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Appunti di Microbiologia medica basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof.ssa Pini, dell’università degli Studi di Firenze - Unifi,Facoltà di farmacia, Corso di laurea specialistica in farmacia . Scarica il file in formato PDF!

Esame di Microbiologia medica docente Prof. G. Pini

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ESTRATTO DOCUMENTO

mannani che si trovano nella parete dei funghi. Oppure possono riconoscere RNA a duplice

spirale, che si trova nei virus, ecc…

I recettori dell’immunità innata, i PRR, sono in genere delle proteine transmembrana, e si possono

trovare o sulla membrana citoplasmatica, o anche sulle membrane interne. Nel caso dei recettori

che si trovano sulla membrana citoplasmatica, la parte che riesce a riconoscere l’agente estraneo

sarà diretta verso l’esterno della cellula, e sarà capace di riconoscere sostanze come la flagellina,

presente nei batteri flagellati, come il peptidoglicano, i mannani, ecc…

Quelli che sono posizionati invece all’interno della cellula, avranno la parte che riconosce il

recettore diretta verso l’interno dell’endosoma, e sono recettori che riconoscono agenti infettivi

intracellulari, come un virus, la duplice spirale dell’RNA di un virus. Molti di questi recettori sono

Toll Like Receptors, TLR = recettore simile ai recettori Toll Like Receptors, e sono

importantissimi per le difese dell’organismo dell’immunità innata.

Quando si forma un legame tra queste molecole caratteristiche di grossi gruppi di agenti estranei e

i TLR? Succede che si attiva una trasduzione di segnale intracellulare, che fa sì che la cellula

monti una risposta effettrice, che può essere diretta verso la cellula stessa, e quindi può

determinare la proliferazione di questa cellula, o può determinare nella cellula la produzione di

certe sostanze come le citochine, che vanno ad agire su altre cellule dell’immunità, e sono queste

che fanno l’azione effettrice, ad esempio agiscono sulle cellule Natural Killer, che vanno poi ad

uccidere la cellula infettata.

I granulociti neutrofili fanno parte dei globuli bianchi, si trovano nel sangue, e sono i primi che

intervengono nel sito dell’infezione. Hanno un citoplasma ricco di granuli che non si colorano con i

coloranti, e sono granuli che hanno un’attività enzimatica. Queste cellule inglobano il

microrganismo, e con l’azione enzimatica dei granuli distruggono il microrganismo. Sono delle

cellule estremamente differenziate e non riescono a formare questi granuli, per cui muoiono, e

vanno a costituire la maggior parte del pus. Il pus quindi è costituito principalmente da globuli

bianchi, granulociti neutrofili morti, che hanno già distrutto il microrganismo. Poi ci sono i

macrofagi, molto importanti perché non svolgono solo quest’azione simile ai granulociti neutrofili

(inglobare e distruggere il microrganismo), ma anche molte altre funzioni che fanno sì che possano

cooperare con l’immunità acquisita, ad esempio funzionano da APC, Antigen Presenting Cell,

perché al loro interno digeriscono l’agente estraneo, e frammenti di peptidi di questo agente

estraneo sono complessati con il complesso maggiore di istocompatibilità, e portati alla superficie

del macrofago, e questo qui permette al linfocita T di attivarsi, di riconoscere l’antigene estraneo.

Producono delle sostanze, soprattutto citochine, che hanno funzione modulatrice dell’attività di

altre cellule dell’immunità. Oltre a questo producono lisozima e interferone. Il monocita deriva dalla

cellula staminale multipotente e va nel sangue. Qui non rimane molto a lungo, 24-36 ore, poi migra

attraverso gli endoteli dei capillari sanguigni, e va a posizionarsi nei tessuti, e qui matura in

macrofago, e prende nomi diversi a seconda del sito del corpo in cui si trova: ci sono i macrofagi

alveolari negli alveoli polmonari, ecc… e rappresentano la prima difesa cellulare contro gli agenti

estranei che arrivano dall’esterno in questi tessuti.

