioni nei processi biologici

Metabolismo

Metabolismo è l'insieme di processi che permettono di sintetizzare e demolire i componenti chimici.

• Anabolismo → biosintesi (richiede energia)
• Catabolismo → degradazione (rilascia energia)

L'energia nelle cellule

L'energia alle cellule serve per:

• Lavoro meccanico della contrazione muscolare e dei movimenti cellulari
• Trasporto attivo di molecole e ioni
• Sintesi di biomolecole e macromolecole da precursori semplici

Come ottengono l'energia gli organismi

• Organismi chemiotrofi
• Organismi fotosintetici

Sistema

Un sistema (scelto arbitrariamente) è una porzione dell'ambiente:

• Chiuso: non scambia né energia né materia con l'ambiente circostante
• Aperto: scambia energia e materia

Bioenergetica

Ogni sistema contiene una certa quantità di energia detta energia interna (E) che dipende da T, P e V. Si misura in Joule o in calorie (4,1868 J = 1 cal).

L'energia interna può variare se:

• Il sistema cede o acquisisce calore
• Il sistema compie un lavoro sull'ambiente o viceversa

1° principio della termodinamica: l'energia non si crea né si distrugge, ma si trasforma (principio di conservazione dell'energia). Le cellule sono ottimi trasformatori di energia.

Reazioni

• Endoergoniche (endotermiche) richiedono energia
• Esoergoniche (esotermiche) liberano energia e sono spontanee

Entalpia (H)

È il contenuto termico di un sistema e dipende dal numero e dal tipo di legami. ΔH = H prodotti – H reagenti e corrisponde agli scambi di calore.

ΔH = ΔE approssimazione biochimica. H tiene conto solo di Q mentre E anche di W.

Entropia (S)

Misura il grado di disordine di un sistema.

Energia libera di Gibbs (G)

È l'energia che può svolgere un lavoro a T e P costanti, e indica se una reazione è spontanea o no. ΔG = ΔH – TΔS.

• Esoergonica ΔG < 0: H deve diminuire (ΔH < 0) e S deve aumentare (ΔS > 0) (reazione spontanea, direzione da sx a dx)
• Endoergonica ΔG > 0: H aumenta assorbendo calore e S diminuisce diventando più ordinata (reazione non spontanea da dx a sx)

Accoppiamento energetico tra reazioni chimiche

Le reazioni termodinamicamente sfavorevoli con ΔG > 0 vengono accoppiate con reazioni altamente esoergoniche per poter avvenire. Es. fosforilazione del glucosio con pirofosfato (1° reazione della glicolisi) ha ΔG > 0 ma accoppiata con idrolisi dell'ATP con ΔG molto negativo che gli fornisce l'energia può avvenire. GLU + ATP → G6P + ADP.

I sistemi tendono sempre al più basso livello di energia (max disordine)

Es. cubetto di ghiaccio → acqua liquida. H aumenta passando da 0°C a 25°C energia per rompere legami. S aumenta poiché la struttura cristallina del cubetto è più ordinata della pozza d'acqua dove le molecole sono libere di muoversi.

ΔG < 0: la variazione di S prevale su quella di H quindi complessivamente è esoergonica.

Variazione di energia libera standard (ΔG°)

Calcolata a concentrazione 1M=mol/l di prodotti e reagenti, pH 7 e 25°C. Unità di misura j/mol. Serve a confrontare diverse reazioni anche se la concentrazione 1M non è fisiologica. Solo ΔG indica la reale direzione della reazione.

ΔG dipende dalle concentrazioni dei reagenti e dei prodotti.

Reazione all'equilibrio

[R] alta → [P] bassa ΔG1 < 0 nel tempo... [R] diminuisce → [P] aumenta ΔG2 è meno negativo di ΔG1, ad un certo punto... [R] ↔ [P] ΔG3 = 0 (velocità di formazione dei P uguale a quella dei R).

K_eq = [P] / [R]

• Se K_eq > 1 ci sono più P
• Se K_eq = 1 le concentrazioni di P e R sono uguali all'equilibrio
• Se K_eq < 1 ci sono più R

Le reazioni spontanee procedono fino all'equilibrio. Anche una reazione con ΔG°>0 può essere spontanea perché a concentrazioni fisiologiche ΔG reale sarebbe negativo.

Le reazioni spontanee NON sono per forza veloci, anzi sono lentissime quasi incompatibili con la vita perché le molecole sono molto stabili e devono accumulare una certa energia di attivazione per superare la barriera energetica.

