Biochimica

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA inizia su specifiche sequenze dette origini di replicazione, queste sono particolarmente ricche di A e T, dal momento che queste due basi si legano con soli due legami a idrogeno al posto dei tre tra G e C, e sono quindi più facilmente scindibili. Nell’uomo ci sono circa 20-80 origini di replicazione dette unità di replicazione.

Ciascuna unità di replicazione è attivata in un momento diverso della fase S o il processo richiederebbe circa 1 ora a fronte di una media reale di 8 ore. Sembra che l'attivazione immediata o tardiva delle unità di replicazione dipenda dallo stato della cromatina in cui sono immerse e non dalla velocità della DNA polimerasi che è più o meno costante. L'eucromatina è replicata all'inizio della fase S, perché più prontamente raggiungibile e meno condensata, mentre l'eterocromatina è replicata tardivamente perché più condensata ed inaccessibile.

Complessi proteici chiamati ORC (origin recognition complex) si legano alle origini di replicazione insieme alla DNA elicasi MCM, tale aggregazione è chiamata complesso prereplicativo. La fosforilazione di specifiche sequenze determina una rimozione degli ingombri nell’origine della replicazione e l’attivazione dell’elicasi e del complesso ORC.

A livello di ciascuna origine di replicazione, la doppia elica si apre grazie all’elicasi e all'idrolisi di ATP in ADP+P. Ciascuna elicasi continua a dividere le due eliche di DNA, ma ciascun filamento singolo tenderebbe naturalmente a formare cappi che bloccherebbero la sintesi di DNA da parte della DNA polimerasi, per questo in attesa della nuova sintesi alcune proteine (come RPA) dette single-strand binding proteins (SSBP) vi si legano e contribuiscono a tenerlo in una conformazione "tesa", lasciando esposte alla DNA polimerasi le basi.

Subito dietro l'elicasi MCM la proteina PCNA, dalla caratteristica forma ad anello (la cosiddetta "pinza scorrevole") ed un suo caricatore con legato ATP sono caricati sul DNA. Quando la DNA polimerasi è a sua volta caricata davanti alla pinza, l'ATP viene idrolizzato ad ADP+P e il caricatore si stacca, mentre PCNA rimane adesa alla DNA polimerasi. PCNA è utile alla replicazione in quanto evita il distacco prematuro della DNA polimerasi senza però interferire con la sintesi di DNA grazie alla sua conformazione anulare.

Sul filamento ritardato, a differenza del filamento leader, il complesso PCNA+DNA polimerasi si stacca dal DNA ogni qualvolta incontra l'estremità 5' del frammento di Okazaki sintetizzato in precedenza, la DNA polimerasi infatti si stacca ogniqualvolta incontri DNA a doppio filamento.

La DNA polimerasi non può iniziare a sintetizzare DNA immediatamente, perché ha bisogno di riconoscere un'estremità 3'-OH integra e normalmente questa non esiste sul singolo filamento. Per cui, prima della sintesi da parte di questo enzima, negli eucarioti interviene la DNA polimerasi α/primasi (che è un complesso proteico composto da 4 subunità proteiche: 2 con attività polimerasica e 2 con attività primasica). La DNA polimerasi α/primasi procede in direzione 5'-3' sintetizzando brevi tratti di RNA di una decina di nucleotidi, in seguito le subunità con attività DNA polimerasica sintetizzano un frammento di DNA formando quindi brevi tratti ibridi DNA\RNA.

Negli eucarioti i primer vengono sintetizzati ogni 100 - 400 nucleotidi. A questo punto la DNA polimerasi ε ha a disposizione estremità 3'-OH a partire dalle quali sintetizzare il nuovo filamento. Sul filamento leader, in direzione 5'-3' il filamento "figlio" è sintetizzato in modo continuo, ma sul filamento ritardato non può esserlo, dal momento che le DNA polimerasi sintetizzano solo in direzione 5'-3'.

Per questo motivo la sintesi è spezzata e procede in direzione 5'-3' formando a partire dai primer tratti detti frammenti di Okazaki, intervallati da nick. Il filamento ritardato è piegato all'indietro nella forcella della replicazione. Quando una DNA polimerasi incontra il 5' del frammento di Okazaki sintetizzato precedentemente si stacca e ricomincia a sintetizzare più a valle. Successivamente l'RNA primer viene degradato da diversi enzimi (endonucleasi) e sostituito da DNA da parte della DNA Pol δ, i nick creatisi sul filamento ritardato sono uniti dalla DNA ligasi. Tali nick sono sfruttati nella correzione degli appaiamenti sbagliati diretta dal filamento.