Le cellule dendritiche: di origine midollare, forse dai monociti ma non è sicuro, e dal sangue

migrano nei tessuti, si trovano nei tessuti periferici e anche in molti organi. Sono le prime che

devono captare l’agente estraneo appena penetrato nell’organismo. Le immature captano e

fagocitano l’agente estraneo appena arrivato, e iniziano un processo di maturazione, durante la

quale si spostano, sono mobili, e vanno nel linfonodo più vicino. Qui sono mature. Hanno

disgregato l’agente estraneo, hanno complessato le proteine dell’agente estraneo nel complesso

maggiore di istocompatibilità, e l’hanno esposto sulla loro superficie, in modo che quando arrivano

nel linfonodo trovano i linfociti T vergini, mai venuti a contatto con un peptide dell’agente estraneo,

e qui c’è il riconoscimento specifico tra il linfocita T e il peptide dell’agente estraneo, e questo

innesca la risposta immunitaria acquisita, quindi cellule dell’immunità innata che innescano

l’immunità acquisita. Le cellule dendritiche sono le cellule che danno l’avvio alla risposta

immunitaria acquisita. Fanno quasi la stessa cosa del macrofago, ma non è capace di dare l’avvio

alla risposta immunitaria acquisita, ma solo di renderla più efficiente. Le Natural Killer sono una

popolazione di linfociti capace di provocare la lisi di cellule che presentano alla superficie delle

proteine strane, si forma questo legame, parte un segnale, libera il contenuto dei granuli, perforine

che forano la membrana della cellula alterata, granzime che entra dentro e si attiva la caspasi per

arrivare alla morte della cellula, all’apoptosi.

IMMUNITA’ ACQUISITA

Quali sono i meccanismi dell’immunità innata?

Rappresenta la prima linea di difesa dell’organismo nei confronti dell’aggressione da parte di un

agente estraneo, sia microbiologico ma anche altri tipi. Quindi la prima linea di difesa è

rappresentata dalle barriere come la cute, le mucose.

Se l’agente estraneo le supera, incontra altri attori dell’immunità innata, cioè le cellule fagocitarie, i

macrofagi e i granulociti neutrofili, che sono capaci di fagocitare questi agenti estranei e di

distruggerli. Oltre a questi ci sono delle sostanze chimiche che vengono prodotte dalle cellule

dell’immunità innata, che sono una difesa molto importante.

Interferone = grande azione antivirale indiretta.

Meccanismi infiammazione.

Se anche questi falliscono entra in funzione la terza linea di difesa rappresentata dall’immunità

specifica, acquisita.

Questa immunità si presenta per la prima volta nei vertebrati, mentre negli invertebrati ci sono dei

meccanismi di difesa più semplici. Poi evolve fino ad avere la più completa espressione nell’uomo.

La funzione è quella di protezione, però se i meccanismi regolatori non funzionano bene,

l’immunità può anche causare un danno, come allergia e malattie su base immunopatologica.

Quali sono i caratteri essenziali?

La specificità il fatto che i meccanismi effettori reagiscono specificamente con quel

determinato microrganismo. La memoria consiste in una risposta diversa a seconda che si tratti

del primo incontro con un determinato agente estraneo, oppure il secondo incontro con lo stesso

agente estraneo.

Tolleranza: la non reattività verso tutto ciò che è self, che fa parte dell’organismo. Il sistema

immunitario non deve reagire verso i componenti stessi del proprio organismo.

La funzione immunitaria riconosce agenti estranei in particolare delle sostanze estranee, chiamate

antigene. Una volta avvenuto il riconoscimento si ha una risposta che è creata specificamente per

quel determinato antigene e non per altri. Questa risposta svolge un’azione protettiva, e questa è

la funzione immunitaria. La risposta consiste nella produzione di effettori specifici, effettori = quelle

cellule e sostanze che svolgono proprio la funzione dell’immunità, di protezione. Questi effettori

sono rappresentati da cellule, i linfociti, e rappresentati da sostanze solubili che vengono secrete

nei fluidi corporei, come il sangue, sopra le mucose, ecc, e sono gli anticorpi. Sia i linfociti che gli

anticorpi svolgono la funzione di distruggere l’antigene. Cos’è un antigene? Qualcosa che non fa

parte del nostro corpo, qualcosa di estraneo. Deve avere come requisito fondamentale

un’estraneità biologica, deve essere non self. Deve essere capace di stimolare la risposta

immunitaria, cioè deve essere immunogeno, e la risposta che stimola deve essere specifica, cioè

deve produrre degli effettori che siano capaci di reagire soltanto con quel determinato antigene, e

non con altri.

In genere si tratta di molecole che hanno un alto peso molecolare e una struttura complessa. Sono

dei buoni antigeni la maggior parte delle proteine, per esempio, alcuni polisaccaridi, quelli della

capsula batterica, delle membrane cellulari, e alcuni lipidi e acidi nucleici.

Ci sono poi delle sostanze che hanno una molecola più semplice, che sono dette apteni che non

riescono a stimolare il sistema immunitario quando vengono in contatto con le cellule del sistema

immunitario, però riescono a reagire con gli effettori che sono stati prodotti da una risposta

immunitaria specifica. Queste molecole sono di dimensioni piccole, e vengono chiamate anche

antigeni incompleti, perché di per sé non sono immunogeni, quindi queste molecole costituiscono

una parte ben precisa dell’antigene, che è quella che conserva la specificità, mentre c’è un’altra

parte dell’antigene che ha la funzione di stimolare il sistema immunitario, ma non ha la specificità.

