Biochimica

Biochimica

Un organismo per essere un vivente deve mantenere un disequilibrio con l’ambiente. La produzione di energia parte dalla fusione termonucleare (che produce ⁴He), che viene convertita in fotoni, utili per la fotosintesi che a sua volta rilascia ossigeno ed ATP. Nell’organismo vivente sono presenti diversi sistemi chimici, fatti da reagente, substrato e prodotto, che sono in grado di scambiare energia con l’ambiente circostante: questo meccanismo è fondamentale per la vita poiché ogni essere vivente ha bisogno di combustibili chimici (come il Glc negli animali) o di luce solare (nelle piante) e si definiscono come sistemi aperti; ogni organismo ha bisogno di acquisire e dissipare energia per vivere grazie all’esistenza delle principali macromolecole biologiche: proteine, lipidi, zuccheri e acidi nucleici.

La radiazione cosmica di fondo

La radiazione cosmica di fondo è un eco dell’antica esplosione del Big Bang e da lì nacquero anche le prime molecole organiche: l’esperimento di Miller-Urey rappresenta la prima dimostrazione che le molecole organiche si possono formare spontaneamente, nelle giuste condizioni ambientali, a partire da sostanze inorganiche più semplici.

Le proteine

Le proteine sono molecole che svolgono numerose funzioni che vanno dalla trasduzione del segnale alle attività catalitiche enzimatiche che sono permesse dalla loro conformazione. La fibrosi cistica (FC) provoca la produzione di un muco poco fluido nei polmoni, che in condizioni normali tende a intrappolare polvere e batteri, ma a causa della sintesi di proteine malfunzionanti per l’alterazione del folding proteico non permettono alle cellule ciliate il reflusso del muco verso la bocca e lo accumulano in situ. Ciò non favorisce l’arrivo di enzimi dal pancreas per ostruzione della ghiandola, che diviene fibrotica, e il riversamento del muco in altri organi induce ulteriori problemi digestivi, come sottonutrizione e accumulo di grasso per mancanza di afflusso di enzimi digestivi con conseguente steatorrea, e sessuali, poiché anche le vie riproduttive vengono bloccate.

Uno dei legami intermolecolari più importanti è il legame H: questi ponti sono direzionali o lineari e sono molto stabili in quanto esiste una forza che a qualsiasi azione che interferisce con la direzionalità del legame riporta le molecole sulla stessa linea di legame ed è questa interazione favorisce il corretto folding della proteina. Tutte le molecole agiscono sempre secondo l’entropia che stabilisce un prima e un poi: un esempio ne è la risonanza poiché gli elettroni entropicamente tendono a disperdersi su uno spazio maggiore formando la caratteristica nuvola elettronica.

Le interazioni idrofobiche sono fondamentali per la vita per la formazione spontanea in soluzione delle membrane e delle micelle. Le molecole d’acqua creano una cosiddetta gabbia attorno alle catene alchiliche del soluto, maggiore è la superficie idrofobica del reagente immerso in soluzione acquosa maggiore è l’entropia che viene creata dalla reazione, e il C^α, il carbonile e il gruppo amminico si trovano sullo stesso piano, solo gli angoli fi e psi dati dal C^α possono variare, gli angoli diedri fi e psi fanno assumere diverse conformazioni in base alla posizione dei vari residui aa. La struttura proteica è data da diverse sottostrutture che si suddividono in: primaria, che consta nella semplice sequenza amminoacidica, secondaria, che può essere ad alfa elica e foglietto beta, terziaria, data dall’insieme delle strutture secondarie, quaternaria, se si aggregano più strutture terziare in una stessa proteina. Piccole variazioni nelle strutture secondarie possono provocare variazioni dell’intero folding proteico, come nella calmodulina che regola i canali e le pompe per il Ca²⁺ in seguito a un suo cambio conformazionale dovuto alla variazione della sua interazione con il Ca²⁺. La struttura secondaria dell’alfa elica stabilizzata dai legami H tra l’H del carbossi e l’azoto di 4 aa dopo (l’H a i raggi X, metodo utilizzato per studiare le conformazioni strutturali dei polipeptidi, non è visibile in quanto il suo potere di diffrazione è trascurabile). Sono stati contati 3,6 aa per giro d’elica, formato da 13 atomi (elica 4, 13); le eliche che osserviamo in natura sono sempre destrogiro, ma esiste anche un’elica 3,10 in cui si trovano 3 aa per giro che presenta 10 atomi. Un fattore rilevante per il raggiungimento del folding ottimale è la diminuzione dell’entropia (= numero delle possibili configurazioni) e se le interazioni delle catene laterali guadagnano maggiore energia rispetto a quella utilizzata a posizionarsi in conformazione allora le proteine si presentano secondo questa per contrastare l’entropia (nel nostro organismo sono presenti solamente aa della serie L, quelli della serie D sono presenti in pochi peptidi, solitamente piccoli, come quelli della parete cellulare dei batteri e in qualche peptide con funzione d’antibiotico). L’alfa elica è favorita: dalla presenza di Ala, dal distanziamento di aa carichi positivi di 3 o 4 residui da quelli negativi al fine di formare un’interazione ionica, dal distanziamento di due aa aromatici di 3/4 residui per permette interazioni idrofobiche, dall’assenza di Pro (che induce un ripiegamento conformazionale destabilizzante data la sua rigidità strutturale) e Gly (data la sua eccessiva flessibilità), dalla presenza di un dipolo elettrico dato dalle estremità C- e N-terminali che ciascuna è stabilizzata rispettivamente da aa positivi e negativi.

