Biochimica

Principi di regolazione metabolica

Ogni via metabolica è interconnessa con le altre e le cellule hanno la capacità di catalizzare simultaneamente processi metabolici diversi. La regolazione metabolica è quindi una caratteristica peculiare degli organismi, attraverso una serie di meccanismi in tempi diversi, la velocità del flusso metabolico viene regolata in base alle condizioni esterne.

Condizione di stato stazionario dinamico

È lo stato in cui si trovano le cellule, definito come omeostasi: per ciascuna reazione della via metabolica il substrato viene fornito dalla reazione precedente, alla stessa velocità con la quale viene convertito in prodotto. Quindi, anche se la velocità del flusso della via metabolica può subire variazioni, la concentrazione del substrato rimane costante.

La quantità e l'attività catalitica di un enzima possono essere regolate

Fattori che influenzano l'attività enzimatica:

• Segnali extracellulari (ormonali, neuronali, fattori di crescita, citochine)
• Fattori di trascrizione di geni specifici (proteine che, quando legate al DNA, attivano o disattivano la trascrizione del gene)
• Stabilità dell'mRNA
• mRNA tradotto ai ribosomi
• Degradazione della proteina (dipende dalle condizioni della cellula)
• Sequestro dell'enzima in organelli (trasporto dei substrati attraverso le membrane degli organelli cellulari)
• Variazioni delle concentrazioni dei substrati
• Enzima lega il ligando (effettore allosterico)
• Enzima viene fosf/defosforilato
• Combinazione enzima/proteina regolatrice: ad esempio le proteine chinasi AMPc-dipendenti, che rimangono inattive fino a che il legame con AMPc non separa la subunità catalitica da quella regolatrice

I più comuni punti di regolazione sono le reazioni lontane dall'equilibrio, quindi fortemente esoergoniche, che tendono all'accumulo dei prodotti: esse non possono raggiungere l'equilibrio, in caso contrario si avrebbe un'alterazione dell'osmolarità cellulare.

Nucleotidi adeninici

Ruolo speciale nella regolazione metabolica: le concentrazioni di ATP devono rimanere costanti. Se la concentrazione di ATP diminuisse significativamente, gli enzimi non sarebbero più saturati dal loro substrato, cioè l'ATP, e la velocità di migliaia di reazioni che richiedono energia diminuirebbe. Il rapporto [ATP]/[ADP] influenza tutte le reazioni che utilizzano questi due nucleotidi, poiché l'ATP viene convertito in ADP o AMP quando viene "speso" per compiere un lavoro cellulare.

La concentrazione di AMP è un indicatore dello stato energetico della cellula. Normalmente nella cellula la [ATP] (5-10 mM) è maggiore di quella di [AMP] (<0,1mM). Se qualche processo consuma ATP, l'AMP viene così prodotto attraverso due reazioni distinte:

• Idrolisi dell'ATP → ADP
• 2 ADP → ATP + AMP (enzima: adenilato chinasi)

Quindi, se viene utilizzato il 10% di ATP, l'aumento di AMP è superiore a quello di ADP, per questo molti processi di regolazione dipendono dalle variazioni di AMP.

Proteina chinasi attivata da AMP (AMPK)

L'AMPK è un enzima regolato dall'AMP. Esso incrementa il trasporto del glucosio e l'attività della glicolisi e della ossidazione degli acidi grassi. Inoltre, rallenta alcuni processi che richiedono energia, come la sintesi degli acidi grassi, del colesterolo e delle proteine. Viene attivata da elevate concentrazioni di AMP o basse di ATP, esercizio fisico, sistema nervoso simpatico e ormoni peptidici prodotti da tessuto adiposo. Quando viene attivata, fosforila le proteine bersaglio, devia in una serie di tessuti il metabolismo dai processi che conservano energia, e fuori dal fegato attiva il metabolismo che utilizza gli acidi grassi come combustibile, stimolando la gluconeogenesi epatica per fornire glucosio al cervello.

Regolazione coordinata glicolisi-gluconeogenesi

Tre reazioni della glicolisi sono fortemente esoergoniche e quindi irreversibili. La gluconeogenesi le risolve utilizzando gruppi differenti di enzimi, citosolici e mitocondriali. I punti di regolazione consistono proprio nel controllo sugli enzimi che catalizzano queste reazioni:

• Glucosio ↔ glucosio 1P (HK vs G6-Pasi)
• Fruttosio 6P ↔ fruttosio 1,6 bifosfato (PFK-1 vs F1,6-BPasi-1)
• Fosfoenolpiruvato ↔ piruvato (PK vs PC)

Se le due vie procedessero contemporaneamente, si avrebbe un ciclo futile, cioè non biochimicamente produttivo e altamente dispendioso in termini energetici: ATP + H2O → ADP + P + calore (un ciclo futile può risultare utile in certe circostanze a mantenere la temperatura corporea costante ad esempio nei bombi).