Per districare il DNA e renderlo disponibile alla sintesi agiscono dei complessi di rimodellamento della cromatina che idrolizzano ATP in ADP+P prima che intervenga l'elicasi. Tali complessi, costituite da proteine con carica negativa, distaccano il doppio filamento dal nucleosoma e lo mantengono distaccato per 10-50 millisecondi, per farlo si avvalgono dell'aiuto di chaperoni, uno per ciascun nuovo nucleosoma in formazione una volta completata la sintesi di DNA;

Danni nella replicazione

All’inizio della sintesi del nuovo filamento c’è la maggiore possibilità di errori, ma c’è un sistema di correzione costituito dagli enzimi del riparo che ricontrollano la dimensione dell’elica e la disposizione delle basi. Danni chimici possono essere provocati dal HNO2 che può convertire la citosina in uracile e questo porta ad un errato accoppiamento perché viene messa una adenina invece che una guanina. Le radiazioni ultraviolette possono far sì che due timine si dispongano una sopra l’altra e ciò determina la formazione di un ciclobutile che distorce l’elica. Tutte le DNA polimerasi possiedono anche un’attività esochinasica 3’-5’ che serve a controllare ogni nucleotide dopo che è stato aggiunto, si fa una sorta di correzione delle bozze.

Trascrizione

La trascrizione avviene in una sola porzione di DNA e inizia quando l’enzima RNA polimerasi incontra delle specifiche sequenze consenso riconosciute dal legame con specifiche proteine che legano queste sequenze e pongono le basi per il legame dell’enzima. Quindi non ha bisogno di un primer per iniziare, l’enzima riconosce la catena stampo o non codificante. Questo enzima però non svolge attività di proofreading esonucleasica 3’-5’ e la frequenza di errore è maggiore rispetto alla replicazione ma non è un problema molto grande perché da un unico gene sono prodotte diverse proteine e le varie copie poi sono degradate se errate.

Un altro elemento di riconoscimento per le sequenze consenso sono regioni ricche di legami AT poiché è meno forte rispetto a quello tra guanina e citosina. A sintetizzare l’mRNA è principalmente la RNA polimerasi II, inoltre questa richiede un gruppo di proteine per svolgere la sua funzione che sono i fattori di trascrizione.

Inizio della trascrizione

La proteina che lega il TATA box è chiamata TBP e grazie al fattore TFIIH svolge il DNA in prossimità del sito d’inizio. Questo fattore inoltre fosforila l’estremità carbossiterminale dell’enzima attivandolo.

Allungamento e terminazione

I fattori di allungamento sopprimono le pause e determinano il completamento del trascritto, la pol II viene defosforilata. Si è formato il pre-mRNA. La maturazione può consistere in:

• Splicing, cioè rimozione degli introni. A volte i pezzi possono essere combinati in modo diverso come nello splicing alternativo.
• Capping, cioè si aggiunge un cap in posizione 5’ di metil-guanosina, lo rende più stabile e lo indirizza ai ribosomi.
• Poliadenilazione, si aggiunge una coda di poliA che aiuta il suo trasporto, lo stabilizza e semplifica il riconoscimento.

Le funzioni di una cellula determinano il tipo di proteine prodotte in modo costitutivo, un esempio è l’operone del lattosio. L’operone è trascritto solo in presenza del lattosio e questa regolazione si ottiene perché vicino al promotore del gene c’è una sequenza regolatrice a cui si lega il repressore lac. Questo legame impedisce la trascrizione. Il repressore ha un sito di legame per il lattosio che permette il suo distacco e quindi la trascrizione del gene.

Oltre alla sequenza regolatrice c’è anche quella dell’attivatore, la proteina CRP che deve essere legata all’cAMP per favorire la trascrizione. Ogni gene ha un promotore diverso e delle sequenze diverse che facilitano o meno la trascrizione, queste sono le sequenze enhancer. CI possono essere diversi tipi di RNA oltre al mRNA.

