Biochimica

Le macromolecole

La biochimica si basa sullo studio delle molecole biologiche, anche definite macromolecole per le loro caratteristiche dimensioni. Tra le macromolecole troviamo quattro grosse categorie di composti: i peptidi, i carboidrati, i lipidi e gli acidi nucleici.

I peptidi

Conosciuti anche con il nome di polipeptidi, termine che ne sottolinea la caratteristica di essere composti da una pluralità di unità strutturali, queste molecole sono il risultato del legame di molteplici monomeri chiamati amminoacidi. I 20 amminoacidi sintetizzati a livello cellulare sono molecole che condividono una porzione identica, costituita da un carbonio centrale alfa legato a un idrogeno, un gruppo amminico, un gruppo carbossilico e un gruppo radicalico. La porzione che contraddistingue ciascun amminoacido è responsabile delle caratteristiche chimiche di ciascun amminoacido. Per questo motivo è possibile suddividere gli amminoacidi in categorie che si rifanno alle loro proprietà intrinseche, che non sono uguali per tutti.

Gli amminoacidi si associano tra di loro attraverso la formazione di un legame peptidico, più propriamente definito carbammidico in quanto risulta dall’interazione tra il carbonio del gruppo carbossilico e l’azoto del gruppo amminico, con conseguente formazione di una molecola di H₂O. Questo legame è planare e presenta risonanza nella distribuzione elettronica. Un peptide inizia sempre con la parte ammino terminale e termina con il gruppo carbossilico, questo dipende dalla modalità di sintesi proteica operata dal complesso ribosoma-mRNA-tRNA. Si definisce peptide una molecola che presenta almeno un legame peptidico.

Molecole costituite da più di 50 aa vengono chiamate proteine, quest’ultime hanno la capacità di organizzarsi tridimensionalmente nello spazio. La struttura proteica può essere infatti descritta a più livelli.

Struttura primaria

La struttura primaria è quella che consiste nella semplice successione degli amminoacidi, uno in coda all’altro.

Struttura secondaria

La struttura secondaria è data dalla formazione di legami a idrogeno che si possono instaurare tra aa relativamente vicini, che permangono all’interno della struttura secondaria, che prende il nome di alfa-elica, oppure tra aa distali dando vita alla struttura beta-foglietto. Non tutta la catena amminoacidi si organizza secondo una struttura tridimensionale, queste porzioni apparentemente disorganizzate vengono definite random.

Le zone random si trovano generalmente all’esterno delle proteine e sono responsabili della loro solubilità nel mezzo, in quanto sono le regioni proteiche che prendono contatto diretto con l’ambiente circostante. Inoltre queste zone conferiscono flessibilità alle proteine che possono in questo modo interagire facilmente con altre molecole.

Struttura terziaria

Con il termine struttura terziaria si indica la struttura tridimensionale complessiva dell’intera proteina, che tiene conto delle varie alfa-eliche, beta-foglietti e zone random. Quando le proteine non sono costituite da una singola catena orientata ma da più subunità che interagiscono strettamente tra di loro si indica quest’ultimo tipo di struttura con il termine struttura quaternaria, e rappresenta l’ultimo livello strutturale della proteina.

Per essere attive le proteine devono trovare organizzate allo stato di struttura terziaria e, eventualmente, quaternaria, ma è possibile una regressione verso la struttura primaria, detta anche nativa, in seguito all’opportuno apporto di calore. La porzione che denatura più velocemente e a temperature più basse è la random. Si dice che una proteina denatura quando, a seguito dell’aumento della temperatura, ritorna alla struttura primaria inattiva.

L’ubiquitina è una piccola proteina che si ancora alle proteine che devono andare incontro a degradazione. Poiché solitamente la degradazione proteica è causata da uno shock termico è importante che l’ubiquitina sia resistente alle alte temperature, la sua struttura infatti è organizzata per il 70% in struttura secondaria.

I polisaccaridi

Altra classe di polimeri la cui unità strutturale prende il nome di monosaccaride (glucosio, fruttosio). Il legame instaurato tra due monosaccaridi è detto legame glicosidico. I polisaccaridi di maggiore interesse biologico sono la cellulosa, il glicogeno, l’amido e tutti costituiti dalla stessa unità saccaridica, il glucosio. La differenza tra questi polisaccaridi la ritroviamo a livello dei legami che si instaurano tra le molecole di zucchero.