I foglietti beta sono invece strutture piane caratterizzate dai residui che si presentano in alternanza sopra-sotto e contribuiscono alle interazioni con le strutture poste lateralmente; in tali conformazioni è spesso rilevata la presenza di Pro e Gly, l’una poiché favorisce il ripiegamento beta di tipo I, grazie alla conformazione del suo gruppo imminico che conduce a una struttura cis, e l’altra perché è piccola e flessibile e favorisce il ripiegamento II, meno comune. Esistono foglietti in cui le catene sono parallele l’un l’altra (con legami H diagonali), antiparallele (con legami H paralleli) e misti; queste interazioni sono spesso destrorse poiché si formano così angoli più corti e una tendenza al ripiegamento. Dato che nelle proteine esistono successioni di conformazioni alfa e beta si sono istituite ulteriori strutture secondarie dette supersecondarie (la maggior parte delle proteine che presentano un’alternanza tra alfa e beta legano nt, secondo la teoria di Rossman). Una struttura particolare detta barile beta prevede dei foglietti beta paralleli che formano una struttura circolare (che costituisce il sito attivo o domini idrofilici) e circondata da catene con alfa eliche. Possiamo anche trovare strutture dette ad ansa beta-alfa-beta che stabilizzano le proteine in quanto nascondono gli aa idrofobici all’interno.

Esistono poi proteine intrinsecamente disordinate che non hanno una struttura ordinata in soluzione: non hanno un nucleo idrofobico e sono cariche e ricche di Lys, Arg e Glu, e inoltre anche Pro e sono facilitati nella funzione di spaziatore, isolanti o di collegamento. Possono anche fungere da scavenger, ovvero spazzini che catturano ioni accumulati o anche radicali, ma sono in grado anche di inibire l’interazione di altre proteine con la propria proteina bersaglio avvolgendosi intorno ad essa.

Quando si parla di proteine idrofobiche l’idrofobicità è data dalle catene laterali mentre la catena principale è idrofilica: le proteine transmembrana possono trovarsi in conformazione alfa elica o barile beta (presente nei batteri e mitocondri) e la parte a contatto con il bilayer risulta idrofobica mentre quella interna idrofilica. Proteine con più alfa eliche che percorrono la membrana sono le proteine G, in alcuni casi rari un dominio corrisponde a un esone, i domini permettono la flessibilità della proteina per il substrato, inoltre regolano l’attività. Il paradosso di Levinthal sostiene che il numero delle possibili conformazioni delle proteine è astronomico se noi variamo phi e psi ad intervalli di 120 gradi, ciò porta a dire che un peptide da 2 aa ha 9 alternative, uno da 3 aa 81 alternative, e così via arrivando a numeri esorbitanti per polipeptidi più complessi. La struttura della proteina deriva solo dalla sua sequenza amminoacidica che permette la formazione di strutture secondarie spontanee, l’avvicinamento di strutture secondarie aggregate poste nelle vicinanze e la stabilizzazione conformazionale data principalmente dall’interazione delle catene idrofobiche laterali (Il dG tra una proteina con folding corretto e una destrutturata è di qualche caloria).