Punto di regolazione più importante: PFK-1 vs F1,6-BPasi

PFK-1: oltre al sito attivo per il substrato della molecola che catalizza, possiede modulatori + e -: diversi siti di regolazione a cui si legano. L'ATP è sia il prodotto che il modulatore della PFK-1. Quando viene prodotta più velocemente di quanto venga consumata, agisce come modulatore negativo inibendo l'enzima. Si lega ad un sito allosterico T (spostando quindi l'equilibrio R↔T verso T) e diminuisce così l'affinità per il suo substrato (fruttosio 6-P). ADP e AMP rimuovono l'inibizione attuata dall'ATP, bilanciando l'inibizione dell'ATP legandosi allo stato R (spostano l'equilibrio R↔T verso R). Quindi l'attività dell'enzima aumenta quando ADP e AMP si accumulano, e diminuisce quando ATP aumenta.

Citrato: segnala alle cellule che le richieste energetiche sono state effettuate e inibisce quindi l'enzima PFK-1. FBFasi-1: l'AMP è un inibitore allosterico. Quando la sua concentrazione è alta, la concentrazione di ATP è bassa, modulatore negativo. Quindi la gluconeogenesi, che richiede molta energia, viene rallentata.

Fruttosio 2,6-bifosfato

Il fegato controlla i livelli ematici di glucosio (glicemia) ed è sotto il controllo di due ormoni:

• Glucagone: iperglicemizzante, segnala al fegato di produrre e rilasciare nel sangue glucosio (gluconeogenesi)
• Insulina: ipoglicemizzante, quando le concentrazioni di glucosio sono alte stimola il fegato a usare lo zucchero come combustibile (glicolisi)

Fruttosio 2,6-bifosfato media la regolazione ormonale della gluconeogenesi e glicolisi, è effettore allosterico degli enzimi PFK-1 e FBPasi-1. Quando esso si lega al sito allosterico della PFK-1, aumenta l'affinità tra enzima per il substrato (fruttosio 6P) e diminuisce l'affinità per gli inibitori allosterici ATP e citrato, accelerando quindi la glicolisi. Quando esso si lega all'enzima FBP-1, riduce l'affinità per il substrato, rallentando quindi la gluconeogenesi.

La sua concentrazione è regolata dalla velocità di formazione e demolizione operata dai 2 enzimi che la fosforilano/defosforilano. Fruttosio 2,6-bifosfato si forma per fosforilazione del fruttosio 6P per opera della fosfofruttochinasi-2 (PFK-2) e viene defosforilato dall'enzima fruttosio 2,6-bifosfatasi (FBPasi-2). Sono due entità enzimatiche separate presenti però sulla stessa proteina, che è bifunzionale.

Il bilancio di queste due attività enzimatiche che regolano il livello cellulare di fruttosio 2,6-bifosfato è controllato dal glucagone e insulina:

• Glucagone: determina un abbassamento dei livelli di fruttosio 2,6-BP inibendo quindi la glicolisi e stimolando la gluconeogenesi. Ciò consente al fegato di rifornire il sangue in risposta al glucagone. Dinamica: il glucagone stimola l'adenil ciclasi epatica → sintetizza AMPc (ciclica) dall'ATP. AMPc attiva la proteina chinasi cAMP-dipendente → trasferisce gruppo P dall'ATP alla proteina bifunzionale PFK-2/FBFasi-2. La fosforilazione di questa proteina bifunzionale aumenta la sua attività fosfatasica (FBPasi-2) e inibisce l'attività chinasica (PFK-2).
• Insulina: stimola l'attività di una fosfoproteina fosfatasi → catalizza la rimozione del gruppo P dalla proteina bifunzionale. L'attività enzimatica chinasica viene attivata (PFK-2) e i livelli di fruttosio 2,6-bifosfato tendono così ad aumentare, viene quindi stimolata la glicolisi e inibita la gluconeogenesi.

Regolazione della piruvato chinasi (PK)

La piruvato chinasi è l'enzima che catalizza l'ultima tappa della glicolisi, dove il fosfoenolpiruvato viene trasformato in piruvato. L'aumento della concentrazione di alanina comporta l'inibizione allosterica della PK. Altri inibitori includono ATP, acetil-CoA e acidi grassi a catena lunga, che indicano un alto apporto energetico, andando a inibire in modo negativo l'attività della piruvato chinasi. L'accumulo di fruttosio 1,6-bifosfato determina l'attivazione della PK.