La cellulosa è contraddistinta da legami non complanari tra il carbonio 1 e il carbonio 4 di due molecole contigue di glucosio. Questo legame è definito beta e non può essere attaccato da enzimi digestivi presenti nel tratto intestinale di molti animali. L’amido e il glicogeno invece sono costituiti da legami planari, alfa-glicosidici, tra gli stessi C1 e C4. La differenza sta nel grado di ramificazione delle due sostanze.

Alcune molecole di glucosio possono formare dei legami a livello del glucosio 6 e dare origine a una ramificazione che verrà poi estesa in una catena lineare da ulteriori legami planari 1-4. Il glicogeno risulta essere più ramificato rispetto all’amido. Questi polisaccaridi sono importanti perché svolgono un ruolo di riserva energetica. Quando si ha un surplus di glucosio, questo viene inglobato in questi polisaccaridi e accumulato in attesa di condizioni di necessità.

I lipidi

Non sono propriamente macromolecole in quanto possiedono dimensioni relativamente piccole rispetto agli altri rappresentanti della categoria. Questa loro caratteristica è dovuta alla loro altra idrofobicità. Troviamo differenti classi di lipidi:

• Trigliceridi, costituiti da una molecola di glicerolo (polare) e tre molecole di acidi grassi (anfipatiche) per formare una molecola completamente idrofobica. Il glicerolo interagisce con la porzione acida degli acidi grassi (gruppo carbossilico) attraverso suoi tre gruppi ossidrili -OH (alcool tetravalente). Il legame che si instaura è un legame diestere che crea un ponte a ossigeno tra i due gruppi funzionali delle due molecole. La funzione dei trigliceridi è anch’essa quella di stoccaggio del glucosio, questa volta però a livello del tessuto adiposo (e non muscolare e epatico come avviene per il glicogeno). Il glucosio in eccesso può infatti essere ossidato a glicerolo.
• Fosfolipidi, simili ai trigliceridi ma il terzo gruppo alcolico del glicerolo forma un legame diestere con un acido fosforico che normalmente lega un’ulteriore molecola. I fosfolipidi non sono completamente idrofobici, la natura della testa della molecola ne conferisce un determinato grado di idrosolubilità. La fosfatidilserina è presente solo nel foglietto interno e non all’esterno. Viene mostrata all’esterno solo come segnale precoce dell’apoptosi. La fosfatidilcolina sta solo nel foglietto esterno.

Cenni sul metabolismo

Tutte le cellule sono in grado di ossidare il glucosio per scopi energetici, questo processo viene chiamato glicolisi. Il prodotto della glicolisi è il piruvato che presenta due destini differenti a seconda delle condizioni di ossigeno. In presenza di ossigeno il piruvato viene ossidato in Acetil-CoA dall’enzima piruvato deidrogenasi, a livello del mitocondrio. Qui avverranno ulteriori ossidazioni con contemporanea produzione di coenzimi pirimidinici ridotti quali FADH₂ (ciclo di Krebs). Queste molecole hanno la capacità di trasferire elettroni a complessi proteici con differenti potenziali redox, in maniera tale che l’accettare finale sia l’ossigeno. Questo comporta la formazione di molecole d’acqua e l’instaurazione di un gradiente protonico che verrà sfruttato per la formazione di ATP.

In assenza di ossigeno il piruvato va incontro a fermentazione e si forma lattato. Quando il glucosio scarseggia nelle cellule viene liberato, sotto forma di glucosio 6P, dalle riserve di glicogeno attraverso la glicogenolisi. Nel fegato, e in parte nel rene, può avvenire un ulteriore processo volto alla produzione di glucosio qualora anche il glicogeno fosse scarso. Si parla della gluconeogenesi che permette la formazione di glucosio a partire da glicerolo, derivante dai trigliceridi, e dal piruvato, derivante dalla catabolismo degli amminoacidi (Il piruvato è un chetoacido che tramite una reazione di transaminazione diventa alanina).

