Biochimica

Proteine

Sono macromolecole biologiche, sono polimeri costituiti da vari amminoacidi uniti tra di loro da legami covalenti. L’amminoacido riportato sopra viene definito α-amminoacido, in quanto il gruppo amminico ed il gruppo carbossilico sono legati allo stesso carbonio (che è il carbonio α). Le proteine sono formate solamente da α-amminoacidi. Generalmente gli amminoacidi non sono mai neutri come in fig. 1, ma i gruppi amminico e carbossilico portano delle cariche come in fig. 2. Gli amminoacidi sono differenziati dalla catena laterale, ovvero dal gruppo R. Gli amminoacidi che poi andranno a formare le proteine sono in totale 20, vengono chiamati con il loro nome, con un’abbreviazione di 3 lettere o anche con un’abbreviazione di una lettera soltanto.

Elenco degli amminoacidi

• Amminoacidi con catena laterale neutra e poco polare
• Amminoacidi con catena laterale polare, ma senza cariche
• Amminoacidi con catena laterale carica positivamente
• Amminoacidi con catena laterale carica negativamente
• Amminoacidi con catena laterale contenente anelli aromatici

Le catene laterali di tutti gli amminoacidi assorbono la luce, quindi sono incolori. La lunghezza d’onda percepita dall’occhio umano è di circa 400-700 Nm. Tutti i carboni α sono dei centri chirali, eccetto il carbonio della glicina, il quale è legato a due H. Tutti i centri chirali negli amminoacidi sono in configurazione S, mentre la cisteina in configurazione R.

Ionizzazione degli amminoacidi

C’è un punto specifico in cui il pH dello zwitterone è neutro, il punto isoelettrico. Il punto isoelettrico è quel punto in cui la carica totale sulla molecola è nulla, nel senso che il tempo che la molecola passa con una carica negativa è uguale al tempo che passa con una carica positiva. È inoltre il punto di mezzo, la media, tra i due pKa (quello del gruppo carbossilico e quello del gruppo amminico). Gli amminoacidi fungono da soluzioni tampone: tendono a mantenere stabile il pH con aggiunte a piccole quantità di acido o di base. Fungono da tampone in due punti generalmente, quando il pH=pKa dell’acido carbossilico o del gruppo amminico, se la catena laterale è carica anche quando pH=pKa della catena laterale.

Le proteine abbiamo detto essere catene polipeptidiche formate da più amminoacidi legati tra di loro. Per descrivere una proteina se ne indica la sequenza amminoacidica. Gli amminoacidi si legano uno all’altro legando il gruppo carbossilico di uno al gruppo amminico dell’altro. Una sequenza amminoacidica ha due estremità: una in cui è libero il gruppo amminico ed una in cui è libero il gruppo carbossilico; generalmente si parte a leggere dall’estremità in cui è libero il gruppo amminico. Il legame ammina-acido carbossilico forma un ammide, per questo il legame è ammidico. In realtà il legame tra due amminoacidi è un particolare tipo di legame ammidico, chiamato legame peptidico. Il legame peptidico è un legame ammidico planare, quindi non può ruotare, questo perché ha un parziale carattere di doppio legame. Lo vediamo dalla formula di risonanza. I legami in cui è coinvolto un carbonio α legato ad altri due amminoacidi possono avere orientamenti reciproci differenti, formando gli angoli ø e ψ. Non tutte le combinazioni tra le ampiezze di questi due angoli sono possibili, per il principio di incompenetrabilità dei corpi (per alcune combinazioni alcuni atomi risulterebbero sovrapposti). I valori di ø e ψ descrivono le rotazioni dei due piani su cui si trovano i due legami peptidici.

Struttura delle proteine

Le proteine hanno una struttura tridimensionale complessa, dettata dai legami non covalenti che si formano tra gli amminoacidi. Riconosciamo generalmente 3 ed a volte 4 strutture.

Struttura primaria

È dovuta solamente alla sequenza amminoacidica.

Struttura secondaria

È dettata dai legami a idrogeno che si formano tra i gruppi peptidici. Riconosciamo due tipologie di struttura secondaria: α-elica e β-foglietto.

α-elica

Se tutti gli amminoacidi presentano la stessa combinazione di ø e ψ si viene a creare una catena a forma di elica, in questo modo la catena viene stabilizzata dalla formazione di legami a idrogeno tra il gruppo amminico di un carbonio α e quello carbossilico di uno 4 posizioni successive. Se ci fosse solamente un legame idrogeno la struttura sarebbe instabile, ma se ne sono presenti diversi la struttura è rinforzata e quindi possiede maggiore stabilità.