Il tRNA è necessario per la traduzione nei ribosomi, forma una struttura ad anse e steli, la struttura ha forma di L, allo zucchero dell’ultima A è legato, attraverso il gruppo carbossilico, l’amminoacido che deve portare. Ad accoppiare tRNA e aminoacidi ci pensa l’enzima aminoacil-tRNA sintetasi, utilizzano energia proveniente dall’ATP e riutilizzano l’AMP per trasferire l’aminoacido sul ribosoma. L’rRNA entra nella struttura dei ribosomi e gli snRNA sono necessari per la maturazione del RNA.

Traduzione

Il codice genetico è universale e degenerato. Inizio: Si va sempre dalla regione N-terminale di una proteina a quella C-terminale, il primo aminoacil ad essere aggiunto è quello che porta la metionina poiché la sequenza d’inizio di ogni mRNA è AUG. Solitamente è sempre rimossa da una proteasi specifica. La subunità minore del ribosoma riconosce il cap-5’ del mRNA, poi si lega anche la subunità maggiore e il ribozima cerca la tripletta d’inizio. Ci sono i siti A, P ed E di uscita per i tRNA, il fattore EF1 è legato al sito A bloccandolo all’inizio.

Allungamento

Il fattore d’inizio IF2 sfrutta GTP per avere energia e anche ATP per permettere il legame di ciascun aminoacil-tRNA. Il complesso entrante si lega al sito A e si forma un legame peptidico catalizzato dall’enzima peptidil trasferasi.

Terminazione

Il complesso incontra il codone di stop e la catena polipeptidica è rilasciata. Questo si ripiegherà nella sua forma tridimensionale e verrà poi modificato. È favorita dai fattori di terminazione RF1, RF2, RF3. Le proteine appena prodotte possono essere modificate mediante modificazioni ammino- e carbossiterminali, oppure tramite rimozione della sequenza segnale, un residuo di 15-30 aminoacidi.

• Modificazioni di singoli aminoacidi fosforilando dei residui di serina, tirosina o treonina; aggiungendo gruppi prostetici o mediante modificazioni proteolitiche soprattutto per quanto riguarda enzimi presenti principalmente in forma inattiva.

Enzimi

Gli enzimi sono particolari proteine che hanno la caratteristica di essere catalizzatori biologici, cioè hanno la capacità di abbattere l'energia di attivazione (E_att) di una reazione, modificandone il cammino per far sì che un processo cineticamente lento risulti più veloce. Gli enzimi aumentano la cinetica di reazioni termodinamicamente possibili e, a differenza dei catalizzatori, sono, chi più chi meno, specifici: possiedono quindi specificità di substrato.

L'enzima non è coinvolto nella stechiometria della reazione: perché si abbia ciò, è indispensabile che il sito catalitico finale sia identico a quello di partenza. Nell'azione catalitica esiste, quasi sempre, una fase lenta che determina la velocità del processo. Quando si parla di enzimi non è corretto parlare di reazioni di equilibrio, si parla, invece, di stato stazionario (stato in cui un certo metabolita si forma e si consuma continuamente, mantenendo la sua concentrazione pressoché costante nel tempo). Il prodotto di una reazione catalizzata da un enzima è, solitamente, a sua volta reagente per una reazione successiva, catalizzata da un altro enzima, e così via. I processi catalizzati da enzimi sono, di solito, costituiti da successioni di reazioni.

Una generica reazione catalizzata da un enzima (E), si può così schematizzare:

E + S ↔ ES ↔ E + P

Un enzima generico (E) si combina con il substrato (S) per formare l'addotto (ES) con una costante di velocità K₁; esso può dissociare di nuovo in E + S, con una costante di velocità K₂, oppure, (se "vive" abbastanza a lungo) può procedere per formare P con una costante di velocità K₃. Il prodotto (P) può, a sua volta, ricombinarsi con l'enzima e riformare l'addotto con costante di velocità K₄.

Nel momento in cui si mescolano enzima e substrato, si ha una frazione di tempo in cui non si è ancora verificato l'incontro tra le due specie: si ha, cioè, un intervallo di tempo estremamente breve (che dipende dalla reazione) in cui enzima e substrato non si sono ancora incontrati; dopo questo periodo, enzima e substrato vengono a contatto in quantità via via maggiore e si forma l'addotto ES. Successivamente l'enzima agisce sul substrato e viene rilasciato il prodotto. Si può allora dire che c'è un intervallo di tempo iniziale in cui non è definibile la concentrazione dell'addotto ES; dopo tale periodo, si suppone che si instauri uno stato stazionario, cioè la velocità dei processi che portano ad ottenere l'addotto è uguale alla velocità dei processi che portano alla distruzione dell'addotto.