La specificità risiede in determinati antigeni o epitopi, e in genere è data dalla sequenza

amminoacidica della proteina, e dalla sua struttura tridimensionale, la conformazione spaziale

della molecola proteica. E non è tutta la molecola proteica che ha la specificità, ma una piccola

parte chiamata aptene, e che se è separata dal resto della molecola proteica è ancora in grado di

reagire con gli effettori dell’immunità, per esempio con gli anticorpi, in modo specifico.

Poi c’è tolleranza, la mancanza di risposta specifica verso un dato antigene. Quindi il sistema

immunitario non reagisce verso i propri antigeni, perché le cellule dell’immunità sono venute a

contatto con i propri antigeni durante lo sviluppo, e hanno sviluppato una non responsività verso i

propri antigeni. Quindi la tolleranza è stata indotta da una precedente esposizione all’antigene,

però oltre che in modo naturale (durante lo sviluppo), la tolleranza si può indurre anche verso

antigeni estranei, per esempio si possono fare dei trattamenti per indurre la tolleranza nel caso di

trapianto d’organo per esempio, perché non ci sia una risposta immunitaria contro le cellule che

vengono riconosciute estranee, che costituiscono l’organo trapiantato.

Nel sistema immunitario, oltre alle cellule dell’immunità, ci sono tessuti e organi linfatici. Importante

ricordare che le uniche cellule capaci di riconoscere in modo specifico gli antigeni sono i linfociti,

chiamati cellule immunocompetenti.

Anche macrofagi, granulociti e neutrofili riescono a riconoscere dei microrganismi e agenti

biologici, ma non in modo specifico, ma riconoscono solo molecole che sono in comune con

numerosi microrganismi diversi, mentre i linfociti sono capaci di riconoscerli in modo specifico.

Tessuti e organi linfatici

Da dove originano le cellule dell’immunità? Derivano dalla cellula staminale multipotente che si

trovano nelle ossa piatte, come lo sterno, il cranio, le coste, e nelle diafisi delle ossa lunghe, dove

c’è il tessuto spugnoso che contiene il midollo osseo rosso. Poi la cellula staminale multipotente dà

origine alla linea mieloide, e alla linea linfoide.

Dalla linea mieloide derivano i globuli rossi e le piastrine, poi quello che ci interessa per

l’immunità sono i granulociti, detti anche polimorfonucleati, basofili, eosinofili e neutrofili, e i

monociti. Queste cellule vanno tutte a finire nel sangue. I monociti dal sangue migrano nel

connettivo e poi nei tessuti, attraverso la parete dei vasi, e nei tessuti si trasformano in macrofagi e

prendono nomi diversi.

Invece dalla linea linfoide prendono origine i linfociti e le cellule Natural Killer.

I linfociti si differenziano in due popolazioni, linfociti B e linfociti T, non tanto per la loro

morfologia, invece le cellule Natural Killer sono diverse anche morfologicamente dagli altri linfociti.

Anche i linfociti passano nel sangue.

Quindi si chiamano organi linfatici primari tutti quegli organi dove avviene la produzione dei linfociti

e la loro differenziazione: per i linfociti B la produzione avviene nel midollo osseo rosso, e la

differenziazione lo stesso, tutto nel midollo osseo rosso.

Invece, per i linfociti T, la produzione avviene nel midollo osseo rosso, e la differenziazione avviene

nel timo.

Invece gli organi linfatici secondari, o periferici, sono quegli organi dove proprio avviene la risposta

immunitaria, dove inizia e viene portata avanti la risposta immunitaria. Sono i linfonodi, la milza, il

tessuto linfatico associato alle mucose, il MALT, che è un tessuto linfoide diffuso a livello delle

mucose, come quella del tratto gastrointestinale, urogenitale, tutte le mucose, e in questo caso il

tessuto linfoide non si organizza a formare dei veri e propri noduli linfatici, ma possono esserci

degli aggregati di cellule o anche singole cellule.

Quindi produzione nel midollo osseo rosso, differenziazione nel timo per i linfociti T e nel midollo

osseo rosso per i linfociti B, passano tutti quanti nel sangue, e poi vanno ai linfonodi.

I linfociti maturi poi, dal linfonodo possono anche ripassare nel sangue.

Dove sono collocati nel corpo umano questi organi linfatici primari e secondari?