Caratteristiche dell’alpha elica

• Il valore dell’angolo ø è circa -50°.
• Il valore dell’angolo ψ è circa -60°.
• La elica è destrogira.
• Diametro dell’elica di circa 6 A (1 Armstrong = 10^-10 m).
• Il passo (di quanto sale l’elica ad ogni giro) è di 5.4 A.

Per ogni giro ci sono 3.6 amminoacidi: questo perché sono volutamente sfasati in modo che il gruppo amminico di uno si trovi in corrispondenza del gruppo carbossilico dell’altro, in modo da formare il legame. Le caratteristiche delle catene laterali possono stabilizzare l’elica e/o creare interazioni con le catene laterali di altre eliche. L’elica si differenzia in base alla proteina trattata: ci sono proteine formate da amminoacidi quali la prolina che possono formare moltissime combinazioni ø-ψ, e quindi è più difficile bloccarle in modo da formare un’elica; altre quali la mioglobina sono costituite da un unico filamento che poi va a formare più eliche (quindi la loro struttura secondaria è formata solamente da alpha-eliche).

β-foglietto

È un’altra tipologia di struttura secondaria, anch’essa tenuta assieme attraverso legami a idrogeno tra amminoacidi anche molto distanti tra di loro. Si formano delle catene con una conformazione a zig-zag, i β-filamenti che non sono stabilizzati da alcun legame a idrogeno. Sono presenti diversi di questi β-filamenti che di per sé non sono stabili, vengono stabilizzati formando legami idrogeno con altri β-filamenti, formando il β-foglietto. I β-filamenti possono essere tra di loro paralleli o antiparalleli (situazione migliore). Come si vede anche dal disegno sopra rimangono sempre alcuni gruppi amminici ed alcuni gruppi carbossilici che non possono formare legami a idrogeno: questo porta ad una minore stabilità foglietto. Per stabilizzarsi il foglietto si chiude a cilindro, formando il barile-β. In generale le proteine contengono sia β-foglietti che α-eliche.

Struttura terziaria

Descrive come le parti si incastrano tra di loro descrivendo forme geometriche nello spazio. Le parti si incastrano attraverso legami non covalenti, quali: ponti idrogeno (esempio 1) che si formano tra le catene laterali (non tra i gruppi coinvolti nei legami peptidici, ponti salini (esempio 2) che si formano tra gruppi carichi (con segno opposto). Possono formarsi inoltre dei legami covalenti (sempre tra le catene laterali): sono legami disolfuro (tra due molecole di S) ottenuto per ossidazione di due residui di cisteina adiacenti. Sono reazioni reversibili in quanto per riduzione posso riottenere le due molecole di cisteina da cui sono partito. I ponti disolfuro si possono creare in ambiente extracitoplasmatico, in quando il citosol ad esempio è un ambiente fortemente riducente. I residui apolari reagiscono tra di loro invece tramite effetto idrofobico. Le catene laterali apolari non reagiscono con l’acqua (proprio in quanto idrofobiche), quindi tendono a stringersi le une alle altre attraverso legami deboli (esempio van der Waals) per formare una struttura definita globulare. Queste regioni idrofobiche si trovano di solito nella parte più interna della molecola, all’esterno troviamo le regioni idrofile (disponibili a creare legami idrogeno).

Formazione della struttura compatta della proteina (struttura terziaria)

Le proteine lo possono fare autonomamente. Il processo viene definito folding:

• Secondo Anfinsen (che analizza la ribonucleasi): una proteina senza la propria forma globulare non è funzionale. Anfinsen afferma che è possibile denaturare una proteina tramite prima riduzione e poi aggiunta di urea (l’urea indebolisce le interazioni deboli, quali ad esempio i ponti solfuro). Rimuovendo i due agenti inseriti andiamo incontro a due casi: Rimuovendo prima l’urea e poi ossidando: autonomamente la ribonucleasi ricreerà la propria struttura tridimensionale ed avrà una funzionalità >90%. Prima ossidando e poi rimuovendo l’urea: verrà a formarsi una struttura tridimensionale definita scrambled (=rimescolata) che avrà invece una funzionalità dell’1-2%.
• Secondo Levinthal: una proteina denaturata contempla circa 10¹⁰⁰ combinazioni disponibili, quindi anche “tentando” 10¹⁴ combinazioni al secondo la proteina per chiudersi potrebbe impiegarci anche 10 ^{anni. Questo è impossibile in quando le proteine per foldarsi impiegano solo poche frazioni di secondo.}