Enzimi

Sono biocatalizzatori che non agiscono sul ΔG ma sono in grado di abbassare l'energia di attivazione aumentando la velocità delle reazioni (non vengono consumati durante le reazioni).

• Efficienti: aumentano fino a 10¹⁷ volte la velocità di reazione
• Specifici per ogni substrato (riconoscono pure gli isomeri)
• Regolabili da effettori o variazioni chimico-fisiche in base alle esigenze della cellula

1% degli enzimi sono ribozimi, 99% sono proteine idrosolubili (proteine semplici, glicoproteine, lipoproteine, proteine coniugate). Alcuni enzimi hanno bisogno di una porzione non proteica per agire.

• Apoenzima: enzima senza la sua porzione non proteica
• Oloenzima: complesso apoenzima + porzione non proteica cataliticamente attivo

La porzione non proteica può essere

• Cofattore: ione inorganico di un metallo
• Coenzima: piccola molecola organica di solito derivante da vitamine
• Co-substrati: sono i coenzimi associati all'apoenzima in maniera transitoria
• Gruppi prostetici: sono i coenzimi legati in modo covalente (permanente) all'apoenzima

Tipi di enzimi

• Zimogeno: enzima sintetizzato in forma inattiva (es: pepsinogeno → pepsina)
• Complesso multienzimatico: associazione di enzimi che agiscono in sequenza in una serie di reazioni (catene metaboliche)
• Enzima polifunzionale: contiene più siti attivi sulla stessa catena proteica e può catalizzare più reazioni

Attività enzimatica

La quantità di substrato convertita al minuto (mmol/min) è la misura dell'attività enzimatica. 1 UEI (unità enzimatica internazionale) è l'attività enzimatica che catalizza la trasformazione di 1 mmol di substrato al minuto. L'attività specifica è l'attività enzimatica espressa in mmol/min/mg di proteina.

Sito attivo dell'enzima

È il sito di legame per il substrato, crea un ambiente ideale per favorire la reazione.

Enzimi costitutivi e induttivi

Gli enzimi costitutivi sono permanentemente presenti nella cellula, mentre quelli induttivi compaiono solo al bisogno (presenza del substrato, determinate condizioni fisiologiche).

Induzione/repressione enzimatica

È l'innesco o inibizione della sintesi di un enzima. Regola la quantità di enzima presente modificandone la velocità di sintesi. Certi enzimi sono necessari solo in determinate fasi o condizioni fisiologiche.

Attivazione enzimatica

Aumento dell'attività enzimatica di un enzima già presente nella cellula. È un processo molto più veloce dell'induzione.

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

L'energia di attivazione corrisponde alla differenza di energia tra lo stato basale e lo stato di transizione. La velocità di reazione dipende dal numero di molecole in grado di passare la barriera energetica e raggiungere lo stato di transizione. Se si abbassa l'energia di attivazione, un maggior numero di molecole può superarla.

Meccanismo degli enzimi

Ogni reazione procede attraverso la formazione di intermedi di reazione altamente instabili. La velocità di reazione dipende da quello con energia di attivazione più alta.

Come fanno gli enzimi ad abbassare l'energia di attivazione?

• Gruppi funzionali catalitici dell’enzima formano legami covalenti transitori con l'enzima. Bloccano il substrato nella posizione ottimale e abbassano un po' l'energia libera dello stato intermedio.
• Tra enzima e substrato si formano molte interazioni non covalenti (legami idrogeno, forze di van der Waals, ecc.). L'energia di questi legami è la fonte dell'energia usata dagli enzimi per abbassare l'energia di attivazione. Anche se liberano meno energia rispetto ai legami covalenti, sono molte e complessivamente liberano più energia.

Teoria lock-key (Fisher 1894)

Il substrato si combina con il sito attivo dell'enzima con lo stesso grado di specificità di una chiave con la serratura. Complementarietà preesistente alla formazione del legame.

!!! Se un enzima è troppo complementare al suo substrato rischiano di non staccarsi più.

Teoria dell'adattamento indotto (Koshland 1958)

Il sito attivo assume una forma complementare al substrato solo dopo che si è legato. Complementarietà successiva al legame.

Oggi si crede che il numero massimo di interazioni tra enzima e substrato si abbia nell’intermedio di reazione che è altamente instabile e quindi si trasforma velocemente nel prodotto.