Il timo è nella zona sternale. Gli organi linfatici secondari sono un po’ in tutto il corpo, i linfonodi si

concentrano soprattutto nelle ascelle, a livello inguinale, ecc…

L’immunità acquisita, in base agli effettori terminali, si può distinguere in immunità umorale e

cellulare. L’immunità umorale viene detta anche anticorpo-mediata, perché gli effettori terminali

sono gli anticorpi, mentre l’immunità cellulare, o cellulo-mediata, ha come effettori finali i linfociti

T citotossici, che svolgono effettivamente la funzione di protezione finale, con il contributo dei

linfociti T-helper. CD4+ e CD8+ è un sistema per distinguere queste due popolazioni di linfociti

che hanno la stessa morfologia, però hanno delle molecole di superficie diverse.

Oltre a queste due popolazioni di linfociti ce ne sono altre, ci sono i linfociti T soppressori, ecc…

che svolgono funzione regolatoria.

Risposta immunitaria acquisita di tipo cellulare.

La cellula maggiormente implicata in questo processo di risposta cellulare, è costituita dai linfociti

T, che entrano in azione nei confronti di antigeni endogeni dentro il corpo. Proviene dall’interno

della cellula in questo caso. Come fa a provenire dall’interno della cellula? Se la cellula è infettata

con un virus per esempio, parassiti endocellulari obbligati, che non hanno nessun meccanismo di

produzione di proteine o replicazione del DNA, per cui devono utilizzare quelli della cellula, e per

questo sono endocellulari obbligati.

Oppure quando la cellula è stata infettata da un batterio endocellulare.

Ci sono anche altri casi in cui il genoma della cellula viene modificato, e la cellula viene

trasformata. Può essere trasformata per vari fattori, come può essere un’infezione virale, però

anche per altri fattori. In tutti i casi, alla superficie della cellula sono presenti degli antigeni che non

ci dovrebbero essere, antigeni estranei. Un’infezione da virus all’interno della cellula fa sì che

vengano prodotte delle proteine virali, che sono riconosciute come estranee, non sono quelle

dell’organismo all’interno del quale si trova questo virus. E questo mette in moto soprattutto una

risposta i cui effettori sono i linfociti T, in particolare i T attivati, che sono gli effettori terminali

dell’immunità cellulare.

Come sono fatti i linfociti T?

Sono abbondanti. Costituiscono la maggior parte (70-80%) dei linfociti periferici, quelli che non si

trovano negli organi primari. In uno striscio di sangue si vedono come aventi pochissimo

citoplasma, quasi tutto nucleo, sono rotondeggianti. Più da vicino si vede che la superficie appare

frastagliata, perché nella membrana sono inserite una gran quantità di molecole recettoriali. Il

recettore è una proteina, che può essere trans-membrana o intracellulare, che da una parte è

capace di legarsi con uno specifico fattore, il ligando, e questo legame causa una variazione

conformazionale del recettore, e in seguito a questa variazione parte un segnale che va ad agire

sul genoma della cellula, provoca una risposta da parte della cellula, un qualche effetto biologico.

Quindi sulla superficie del linfocita T ci sono moltissimi recettori, il più importante è il T-Cell

Receptor, TCR. E’ quella molecola capace di riconoscere specificamente l’antigene, quindi ci

saranno tanti linfociti con T-Cell Receptor diversi per quanti sono gli antigeni riconosciuti, ognuno

con una specificità diversa per un antigene. 10 alla 17 sono i linfociti T differenti, perché ogni

linfocita ha la specificità per un suo antigene. Ogni linfocita ha il recettore per un antigene diverso,

e nel complesso dei linfociti, tutti quanti sono capaci di riconoscere fino a 10 alla 17 antigeni

diversi, praticamente tutti.

Oltre a questo ci sono le molecole CD, seguite da un numero. Quello che differenzia il linfocita T

Helper dal linfocita T citotossico, sono il CD4 e il CD8. Il T Helper ha il CD4, mentre il citotossico

ha il CD8. Poi per il resto sono identiche queste cellule. Hanno però una funzione diversa. Il

linfocita T Helper ha una funzione di regolazione della risposta immunitaria, mentre il linfocita T

citotossico ha proprio la funzione effettrice.

Citotossico = tossico per la cellula infettata da virus, batteri, cellula trasformata, che può evolversi

in cellula tumorale. E’ citotossico nei confronti di queste cellule che hanno alla superficie un

antigene, un qualcosa di estraneo.

Il linfocita T però non riconosce gli antigeni che sono in soluzione, che si trovano nei liquidi

biologici, ma soltanto quando si trovano sulla superficie di una cellula, e non devono essere messi

in modo casuale, ma devono essere all’interno di una serie di proteine, che vanno a costituire il

complesso maggiore di istocompatibilità. Queste proteine, il complesso maggiore di

istocompatibilità, sono state identificate facendo degli studi sul rigetto del trapianto. Però,

abbastanza recentemente, abbiamo capito che hanno un’importanza fondamentale per l’immunità

acquisita. In questo specchietto (*) vediamo che questo complesso maggiore di istocompatibilità

può esistere in due classi, classe 1 e classe 2.