Questo paradosso viene evitato tramite un processo che viene definito collasso idrofobico: si arriva alla struttura terziaria finale attraverso un processo graduale, ogni pezzo che si forma rimane come “già fatto”, ogni volta quindi ci sono meno “tentativi da provare”; si crea un pezzo alla volta che man mano si va a sommare agli altri per dare la struttura finale completa. In provetta e per proteine sufficientemente piccole il folding avviene autonomamente. Nel percorso che porta alla formazione del folding corretto le proteine potrebbero rimanere intrappolate in aggregati irregolari che limitano le possibilità di ottenere il folding corretto. In vivo, nelle cellule, esistono dei sistemi che permettono alle proteine di non aggregarsi irregolarmente nella strada verso il folding, questi vengono chiamati chaperoni. Quando una catena polipeptidica si folda formando un globulo forma un dominio (una regione indipendente); una catena polipeptidica può foldarsi in diverse parti, formando vari globuli (sempre appartenenti alla stessa catena polipeptidica), creando quindi vari domini, ognuno come regione indipendente dalle altre.

Struttura quaternaria

Non è presente sempre. È presente quando più poipeptidi diversi si uniscono tra di loro attraverso legami non covalenti, formando architetture superiori, dando quindi delle geometrie più complesse. Ogni proteina è un monomero, quando più proteine si fondono assieme creano un polimero. Le singole proteine sono chiamate subunità. Le diverse subunità (le diverse catene) possono essere uguali o diverse tra loro; nel caso di catene tutte uguali si parla di monomeri, i monomeri tendono a disporsi in maniera simmetrica.

Mioglobina

È la proteina che conferisce il colore rosso ai muscoli. È costituita da una subunità + un gruppo eme. La sua funzione è di riserva di ossigeno per i muscoli, l’ossigeno si lega al gruppo eme. Il gruppo eme è formato da un ferro Fe al centro, che forma 6 legami di coordinazione, di cui:

• 4 con i 4 anelli tirrolici (anelli aromatici).
• 1 con l’istidina che si trova in basso.
• 1 con l’ossigeno che deve legare.
• 1 è libero.

Il ferro deve essere ad un grado 2 di ossidazione per poter legare la molecola di ossigeno.

Curva di legame

La mioglobina presenta una curva di legame iperbolica per O₂. Il grafico rappresenta la frazione di saturazione dell’eme. Frazione di saturazione: in questo caso è la parte di molecole di mioglobina che si legano a O₂, rispetto al totale delle molecole di mioglobina presenti. Il valore che assume Y(O₂) sarà 0≤Y≤1. Come si vede dal grafico, la saturazione aumentata in maniera iperbolica all’aumentare della concentrazione di ossigeno (in soldoni: più ossigeno c’è, più ossigeno si lega alla Mb). La solubilità di un gas come l’ossigeno non dipende solo dalla sua polarità, quindi dalla sua affinità a sciogliersi in una determinata molecola, ma anche dalla pressione parziale del gas rispetto al liquido. La mioglobina in particolare tende a saturarsi di (a legarsi abbondantemente a) ossigeno a pressioni parziali di ossigeno inferiori alla pressione atmosferica (760 mmHg).

MIOGLOBINA QUINDI A CONDIZIONI NORMALI TENDE A SATURARSI DI OSSIGENO, LEGANDOLO IN MANIERA MOLTO STABILE, PER POI CEDERLO AI MUSCOLI QUANDO QUESTI NE HANNO BISOGNO.

Emoglobina

È la prima proteina di cui si è determinata la struttura tridimensionale. È la proteina che dà il colore al sangue, dà il colore ai globuli rossi. Come la mioglobina la sua funzione è quella di trasportare molecole di ossigeno nel sangue. È circa una mioglobina tetramerica in quanto è formata da 4 monomeri molto simili a quello che costituisce la mioglobina. Le 4 subunità sono molto simili tra di loro ma non uguali, bensì uguali a 2 a 2: 2 subunità α e 2 subunità β, le quali vengono codificate da 2 geni diversi che probabilmente provengono da un progenitore comune. Come la mioglobina lega una molecola di O₂ al gruppo eme, Fe è ad un grado di ossidazione 2; con due differenze:

• Essendoci 4 subunità ci sono 4 gruppi eme, ognuno dei quali è disponibile per legare O₂, quindi può legare fino a 4 molecole di O₂.
• Presenta 2 strutture quaternarie differenti a seconda che sia legata o meno all’ossigeno. La forma ossigenata è la forma R, quella ossigenata è la forma T. Nella forma T c’è una sorta di buco al centro, poi con l’ossigenamento si verifica una sorta di scivolamento delle proteine le une sulle altre che comporta una emoglobina in forma R senza questo buco centrale.