Alterazioni della funzionalità delle proteine sono dovute all’idrofobicità esterna delle proteine, rendendole appiccicose, che formano aggregati in quanto tendono ad allontanarsi dall’ambiente idrofilico in cui sono immerse. La SLA costituisce una patologia legata al mancato folding corretto di una proteina: è provocata da un’alterazione nel gene della superossido dismutasi che previene i danni da radicali liberi dell’ossigeno. Gli chaperoni sono enzimi che facilitano il folding corretto: alcune di queste, dette chaperonine (HSP70), coprono gli aa idrofobici per evitare una preventiva aggregazione e abbondano in organismi esposti a un notevole shock termico. Queste proteine catalizzano anche il mantenimento di unfolding non corretto fintanto che la proteina non foldata non sia trasferita attraverso la membrana. GroEL è una chaperonina che si può unire a un’ulteriore proteina, GroES, con un meccanismo catalitico che si definisce come segue: una volta che la proteina viene sintetizzata, Gro-EL, unita a GroES, ospita la proteina in una delle due cavità, una della macrosubunità apicale e l’altra di quella inferiore (una di esse è sempre coperta da GroES), restringendo lo spazio conformazionale ed esponendo una parte idrofobica della macrosubunità apicale che interagisce con gli aa idrofobici esposti esternamente nella proteina non conformata; in questo modo le varie subunità idrofobiche di Gro-EL, con consumo di ATP, ruotano parzialmente nascondendo l’idrofobicità ed esponendo i domini idrofilici consentendo alla proteina di riversare i domini idrofobici all’interno. A questo punto GroES si distacca dal complesso rilasciando ADP dalla macrosubunità inferiore (il 15% delle proteine ha bisogno di questo ausilio) liberando la proteina; man mano che la proteina esce da Gro viene ubiquitinata (il numero di ubiquitine presenti rappresenta il numero di volte che la proteina è rientrata in Gro per essere ristrutturata) e se l’ubiquitinazione raggiunge un suo limite il proteasoma riconosce l’alterazione e attiva la proteolisi. Il percorso di ripiegamento delle proteine viene poi concluso in presenza di due proteine principali: la PDI, che favorisce il rimescolamento dei ponti –SS– e la PPI, che catalizza l’interconversione cis-trans dei legami peptidici che presentano Pro.

Il trasporto dell'ossigeno

L’O₂ è poco solubile e la sua diffusione è inefficiente se le distanze superano pochi mm e perciò c’è bisogno di proteine che la permettano: la mioglobina immagazzina l’O₂ affinché in carenza d’ossigeno, ad esempio durante le lunghe immersioni, venga utilizzato dal muscolo; nessuna catena laterale è in grado di legarlo reversibilmente ma vengono utilizzati i metalli, ad esempio il ferro (non può esserci Fe libero in quanto provoca la formazione di specie dell’ossigeno altamente reattive). Per legare O₂ quindi utilizziamo un gruppo prostetico, in particolare il gruppo eme (con 4 anelli pirrolici, facenti parte della struttura ad anello della protoporfirina, che legano tramite legami non covalenti un atomo di Fe, stabilizzato anche da un legame con l’istidina prossimale, E7His); quando l’eme isolato reagisce con l’O₂ il ferro passa irreversibilmente allo stato ferrico. In una proteina il Fe²⁺ non si ossida a Fe³⁺ poiché il gruppo prostetico è immerso in uno spazio ridotto per la formazione di ulteriori legami di coordinazione e perciò il legame con O₂ rimane reversibile. Un’ulteriore proteina allosterica trasportatrice che permette la diffusione dell’O₂ è l’emoglobina (Hb) che rispetto alla Mb presenta delle caratteristiche di affinità un po’ diverse di cui se ne parlerà in seguito.

Considerando i due componenti di una reazione catalitica, la proteina e il suo ligando, il rapporto tra la proteina libera e legata è direttamente proporzionale alla concentrazione del ligando libero a meno di una costante d’affinità, K_a:

[PL] [PL]K_a= L]=K_a [→ ; in questo modo si può dedurre che la saturazione dei siti di P][ ]P L] [[ϴ legame ( ), il rapporto tra i siti occupati e i siti di legame totali, può essere calcolata mediante questa formula: K_a[ L] L][P] [ϴ = [PL]/([PL]+[P]) = = ; se applicassimo questa formula alla Mb, [ ]K_a L [ ]L K_d[P ]( +1) + ϴ assunto che la concentrazione di O₂ è proporzionale alla sua pressione e K_d = [O₂]0,5, allora: =pO₂ ,

(K_d=costante di dissociazione, 1/K_a, ovvero il valore di [L] al quale la metà dei siti disponibili è occupata; pO₂ 50=P₅₀=pressione parziale della proteina dell’ossigeno al 50%); quindi K_d=pO₂ 50.