L'isozima del fegato è soggetto a un'ulteriore regolazione ormonale tramite fosforilazione:

• Glucagone attiva la PKA (proteina chinasi AMPc dipendente) → fosforila e quindi inattiva la PK L (isozima L), diminuendo l'utilizzo del glucosio come combustibile nel fegato e rendendo il glucosio disponibile per essere trasportato al cervello e altri organi
• Basse concentrazioni di glucagone: proteina fosfatasi (PP) defosforila la PK L attivandola

Questo meccanismo impedisce che il fegato consumi glucosio (glicolisi) quando la glicemia è bassa, fornendo quindi glucosio.

Via del pentosio fosfato

Avviene nelle cellule che si dividono rapidamente: midollo osseo, pelle, mucosa intestinale, cellule tumorali utilizzano il ribosio 5-P (il prodotto della via) per costruire il DNA, RNA e coenzimi (ATP, NADH, CoA, NADPH). Viene prodotto NADPH a partire dal NADP+, e gli altri tessuti considerano il prodotto principale della via del pentosio P il NADPH: necessario per le biosintesi riduttive.

Tessuti che necessitano l'apporto di NADPH: tessuti che sintetizzano attivamente gli acidi grassi (fegato, adipociti, ghiandola mammaria) o che sintetizzano attivamente il colesterolo e gli ormoni steroidei (fegato, ghiandole surrenali, gonadi). NADPH inoltre è necessario per la protezione dai danni ossidativi causati dal perossido di idrogeno e dal radicale libero anione superossido (sono sottoprodotti del metabolismo della via del pentosio). Durante le reazioni di detossificazione, H2O2 viene solitamente convertito in H2O grazie al NADPH.

Fase ossidativa

Produce NADH e pentosio 5P (irreversibile). Glucosio 6P → 6-fosfoglucono-d-lattone (ossidazione, catalizzata da glucosio 6P deidrogenasi, accettore degli elettroni è NADP+ → NADPH). L'entrata del glucosio 6P nella glicolisi o nella via del pentosio fosfato dipende dal fabbisogno momentaneo della cellula e dalla concentrazione di NAD+ nel citosol. In assenza di NAD+, la prima reazione catalizzata dalla G6PD non può procedere. Quando la cellula converte rapidamente il NADPH in NAD+ nelle biosintesi riduttive, aumenta il livello di NADP+, la G6PD viene stimolata e il flusso del glucosio 6P incrementa verso la via del pentosio fosfato. Quando la velocità di formazione del NADPH è superiore a quella del suo utilizzo, la concentrazione di NADPH aumenta → inibisce il primo enzima della via: maggiore disponibilità di glucosio 6P per glicolisi.

6-fosfoglucono-d-lattone → 6-fosfogluconato (idrolisi Mg dipendente catalizzato da lattasi) → ribulosio cheto-P (decarbossilazione ossidativa, catalizzata da 6-fosfogluconato deidrogenasi, si genera una seconda molecola di NADPH) → ribosio 5-P (isomero, catalizzato da fosfopentosio isomerasi).

Reazione complessiva: glucosio 6P + 2NADP + H2O → ribosio 5P + 2NADPH + CO2 + 2H+.

Fase non ossidativa

Ribulosio 5P epimerizzato in xilulosio 5P. Avvengono riarrangiamenti carbocationici degli scheletri carboniosi. Il ripetersi del ciclo che converte 6 molecole pentosio fosfato in 5 glucosio 6-P porta alla conversione del glucosio 6 P in 6 molecole di CO2. Qui agiscono due enzimi tipici: la transektolasi e la transaldolasi:

• Transektolasi: catalizza il trasferimento di un frammento a 2 atomi di C (C1 e C2) dello xilulosio 5P al ribosio 5P → si forma sedoeptulosio 7P + gliceraldeide 3P
• Transaldolasi: rimuove un frammento a 3 atomi di C del sedoeptulosio 7P alla gliceraldeide 3P → si forma fruttosio 6P + eritrosio 4P
• Transaldolasi: forma fruttosio 6P e gliceraldeide 3P a partire da eritrosio 4P e xilulosio 5P

Le due molecole di gliceraldeide 3P che si formano in due cicli vengono convertite in una molecola di fruttosio 1,6-bifosfato. Il fruttosio 1,6-bifosfato viene convertito in glucosio 6P da enzimi FBPasi-1 e fosfoesosio isomerasi.