Quello di classe 1 è presente in tutti i tipi di cellule, e gli vengono presentate sulla superficie delle

cellule, in queste proteine del complesso maggiore di istocompatibilità di classe 1, frammenti di

proteine intracellulari, per esempio frammenti di proteine virali quando la cellula è infettata da un

virus.

Questi antigeni presentati nel complesso maggiore di istocompatibilità di classe 1 sono riconosciuti

dalle cellule T citotossiche CD8+, che svolgono la loro funzione di citotossicità, uccidono la cellula

infettata dal virus, così svolgono la loro funzione effettrice di protezione.

Quello di classe 2 invece, è presente su alcuni tipi di cellule, sui macrofagi, i linfociti B e le

cellule dendritiche. Nel complesso maggiore di istocompatibilità di classe 2 vengono inseriti i

frammenti di proteine che provengono da agenti estranei che vengono fagocitati, quindi agenti

estranei extracellulari che vengono processati all’interno della cellula e poi esposti alla superficie

della cellula nel complesso maggiore di istocompatibilità di classe 2. In questo modo vengono

riconosciuti dalle cellule T Helper CD4+. I macrofagi, i linfociti B e le cellule dendritiche prendono il

nome di “antigen presentino cell” (APC), cellula presentante l’antigene, che viene riconosciuta

dal linfocita T Helper.

(*) = I macrofagi, i linfociti B e le cellule dendritiche fanno una funzione fagocitaria, c’è un antigene

estraneo, lo fagocitano, quindi lo inglobano all’interno del citoplasma, c’è la fusione tra il fagosoma

e il lisosoma, la digestione dell’agente estraneo, i frammenti di proteine vengono inserite nel

complesso maggiore di istocompatibilità di classe 2, e poi con un processo simile ad una esocitosi

vengono esposte alla superficie della cellula, inserite nella membrana della cellula, con l’antigene

esposto verso l’esterno.

Invece se questo antigene deriva da un’infezione intracellulare, o da una trasformazione cellulare,

questo antigene viene unito alle proteine del complesso maggiore di istocompatibilità di classe 1

(MHC 1), e migra verso l’esterno della cellula attraverso l’apparato di Golgi. Questo processo lo

possono fare invece tutte le cellule, perché è un sistema di difesa che hanno tutte le cellule, poiché

tutte le cellule possono essere infettate, e devono avere questo sistema di difesa.

Le cellule dendritiche immature si trovano alla periferia, per esempio (*) qui le vediamo nella

mucosa intestinale. Queste cellule sono delle APC immature. Se un agente estraneo penetra

nella mucosa intestinale, le cellule dendritiche sono cellule fagocitarie, riescono a riconoscere

questo microrganismo estraneo perché riconoscono non specificamente gli antigeni di superficie,

ma per esempio il lipopolisaccaride, altre molecole presenti in tanti microrganismi, quindi vedono

che è estraneo, lo fagocitano. La fagocitosi fa si che la cellula cominci a maturare, e mentre

matura si sposta, va verso il linfonodo più vicino e nello stesso tempo processa il microrganismo,

esponendolo alla superficie della cellula in modo che quando la cellula dendritica arriva all’interno

del linfonodo dove ci sono i linfociti T vergini, che però tra questi ci sarà anche quello che ha la

specificità per quel determinato antigene, lo riconosce, vi si lega, e da qui dà avvio alla risposta

immunitaria.

Le cellule dendritiche sono le prime cellule che danno avvio alla risposta immunitaria, portano

l’antigene verso i linfonodi, verso i linfociti T vergini che non hanno mai incontrato quell’antigene,

per dare l’avvio alla risposta immunitaria. Questo antigene deve essere presentato alla superficie

legato alle proteine del complesso maggiore di istocompatibilità di classe 2, altrimenti il linfocita T

Helper non lo riconosce. Se invece l’antigene viene incontrato nel sangue, l’APC si porta nella

milza, e qui incontra i linfociti T vergini.

(*) si vede come avviene il legame tra la cellula presentante l’antigene e il linfocita.

A destra un Antigen Presenting Cell, un APC, una cellula dendritica o un macrofago o un linfocita B

che presenta l’antigene nelle proteine del complesso maggiore di istocompatibilità di classe 2. Il

legame con il linfocita T Helper avviene mediante il T Cell Receptor, che riconosce specificamente

l’antigene, ma anche attraverso il CD4, che si lega alle proteine del complesso maggiore di

istocompatibilità di classe 2. Quindi c’è un riconoscimento specifico da parte del T Cell Receptor

con l’antigene, però anche un legame aspecifico tra il CD4 e le proteine del complesso maggiore

di istocompatibilità di classe 2.