La costante di Michaelis-Menten (K_M) è una costante di equilibrio (riferita al primo equilibrio sopra descritto); si può dire, con buona approssimazione (perché andrebbe considerata anche la K₃) che K_M è rappresentata dal rapporto tra le costanti cinetiche K₂ e la K₁ (riferite alla distruzione e alla formazione dell'addotto ES nel primo equilibrio sopra descritto). Attraverso la costante di Michaelis-Menten abbiamo un'indicazione dell'affinità tra enzima e substrato: se la K_M è piccola c'è un'elevata affinità tra enzima e substrato, quindi l'addotto ES è stabile.

Gli enzimi sono soggetti a regolazione (o modulazione). In passato si parlava soprattutto di modulazione negativa, cioè di inibizione delle capacità catalitiche di un enzima ma, si può avere anche una modulazione positiva, cioè vi sono delle specie in grado di esaltare le capacità catalitiche di un enzima. Esistono 4 tipi di inibizioni (ottenute da approssimazioni fatte su un modello per far combaciare i dati sperimentali con le equazioni matematiche):

• Inibizione competitiva
• Inibizione non competitiva
• Inibizione incompetitiva
• Inibizione acompetitiva

Si parla di inibizione competitiva quando una molecola (inibitore) è in grado di competere con il substrato. Per similitudine strutturale, l'inibitore, può reagire al posto del substrato; ecco da cosa deriva la terminologia "inibizione competitiva". La probabilità che l'enzima si leghi all'inibitore o al substrato, dipende dalla concentrazione di entrambi e dalla loro affinità con l'enzima; da questi fattori dipende, quindi, la velocità di reazione. Per ottenere la stessa velocità di reazione che si avrebbe senza la presenza dell'inibitore, occorre avere una concentrazione di substrato maggiore. È dimostrato sperimentalmente che, in presenza di inibitore, la costante di Michaelis-Menten aumenta.

Per quanto riguarda, invece, l'inibizione non competitiva, l'interazione tra la molecola che dovrebbe funzionare da modulatore (positivo o negativo-inibitore) e l'enzima, avviene in un sito che è diverso da quello in cui si ha l'interazione tra enzima e substrato; si parla quindi di modulazione allosterica (dal greco allosteros → altro sito). Se l'inibitore si va a legare all'enzima, può indurre una modificazione della struttura dell'enzima e, di conseguenza, può diminuire l'efficienza con cui il substrato si lega all'enzima. In questo tipo di processo, la costante di Michaelis-Menten rimane costante dal momento che tale valore dipende dagli equilibri tra enzima e substrato e, tali equilibri, anche in presenza di un inibitore, non cambiano.

Il fenomeno della inibizione incompetitiva è raro; un tipico inibitore incompetitivo è una sostanza che si lega reversibilmente all'addotto ES dando origine a ESI:

ES + I ↔ ESI

L'inibizione da eccesso di substrato può essere talvolta di tipo incompetitivo, in quanto questa si manifesta quando una seconda molecola di substrato si lega al complesso ES, dando origine al complesso ESS.

Un inibitore acompetitivo, invece, può legarsi unicamente all'addotto enzima substrato come nel caso precedente: il legame del substrato all'enzima libero induce una modificazione conformazionale che rende accessibile il sito per l'inibitore. La costante di Michaelis Menten diminuisce all'aumentare della concentrazione di inibitore: apparentemente, quindi, l'affinità dell'enzima per il substrato aumenta.

La regolazione allosterica è la regolazione di un enzima o di una proteina mediata da una molecola detta effettore, che svolge tale funzione legandosi presso il sito allosterico. Un enzima dotato di siti allosterici è detto enzima allosterico ed il legame che lo unisce all'effettore (o modulatore allosterico) è reversibile, non covalente: esso consente all'enzima di passare dalla forma inattiva a quella attiva. Gli enzimi allosterici generalmente sono più grandi e complessi rispetto agli enzimi non regolatori e, solitamente, nei sistemi multienzimatici, il primo enzima della via metabolica è proprio un enzima allosterico. Questi enzimi non seguono la cinetica di Michaelis-Menten: essi infatti hanno curve di velocità con andamento sigmoide, che riflette la presenza di interazioni cooperative tra le diverse subunità dell'enzima stesso. Gli effettori allosterici non modificano la costante di Michaelis-Menten.