Metabolismo del glicogeno

L'eccesso di glucosio viene immagazzinato convertendolo in forme polimeriche di glucosio (glicogeno). Si trova soprattutto nel fegato (max 10% di peso) e nei muscoli scheletrici (fibre bianche utilizzate nelle emergenze, hanno pochi mitocondri, si avrà quindi fermentazione lattica) (max 1-2% di peso). Il glicogeno epatico è utilizzato come riserva di glucosio in condizioni di digiuno, mentre il glicogeno muscolare è utilizzato come riserva di energia immediatamente disponibile per il metabolismo aerobico e anaerobico.

Il glicogeno viene immagazzinato nel citosol sotto forma di granuli che contengono: glicogeno, enzimi necessari per la sua sintesi/degradazione, componenti del sistema di regolazione degli enzimi.

Struttura del glicogeno

È un omopolisaccaride (formato da un grande numero di saccaridi identici, il glucosio). Le molecole di glucosio sono unite mediante legami α1-4, ogni 8-12 unità si ha il punto di ramificazione attraverso legame α1-6. Ogni estremità libera delle ramificazioni presenta un gruppo -O- (non reattivo), chiamate quindi estremità non riducenti, qui lavorano gli enzimi. Ogni molecola di glicogeno ha una sola estremità riducente -OH.

Granuli

• Diametro: 21 nm
• Formato da 55.000 residui di glucosio
• Rosette: 20-40 granuli si riuniscono a formare le strutture visibili al microscopio elettronico

Glicogenolisi

La glicogeno fosforilasi agisce sulle estremità non riducenti: legame glicosidico α1-4 (quindi tra due residui di glucosio) viene scisso mediante l'utilizzo del Pi → si forma (α-D-)glucosio-1P. È una reazione fosforilitica, parte dell'energia del legame glicosidico viene immagazzinata nella formazione dell'estere fosfato. La glicogeno fosforilasi agisce ripetutamente sulle estremità non riducenti delle ramificazioni, e la sua azione si blocca a 4 residui dalla ramificazione α1-6.

Enzima deramificante: con attività transferasica e glucosidasica catalizza due reazioni di trasferimento delle ramificazioni:

• Attività transferasica: sposta un blocco di 3 residui dalla ramificazione a un'estremità non riducente vicina, attraverso un legame glicosidico α1-4
• Attività glucosidasica α1-6: il singolo residuo di glucosio rimasto sul punto della ramificazione viene rilasciato sotto forma di glucosio libero

Si forma così un polimero (α1-4) deramificato che può subire ulteriormente l'azione della glicogeno fosforilasi.

Fosfoglucomutasi: sottoclasse dell'isomerasi

• Glucosio 1P ↔ glucosio 6P

Destino del glucosio 6P

Nel muscolo scheletrico: entra nella glicolisi per fornire energia alla contrazione muscolare, viene ossidato a piruvato, che viene ridotto a lattato. Può inoltre entrare nella via del pentosio fosfato per creare ribosio e NADPH.

Nel fegato: obiettivo è quello di rilasciare glucosio nel sangue quando la glicemia è bassa (cond. di digiuno), quindi interviene la glucosio 6Pasi che scinde il legame col gruppo P rilasciando il glucosio libero. Glucosio 6Pasi: presente solo nei reni e nel fegato, è una proteina integrale di membrana del RE, con sito attivo rivolto verso il lume della membrana. Quindi il glucosio 6P formatosi viene trasportato nel lume della membrana del RE da un trasportatore specifico T1 e viene così idrolizzato. I prodotti, cioè il glucosio e il Pi, vengono trasferiti nel citosol da due diversi trasportatori T2 e T3. Il glucosio esce dall'epatocita grazie a un trasportatore specifico localizzato sulla membrana plasmatica, il GLUT2.

UDP-glucosio

Molte delle reazioni di trasformazione e polimerizzazione di esosi coinvolgono gli zuccheri nucleotidi: sono i substrati per la polimerizzazione dei mono e di-saccaridi (glicogeno, amido, cellulosa). La loro idoneità in queste biosintesi dipende da:

• La loro formazione è irreversibile, grazie all'idrolisi del PPi in 2Pi, che rende la reazione altamente esoergonica e quindi favorevole alla biosintesi
• Le trasformazioni chimiche che avvengono con l'UDP-glucosio non coinvolgono gli atomi di C del nucleotide
• I gruppi nucleotidilici sono degli ottimi gruppi uscenti, in quanto attivano l'atomo di C a cui sono legati