Lo stesso succede per i linfociti T citotossici. Il riconoscimento specifico da parte del T Receptor

con l’antigene presentato nelle proteine del complesso maggiore di istocompatibilità di classe 1, e

legame aspecifico tra il CD8 e le proteine del complesso maggiore di istocompatibilità.

Vediamo come avviene il riconoscimento dell’antigene, soprattutto come avviene l’attivazione,

prima l’attivazione delle cellule T, e poi l’attivazione dei linfociti T citotossici.

Cellula dendritica che presenta l’antigene al linfocita T Helper vergine, all’interno di un linfonodo,

per esempio. Quel linfocita T Helper ha il T Cell Receptor specifico per quell’antigene, si forma un

legame, e questo scatena una serie di reazioni eziologiche della cellula. Non è solo questo, ma è

anche un’attività secretiva della stessa APC che produce interleuchine, che sono citochine che

agiscono tra le cellule dell’immunità. Produce soprattutto interleuchina 1, che va ad agire sul

linfocita TH, che ha formato il legame specifico con l’antigene. (*) Quella gialla è l’APC, si è

formato il legame con l’antigene presentato nel complesso maggiore di istocompatibilità, l’APC

produce IL1 che va ad agire sul linfocita TH. Tutto questo fa sì che si abbia l’attivazione del

linfocita TH, che inizia a moltiplicarsi e produce altre citochine, in particolare interleuchina 2 che è

attiva sullo stesso linfocita TH, quindi produce anche il recettore per l’interleuchina 2. Quindi per

via autocrina stimola se stesso a crescere e a dividersi, si divide e forma due cloni come si vede.

Un clone di linfocita T attivato, e uno di linfocita T della memoria. Quindi siamo arrivati ad avere

l’attivazione del linfocita TH, la proliferazione dei TH, la formazione di due cloni che avranno la

stessa specificità di quell’antigene, un clone di linfociti T Helper attivati, e un clone di linfociti T

della memoria. Questi della memoria sono come quiescenti, non fanno nulla, ma rimangono

nell’organismo a lungo, anche per anni, invece quelli attivati cominciano a produrre ancora una

gran quantità di citochine, che soprattutto IL2, IL4, IL6, gammainterferone ecc… che mediano vari

aspetti dell’immunità.

Che cosa fanno? Attivano i macrofagi, danno l’avvio alla risposta infiammatoria, e poi vanno ad

agire su altre cellule dell’immunità, che sono i linfociti B e i linfociti T. IL2 e IL4 hanno attività

rispettivamente sui linfociti T citotossici, e sui linfociti B. Quindi se prevale per esempio la

produzione di interleuchina 2, verrà attivata soprattutto una risposta di tipo citotossico, un’immunità

cellulare, mentre se prevale la produzione di interleuchina 4 verrà attivata soprattutto una risposta

di tipo anticorpale, perché vengono attivati i linfociti B.

Quindi a questo punto la risposta immunitaria si può orientare in una direzione o nell’altra. Però

ancora non siamo arrivati agli effettori.

Abbiamo capito qual è la funzione regolatrice del linfocita T Helper. La funzione effettrice invece

viene svolta dal linfocita T citotossico, che a sua volta deve essere attivato, ed abbiamo detto che

se il TH produce interleuchina 4, attiva di più il linfocita B, mentre se produce più IL2 attiva i linfociti

citotossici.

Una volta che è avvenuta l’attivazione, quando il linfocita T citotossico, con quella determinata

specificità, incontra la cellula infetta dal virus/batterio/trasformata, che presenta alla superficie

l’antigene presentato nel complesso maggiore di istocompatibilità di classe 1, si forma il legame

visto prima tra T Cell Receptor e antigene, e questo scatena la funzione effettrice citotossica, che

consiste nella produzione di varie sostanze, le linfotossine che entrano all’interno della cellula

bersaglio e interferiscono con il metabolismo della cellula, alcune citochine come l’interferone

gamma, il Tumor Necrosis Factor che è una citochina che induce l’apoptosi della cellula, e anche

delle altre sostanze, le perforine, che si inseriscono nella membrana cellulare e anche queste

destabilizzano la cellula fino a portarla a morte. Questa è la vera e propria funzione effettrice,

distruzione della cellula trasformata/infettata.