Come grafico si avrà un’iperbole in cui si avrà la percentuale di saturazione sulle y e la concentrazione del ligando sulle x. Solo se la pressione scende drasticamente la mioglobina rilascia l’ossigeno poiché possiede un’alta affinità. La mioglobina e l’emoglobina legano con maggior affinità il CO, ma la Mb ha evolutivamente apportato una conformazione più limitativa al legame con il CO in quanto l’istidina distale (His F8) si può scontrare con il monossido in quanto la molecola O₂ possiede un certo angolo di legame che permette un legame H con l’His distale mentre il CO forma un legame lineare impedito stericamente dall’His; questo meccanismo risulta importante perché nel nostro organismo viene prodotta una piccola parte di CO in seguito alle combustioni. Il legame dell’O₂ con l’eme è dato grazie ai movimenti molecolari molto rapidi delle catene laterali (respirazione proteica), dati dalle interazioni temporanee, che crea delle cavità transitorie che la molecola sfrutta per raggiungere l’eme in profondità; la rotazione dell’His distale costituisce il cambiamento più rilevante.

L’emoglobina è un dimero di dimeri in quanto le 2 subunità alfa e le 2 beta sono molto interagenti ma meno legate tra dimeri, in cui sussistono legami idrofobici, ionici e H. la proteina presenta due stati: lo stato T con poca affinità con l’ossigeno in cui riesce a prendere l’O₂ e lo stato R in cui ha preso l’O₂ e si abbassa l’affinità e passa da uno stato all’altro in base alla concentrazione di ossigeno (proteina allosterica). In conformazione T il ferro ha un raggio atomico grande che porta alla formazione a cupola tipica del gruppo eme: con il legame con l’ossigeno, invece, il raggio atomico diminuisce e il piano dell’eme si raddrizza e l’istidina prossimale si sposta portandosi dietro anche l’elica F di cui fa parte causando lo spostamento delle altre parti proteiche dell’emoglobina; in questo modo i monomeri alfa e beta scivolano l’uno rispetto all’altro e ruotano portando a un restringimento della tasca centrale. Questo cambiamento di conformazione, dovuto alla variazione delle proprietà elettroniche della macromolecola, giustifica la diversa colorazione riscontrabile tra sangue venoso e arterioso. Si parla quindi di legame cooperativo poiché il cambiamento conformazionale di una delle subunità influisce sul comportamento delle altre.

n[PLⁿ] [L]K_a =P+nL ↔ PLⁿ ϴ

Per una proteina P con n siti di legame, , e = ;n n[ ]P L] L] K_d[ [ +nϴ L][= , da qui si può ricavare la legge di Hill applicando il logaritmo a entrambi i membri1−ϴ K_d ϴ( ) ⟩ n[ ]log log L K_d( )=n −log ( )ricavando: con detto coefficiente di Hill che misura ilHH1−ϴ n 1&⟩grado di cooperatività. Se , il legame non è cooperativo e può succedere quando leH n n> ¿ =nsubunità sono indipendenti; se 1 allora vi è cooperatività ( limite massimo). SeH Hn 1< la cooperatività risulta negativa e il legame di L impedisce il legame di un altro. Per l’HbH ϴ( )log pO₂( )=nlog −nlog(P₅₀) possiamo dire che: .1−ϴ

La percentuale di saturazione dell’emoglobina con l’O₂ è data dal grafico dell’emoglobina consistente in una sigmoide, in rosso (al contrario di quella della mioglobina iperbolico, in blu) che favorisce il rilascio di O₂ a basse pressioni e la cattura ad alta pressione. L’emoglobina lega anche la CO₂ e gli H⁺, prodotti di scarto della respirazione cellulare; dato che la CO₂ non è solubile in acqua essa viene convertita in bicarbonato (dall’anidrasi carbonica), più accessibile al trasporto nel plasma sanguigno da parte degli eritrociti. L’idratazione della CO₂ porta all’aumento della [H⁺] e con la diminuzione del pH il rilascio di ossigeno viene favorito poiché si indeboliscono le interazioni fra i dimeri (la sigmoide si sposta verso dx). Questa relazione, detta effetto Bohr, può essere sintetizzata mediante la formula: HHb⁺ + O₂ = HbO₂ + H⁺. La CO₂ si lega all’N-terminale della catena beta dell’emoglobina.