Nell’organismo il glucosio è veicolato dal sangue e può entrare nelle cellule attraverso meccanismi specifici. Solo un determinato organo è in grado di rilasciare glucosio in circolo, il fegato. Attraverso una sua specifica caratteristica metabolica di defosforilare il glucosio 6P è in grado di produrre glucosio libero in grado di fuoriuscire dalle cellule e passare al torrente circolatorio.

La regolazione enzimatica

Nelle vie metaboliche abbiamo la trasformazione di un metabolita iniziale in un metabolita finale attraverso una o più reazioni chimiche che avvengono nelle cellule per la presenza di enzimi, ovvero catalizzatori biologici in grado di abbassare l’energia di attivazione di una reazione rendendola termodinamicamente favorevole. Sappiamo però che ci sono vie metaboliche che funzionano in determinati momenti e non in altri, che sono modulate in base alle necessità e queste non necessariamente sono dettate solo in base alla disponibilità della molecola che costituisce il punto di ingresso nella via metabolica, ci sono sistemi di regolazione più complessi.

Non tutte le tappe di una via metabolica sono sottoposte a regolazione. In ciascuna via metabolica ci sono enzimi più importanti di altri che sono enzimi regolatori, chiamati enzimi pace-maker, che danno il ritmo alla via. Questi enzimi regolatori in molte circostanze catalizzano la prima reazione della via. Questo però non avviene nella glicolisi perché il glucosio 6P (primo prodotto della via) non è un metabolita esclusivo della glicolisi ma può servire anche per altre vie metaboliche. Dunque in questo caso la regolazione è posticipata a un livello nel quale regolando una via enzimatica si controlla solo e soltanto la via glicolitica.

Perché questi enzimi riescono ad essere più importanti e riescono a funzionare da controllori della velocità di flusso dei metaboliti attraverso la via metabolica? Questi enzimi hanno delle caratteristiche proprie che li distinguono dagli altri. Gli enzimi sottoposti a regolazione molto spesso sono enzimi allosterici, ovvero enzimi che non seguono la cinetica di Michaelis Menten.

Quando andiamo a vedere quale è la curva di saturazione di un enzima da parte del proprio substrato in funzione della velocità della reazione catalizzata, sappiamo che tutti gli enzimi che seguono la cinetica di Michaelis Menten hanno una curva che è una iperbole equilatera. La curva è descritta da un parametro K_m, che esprime la concentrazione alla quale la velocità di reazione è metà della massimale.

Se invece di avere nella cellula una concentrazione che è uguale alla concentrazione della Km abbiamo una concentrazione saturante, per esempio 3 millimolare, siamo nella condizione in cui l’enzima in questione lavora alla velocità massima: in quel momento il meccanismo di catalisi è saturato. Per enzimi che rispettano questa cinetica l’unico modo per aumentarne la velocità di reazione dopo il raggiungimento della saturazione è incidere a monte a livello genico controllandone l’espressione. Questi enzimi non hanno regolazioni particolari, il meccanismo di base è un controllo da parte della disponibilità del substrato.

Quando consideriamo una cinetica di un enzima allosterico abbiamo una curva con andamento sigmoide. Questo tipo di curva presenta una inerzia iniziale nel momento in cui si procede ad aumentare le concentrazioni di substrato. La curva spostandosi sull’asse delle X si innalza lentamente. Questa curva ci dice che per piccoli incrementi iniziali a concentrazioni basse di substrato la velocità di catalisi non aumenta molto, questi enzimi hanno una certa latenza iniziale a progredire nella velocità della reazione catalizzata con l’aumento della concentrazione del substrato.

Dopo un determinato valore di concentrazione vediamo che per piccole variazioni di concentrazione la velocità di catalisi aumenta in maniera decisa. Possiamo individuare anche per questa curva il valore di costante che corrispondere alla V_max/2, chiamato K_0.5, cioè la costante che determina il raggiungimento di una velocità che è la metà della massima (costante di affinità di enzimi che non seguono la normale cinetica enzimatica ma sono di tipo allosterico).

Gli enzimi allosterici sono regolati da effettori, positivi o negativi, che legandosi a un sito regolatore comportano delle modifiche conformazioni che ne aumentano o diminuiscono l’affinità per il loro substrato. La curva A è quella che misuriamo in presenza di attivatore allosterico, quando si aggiunge un attivatore la forma della curva varia diventando sempre meno sigmoide e assomigliando ad una iperbole.