La risposta immunitaria acquisita di tipo umorale

La cellula maggiormente implicata in questo tipo di risposta è il linfocita B, che entra in azione

soprattutto nei confronti di antigeni esogeni, che si trovano negli spazi intercellulari, microrganismi,

tossine, virus, ecc…

Gli effettori finali di questa risposta sono gli anticorpi, delle glicoproteine che sono secrete al di

fuori della cellula che le produce, e vanno a finire nel sangue, ma anche nei vari fluidi circolanti,

per esempio si ritrovano anche sulle mucose.

Com’è fatto il linfocita B.

Costituiscono il 10-15% dei linfociti periferici, e il 50% dei linfociti che si trovano nella milza e nei

linfonodi, l’altro 50% è costituito dai linfociti T. Hanno un aspetto rotondeggiante nello striscio di

sangue, e pochissimo citoplasma. Al microscopio a scansione si vede che hanno una superficie

molto frastagliata per la presenza di recettori trans-membrana e non. Tra questi il più importante è

il B-Cell Receptor, che può essere rappresentato da una Immunoglobulina D di membrana, o una

Immunoglobulina M. Altri recettori che possono avere alla superficie sono i recettori per il

frammento FC delle immunoglobuline, e poi ci sono le proteine del complesso maggiore di

istocompatibilità di classe 2.

Come fanno ad essere attivati i linfociti B?

In genere l’attivazione richiede sempre l’intervento di un linfocita T Helper. Ci sono anche

eccezioni. Gli antigeni che attivano il linfocita B indipendentemente dall’intervento del linfocita T

Helper, vengono detti antigeni timo indipendenti, e sono molecole molto grosse e lunghe che

riescono a legarsi a più recettori contemporaneamente alla superficie del linfocita B, e questo

provoca l’attivazione. Ma la maggior parte degli antigeni invece sono timo dipendenti, ed hanno

bisogno dell’intervento di un linfocita T Helper per l’attivazione del linfocita B.

La prima parte (*) è uguale alla precedente fino all’attivazione del linfocita T Helper. Quindi un APC

che presenta l’antigene nel complesso maggiore di istocompatibilità di classe 2, il T Helper che ha

il T Cell Receptor per quell’antigene, si forma il legame, il T Helper viene attivato, e comincia a

produrre le interleuchine, soprattutto IL4, che va ad attivare il linfocita B. Questo però a sua volta è

una cellula fagocitaria e può funzionare da APC, quindi può legare specificamente un agente

estraneo, processarlo al suo interno, presentarlo nel complesso maggiore di istocompatibilità di

classe 2. Se a questo punto vi si lega un T Helper con la stessa specificità, da questo legame

parte un segnale che fa sì che la cellula B cominci a moltiplicarsi, anche in questo caso da due

cloni, un clone di cellule linfociti B della memoria, che sono quiescenti, e un altro clone. Cosa fa

questo clone? Il linfocita B è una cellula molto specializzata. Durante questa moltiplicazione invece

si differenzia, e si trasforma in plasmacellula, che è la cellula che produce gli anticorpi, che sono

gli effettori finali dell’immunità anticorpo mediata. Quindi da cosa derivano le plasmacellule? Dal

linfocita B attivato, e producono anticorpi – ogni plasmacellula un solo tipo di anticorpi – che avrà

la stessa specificità dell’antigene che è stato riconosciuto da quel determinato linfocita B, che è il

precursore della plasmacellula.

L’antigene opera la cosiddetta selezione clonale, perché?

Come detto per i linfociti T, anche la popolazione di linfociti B non è omogenea. Ci saranno linfociti

B con specificità diverse, con B-Cell Receptor diversi, capaci di riconoscere tutti gli antigeni,

antigeni diversi. Quando arriva l’antigene si legherà con quel determinato linfocita B che è capace

di riconoscere, poi avviene l’attivazione del linfocita B ad opera dei TH, e la proliferazione con la

formazione di plasmacellule e cellule della memoria. Quindi da un solo linfocita B capace di

riconoscere quel determinato antigene, avremo una popolazione di linfociti B capaci di riconoscere

quel determinato antigene. Con selezione clonale si intende proprio questo: l’antigene seleziona

quel determinato linfocita B che ha il B-Cell Receptor capace di riconoscerlo.

Come sono fatte le plasmacellule? Sono diverse. L sta per linfocita, e P per plasmacellula. Sono

diverse dai linfociti. I linfociti, abbiamo detto, sono cellule tondeggianti, praticamente tutte nucleo.

Invece le plasmacellule sono più grosse, hanno abbondante citoplasma, e hanno un citoplasma

ricco di RER, e anche un apparato di Golgi ben sviluppato, questo perché devono produrre gli

anticorpi, che sono proteine, e quindi serve un apparato per produrle abbondantemente.