Fattori che influenzano la velocità delle reazioni enzimatiche

1. pH: estremi possono denaturare l'enzima. Il pH ottimale varia a seconda dell'enzima e della regione in cui opera. Con le variazioni di pH posso controllare l'attivazione e regolare gli enzimi.
2. Temperatura: un aumento di temperatura aumenta la velocità di reazione perché aumenta il numero di molecole in grado di superare la barriera energetica. Tuttavia, gli enzimi sono termolabili ad elevate temperature e si denaturano. La temperatura ottimale è quella corporea, 37°C. Applicazioni nella conservazione alimenti (T basse rallentano degradazione) e nella sterilizzazione.
3. Se aumenta la concentrazione degli enzimi, aumenta la velocità di reazione fino a quando tutto il substrato non si è consumato.

Nomenclatura

- Desinenza -INA tiene conto della natura proteica (pepsina, tripsina...)

- Desinenza -ASI in base al substrato (ureasi...)

Sistema EC (enzyme commission) proposto dalla IUBMB basato su:

• Tipo di reazione catalizzata
• Nome del substrato di ciascun enzima

Ogni enzima risulta individuato da 4 numeri: classe, sottoclasse, sottosottoclasse, numero progressivo di ciascun enzima.

Sei classi enzimatiche

1. Ossidoriduttasi (REDOX): catalizzano reazioni di ossidoriduzione con la partecipazione di cofattori come NAD⁺, NADP⁺, FAD.
   • Ossidante
   • Riducente
   • Es: deidrogenasi, ossidasi, reduttasi
2. Transferasi: trasferimento di un gruppo chimico da una specie ad un'altra.
   • Transcarbossilasi, transacilasi, transglicosilasi, transaminasi, transfosforilasi
3. Idrolasi: scissione idrolitica di un legame covalente per aggiunta di una molecola di H₂O.
   • Esterasi, fosfatasi, proteasi
4. Liase: lisi non idrolitica di legami C-C, C-N, C-S. Aggiunta di gruppi ai doppi legami.
   • Es: piruvato decarbossilasi
5. Isomerasi: un solo substrato trasformato in un prodotto di reazione suo isomero.
   • Isomerasi, epimerasi, racemasi, mutasi
6. Ligasi: è l'unica classe che catalizza per reazioni endoergoniche con ΔG>0 grazie all'accoppiamento con reazioni altamente esoergoniche come l'idrolisi di ATP. Formazione di legami covalenti.

Enzimi presenti nel sangue

• Enzimi fisiologicamente presenti nel sangue dove svolgono le loro funzioni.
• Enzimi liberati nel sangue durante il turnover cellulare, non svolgono una funzione fisiologica nel sangue. Alti livelli ematici di questi enzimi non fisiologici possono indicare processi patologici in atto. Es: in condizioni normali ALT (alanina aminotransferasi) è abbondante nel fegato e scarsa nel sangue. Se ALT è molto concentrata a livello plasmatico è segno di un danno epatico.

Isoenzimi

Sono enzimi presenti in forme molecolari diverse che catalizzano la stessa reazione sullo stesso substrato. Es. lattato deidrogenasi (LDH) è un tetramero costituito dalle combinazioni di 2 catene polipeptidiche H e M.

• M₄ (LDH₅) prevalente nel muscolo scheletrico e nel fegato. È in grado di catalizzare le 2 reazioni perché nel muscolo e nel fegato serve sia piruvato che lattato. Se si accumula lattato → crampo.
• H₄ (LDH₁) prevalente nel muscolo cardiaco. Catalizza la reazione solo in un senso lattato → piruvato perché un accumulo di lattato → infarto!!!

• HHHM, HHMM, HMMM: TOT 5 isoforme.
• È un importante mezzo diagnostico:
  • ↑[H₄] ematico = infarto del miocardio
  • ↑[M₄] ematico = epatite

Cinetica enzimatica

Studia la velocità delle reazioni catalizzate da enzimi.

La velocità di reazione V indica:

• L'andamento della formazione di un prodotto o del consumo del reagente in funzione del tempo (mol/L)s^-1
• La variazione della concentrazione molare del reagente o del prodotto nell'unità di tempo M/s

E + S → P

1. V₀ = velocità iniziale stato stazionario. Andamento lineare: [S] e t sono direttamente proporzionali. [E+S] è costante.
2. [S] e V diminuiscono mano a mano che si forma P.
3. S interamente convertito in P. [S] → 0 e V = 0.

La velocità di reazione dipende dalla concentrazione del substrato. Tenendo costante [E]: la V₀ aumenta in modo direttamente proporzionale all'aumentare [S] fino a quando tutto l'enzima è legato al substrato = enzima saturo. Anche se aumento S, la velocità non aumenta più perché non c'è più enzima libero. La reazione ha raggiunto la V_max, cioè tutto l'enzima è complessato con il substrato. Per aumentare ancora la velocità dovrei cambiare la temperatura o aggiungere altro enzima.