Lo slittamento è possibile in quanto questo porta alla rottura di alcuni legami idrogeno che possono essere facilmente sostituiti da altri simili.

Curva dell’emoglobina

La curva dell’emoglobina è una curva di legame cooperativa per l’O₂. Un legame cooperativo è un legame in cui le prime molecole che si legano aiutano e facilitano il legame di quelle successive, questo legame richiede che la macromolecola abbia più di un sito di legame, perché la cooperatività dipende dalla comunicazione (diretta o indiretta) tra i diversi siti di legame. Le prime molecole che si legano fanno “più fatica”, in quanto non sono in alcun modo aiutate a formare il legame, quelle successive si legano più facilmente in quanto aiutato dalle prime. Per questo motivo la pendenza è inizialmente bassa, per poi alzarsi successivamente.

Allosteria

È la comunicazione che avviene tra i diversi siti di legame presenti nella stessa proteina (è ovviamente necessario che nella proteina siano presenti più di un solo sito di legame). Dal grafico emerge una maggiore affinità per O₂ della mioglobina rispetto all’emoglobina; questo è corretto, in quanto l’emoglobina deve cedere ossigeno alla mioglobina, e per poterlo fare la mioglobina deve avere una maggiore affinità (altrimenti l’emoglobina si terrebbe l’ossigeno). L’emoglobina quindi mentre viaggia nel sangue incontra tessuti periferici con concentrazioni più basse di O₂, ai quali quindi ne cede una parte. Nei polmoni —> emoglobina quasi saturata completamente. Nella periferia —> emoglobina saturata a meno del 50%. Se ho una emoglobina non cooperativa ma con lo stesso indice K (di mezza saturazione) la quantità di ossigeno trasportato è meno, in quanto senza cooperazione ne lega meno quando si trova nei polmoni. In generale: a basse concentrazioni di O₂ l’affinità è molto bassa, aumenta successivamente con l’aumentare della concentrazione di O₂.

Modelli di cooperatività dell’emoglobina

• Modello sequenziale (KNF): il cambiamento di struttura (da ossigenata a non ossigenata) comporta anche un cambiamento dell’affinità per O₂ (come affermato dalla frase sopra in grassetto). Si verifica un cambiamento della struttura terziaria delle 4 subunità, le quali cambiano per gradi: cambia la prima e man mano influenza le altre vicine, facendo aumentare la loro affinità per O₂. In questo modello ci sono quindi 4 diverse costanti di affinità.
• Modello concertato (MWC): in questo caso viene ignorata la forma terziaria. Le due forme R e T esistono sempre (non esistono quindi forme intermedie come nel modello precedente). Senza O₂ l’equilibrio è spostato verso la forma T (il rapporto forma T/forma R è di gran lunga favorevole alla forma T), quindi quando aumenta O₂ questo può legarsi sia a T che a R: preferibilmente si legherebbe ad R in quanto ha più affinità, ma visto che ci sono troppo poche emoglobine R si lega alla T (legge di azione di massa). Successivamente, quando c’è circa una molecola di O₂ per ogni emoglobina, l’equilibrio si sposta un po’ verso R, ma restando sempre in favore di T (ipotizzando prima un rapporto T:R=10.000:1, ora sarà T:R=100:1): in questo momento O₂ si lega più facilmente a R, spostando l’equilibrio finale in favore di R. (Quando si parla di equilibrio tra T e R si intende, sul totale delle emoglobine, quante sono T e quante R, non esistendo forme ibride).

Sperimentalmente si trova che è il modello KNF ad avvicinarsi di più ai dati reali.

Effetto Bohr

Secondo l’effetto Bohr, l’emoglobina ha meno affinità per O₂ a pH acidi (pH bassi): la curva del grafico si sposterà quindi verso destra. Esempio l’acido lattico nei muscoli: quando un muscolo compie uno sforzo intenso, il pH locale si abbassa e c’è acidificazione, il muscolo ha in questo momento bisogno di ossigeno: l’emoglobina perde in questo momento affinità per O₂ in modo da cederne in quantità maggiori alla mioglobina.