In questo grafico abbiamo l’esempio dell’aspartato trans carbamilasi che è un enzima che porta alla sintesi di piridine come la citosina. La curva al centro è la curva di saturazione dell’enzima in presenza del substrato. La curva in alto è in presenza di ATP che funziona da attivatore allosterico di questo enzima perché le piridine vengono sintetizzate quando c’è bisogno di sintesi di acidi nucleici; le purine e le piridine servono per generare nuove molecole di RNA e DNA e quando si sintetizzano gli acidi nucleici la sintesi ha bisogno di entrambe le molecole.

Quindi quando ci sono nella cellula alti livelli di ATP abbiamo il segnale che le purine sono disponibili e abbiamo un altro segnale ovvero che nella cellula è disponibile energia sufficiente a portare avanti un processo biosintetico. Quindi alti livelli di ATP segnalano legandosi direttamente all’aspartato trans carbamilasi la necessità di incrementare la biosintesi delle pirimidine in maniera tale di poter portare avanti un ottimale processo di biosintesi degli acidi nucleici. L’ATP attiva allostericamente l’enzima e questa curva la troviamo spostata verso sinistra.

In maniera opposta lo stesso sito allosterico dell’enzima può legare anche effettori negativi e inibire allostericamente l’enzima. L’esempio è dato dall’inibizione esercitata da CTP, un nucleotide che contiene una citosina, cioè il prodotto finale della via metabolica che è iniziata dall’aspartato trans carbamilasi. Se nella cellula abbiamo alti livelli di CTP non è necessario che l’aspartato trans carbamilasi funzioni al massimo perché le pirimidine ci sono già. L’inibizione allosterica serve per segnalare che il prodotto finale del metabolismo si sta accumulando e la via metabolica deve rallentare. Il segnale si ha attraverso il legame dei CTP al sito allosterico, inibendo allostericamente l’enzima e determinando una forte riduzione dell’affinità dell’enzima nei confronti del substrato. Per abbassare l’affinità dell’enzima nei confronti del substrato l’inibitore allosterico causa lo spostamento della curva verso destra.

I regolatori allosterici non sono molecole che per caso si legano al sito allosterico, ma sono o prodotti terminali della via che segnalano legandosi e inibendo l’enzima che quella via metabolica in quel momento non è necessaria perché i prodotti della via si stanno accumulando, oppure segnalano che scarseggiano i prodotti della via e la via viene attivata.

Il controllo gerarchico instaurato successivamente al controllo allosterico è quello che è relativo a al controllo di un enzima per fosforilazione. Questo tipo di regolazione è determinata da segnalazioni extracellulari a un livello più ampio. Normalmente gli enzimi che sono regolati allostericamente in relazione a segnali intracellulari sono regolati attraverso fosforilazione per segnali esterni.

Un enzima che fosforila si chiama chinasi e normalmente ha bassa specificità, dunque è in grado di fosforilare proteine diverse tra loro.

In cosa consiste la fosforilazione?

Viene utilizzato ATP come donatore di gruppi fosfato e si ha il trasferimento di gruppi fosfato su un ossidrile, cioè alcolico, che appartiene alla catena laterale di un amminoacido che è presente nella proteina. Gli amminoacidi coinvolti sono serina, treonina e tirosina. La tirosina è un amminoacido che può subire l’attacco del gruppo P, ma quasi sempre questo non ha la funzione di regolare la funzionalità di enzimi ma la funzionalità di regolare la capacità che hanno le proteine di interagire le une con le altre.

Se si va ad analizzare dal punto di vista chimico abbiamo la modificazione covalente dell’enzima perché abbiamo la formazione di un legame diestere, un legame covalente stabile. Trattandosi di una risposta a stimoli altamente variabili però questa modifica non può essere permanente. La modifica è reversibile perché nelle cellule non ci sono solo proteine chinasi ma ci sono anche proteine fosfatasi che sono in grado di catalizzare la reazione opposta che comporta il distacco del gruppo P.

Come per gli enzimi allosterici con i rispettivi effettori, anche per la fosforilazione, come la modificazione del sito allosterico, non sappiamo se può influire positivamente o negativamente sull’attività dell’enzima. Solo dopo che la proteina viene cristallizzata e raggiunta...