Equazione di Michaelis-Menten

Descrive la variazione di velocità al variare della concentrazione del substrato allo stato stazionario. Si assume che: E + S ↔ ES → E + P.

È la reazione più veloce. Reazione più lenta, limita la velocità complessiva. Ogni enzima ha una sua K_m relativa al substrato che riflette l'affinità dell'enzima per il substrato. La curva generata è un'iperbole rettangolare. La V_max è l'asintoto, quindi teoricamente la curva non lo raggiungerà mai. Quando V₀ è esattamente ½ V_max → [S] = K_m, quindi la K_m è la concentrazione del substrato alla quale V₀ = ½V_max.

• K_m piccola → alta affinità. Basta piccola quantità di substrato per emisaturare l'enzima.
• K_m grande → bassa affinità. Ci va grande quantità di substrato per emisaturare l'enzima.

10^-7 < K_m < 10^-1

La K_m può essere usata come parametro per confrontare sia l'affinità di enzimi diversi per uno stesso substrato che l'affinità di un enzima per 2 o più substrati diversi. Es: esochinasi può fosforilare sia fruttosio (K_m = 1,5 mM) che glucosio (K_m = 0,05 mM), ma l'affinità per il glucosio è 30 volte maggiore rispetto a quella per il fruttosio. Quindi fosforilerà il glucosio 30 volte più del fruttosio.

Grafico di Lineweaver-Burk

Serve a stabilire con esattezza la K_m visto che l'iperbole dell'equazione di MM ha un andamento asintotico (non raggiunge mai V_max), la si trasforma in una retta facendo i doppi reciproci.

X=0 rappresenta 1/V_max

Y=0 rappresenta -1/K_m

Efficienza catalitica

K_cat è una costante che misura la velocità del processo catalitico una volta che E-S si è formato. Indica quante molecole di substrato vengono trasformate da 1 enzima in 1s. (non tiene conto dell'affinità)

1/K_cat indica il tempo in secondi richiesto da 1 enzima per trasformare il substrato.

Un altro parametro è il rapporto K_cat/K_m che tiene conto sia dell'efficienza che della specificità dell'enzima.

• K_m mediocre ma K_cat buona → moderatamente efficiente
• K_m buona ma K_cat mediocre → moderatamente efficiente
• K_m mediocre e K_cat mediocre → pochissimo efficiente
• K_m buona e K_cat buona → molto efficiente

Regolazione degli enzimi

Controllo a livello del substrato

Alte concentrazioni di substrato favoriscono la formazione del prodotto, ma anche il prodotto si può legare all'enzima quindi una sua concentrazione elevata impedisce il legame del substrato con l'enzima (il prodotto agisce da inibitore competitivo).

Regolazione a feedback

In una via metabolica l'accumulo di un prodotto intermedio può inibire il primo enzima della catena (feedback negativo).

Modificazione covalente dell'enzima

Alcune molecole (gr. fosforico, acetilico, metilico o intere proteine come ubiquitina) si legano in modo covalente alle catene laterali di residui amminoacidici dell'enzima, attivandolo o inibendolo.

Modificazioni covalenti

• La fosforilazione è la modificazione più diffusa. Le chinasi trasferiscono il fosfato in γ di un nucleotide trifosfato come ATP ad un residuo di Ser, Thr, Tyr o His. Gli enzimi catabolici in genere sono attivati dalla fosforilazione e quelli anabolici ne sono inattivati.
• Trasformazione da zimogeno (proenzima) → enzima attivo grazie a proteasi.

Regolazione allosterica

L'attività degli enzimi allosterici è regolata da effettori allosterici che si legano in modo reversibile (non covalente) ad un sito allosterico o regolatore. Solitamente gli enzimi allosterici sono complessi multimerici con sito attivo e sito allosterico anche su subunità diverse (subunità catalitica e subunità regolatrice). Gli effettori allosterici possono essere negativi o positivi. Il legame con l'effettore allosterico determina modificazioni del sito catalitico rendendolo più o meno attivo.

• Regolazione eteroallosterica quando l'effettore è una molecola diversa dal substrato
• Regolazione omoallosterica quando l'effettore allosterico è il substrato stesso

Gli enzimi soggetti a regolazione omoallosterica NON seguono la cinetica di MM, la curva ha un andamento sigmoide.

Effetto cooperativo

Nel caso della regolazione omoallosterica si può verificare un effetto cooperativo tra i siti attivi: una subunità dell'enzima lega il substrato ma modifica la conformazione delle altre subunità aumentando l'affinità dell'enzima per il substrato.