Durante la prima fase di risposta anticorpale, la vita delle plasmacellule è piuttosto breve, perché

hanno un’intensa attività di secrezione, secernono un’elevatissima quantità di anticorpi, e poi si

esauriscono. Però in seguito ne secernono meno, e sopravvivono anche parecchi anni, e

continuano però a secernere una piccola quantità di anticorpi. Ogni plasmacellula secerne

anticorpi con una sola stessa specificità e antigene.

Abbiamo parlato dei cloni di linfociti T della memoria, e linfociti B della memoria.

A cosa servono queste cellule della memoria? Proviamo a capirlo analizzando la

concentrazione degli anticorpi nel siero, in relazione al tempo che intercorre con il momento

dell’incontro con l’antigene, quindi si fa un grafico, da una parte si mette il tempo che intercorre tra

il primo contatto con l’antigene e la misurazione del livello di anticorpi nel siero. E si vede che,

perché si riesca a rilevare una certa quantità di anticorpi nel siero bisogna che passi un certo

periodo di tempo. Dopo il primo incontro con l’antigene devono passare almeno 6-7 giorni, si

raggiunge il picco intorno al 15esimo giorno, e poi man mano gli anticorpi diminuiscono. Se dopo

un po’ di tempo lo stesso individuo incontra lo stesso antigene, cosa succede? Si misura

ugualmente la quantità di anticorpi nel siero, e si vede che la curva che si ottiene ha un picco

molto più alto ed è molto più ampia. Prima di tutto il periodo di latenza, nel quale non riscontro la

presenza di anticorpi è molto minore. La curva sale subito. Poi si raggiunge un picco molto più

elevato, e poi la quantità di anticorpi si mantiene molto più a lungo. A che cosa è dovuto questo?

Alla memoria immunologica.

La risposta immunitaria al primo incontro con l’antigene si chiama risposta primaria, e la risposta

immunitaria al secondo incontro, e poi per tutti gli incontri successivi, si chiama risposta

secondaria. Nella risposta primaria che succede? Arriva l’antigene, incontra il linfocita T e B

vergine, che ha alla superficie un T-Cell Receptor specifico per quell’antigene, ma sono poche le

cellule capaci di riconoscerlo. Però, durante la risposta primaria, c’è l’espansione clonale, quella

descritta prima, e quindi si formano cloni di cellule effettrici che svolgono la loro funzione, e cloni di

cellule della memoria che rimangono quiescenti. Al secondo incontro, il numero di cellule capaci di

riconoscere quel determinato antigene si è espanso – c’è stata l’espansione clonale – per cui sono

molti di più, e per questo la risposta immunitaria secondaria sarà molto più rapida e più efficiente, il

picco più alto e l’ampiezza della curva è maggiore.

Come sono fatti gli anticorpi?

Detti anche immunoglobuline perché sono delle proteine e glicoproteine globulari,

immunoglobuline perché svolgono una funzione immunitaria anche. Si chiamano anche

gammaglobuline, sono tutti sinonimi. Gammaglobuline perché quando si fa l’elettroforesi del siero,

migrano con la trazione gamma, alcune anche con la delta. Questa (*) in foto è la struttura tipica di

una immunoglobulina, in particolare della IgG. Si vede che le immunoglobuline sono formate da 4

catene, sono proteine. Le proteine possono essere coniugate a polisaccaridi.

Quattro catene, due più lunghe dette pesanti, e due più corte, leggere, che sono unite insieme da

ponti di solfuro, e poi c’è una regione cerniera che fa sì che le due estremità NH terminali si

allontanino tra di loro in modo da dargli questa forma ad Y.

Se si tratta con degli enzimi proteolitici, per esempio con la papaina, l’immunoglobulina viene

tagliata a livello della regione cerniera, e si formano 3 frammenti, 2 uguali che costituiscono il

frammento FAB, che contengono l’NH terminale della proteina, e un altro frammento, chiamato

frammento FC, frammento cristallizzabile, che contiene l’estremità carbossilica della proteina.

Questo a cosa serve? A capire quali sono le funzioni che svolgono queste due estremità, e si

è visto che i due frammenti FAB sono ancora capaci di reagire con l’antigene, quindi la specificità

antigene risiede nella parte NH terminale, che è la cosiddetta regione variabile, una regione in cui

la sequenza amminoacidica varia da anticorpo a anticorpo, perché è quella, insieme alla

conformazione tridimensionale, alla conformazione spaziale della proteina, che dà la specificità

all’antigene, cioè la capacità di riconoscere e legarsi specificamente con un antigene. Mentre la

parte FC ha altre caratteristiche importanti, per esempio si lega a recettori presenti su vari tipi di

cellule, si lega al complemento, ecc.

Le diverse caratteristiche delle catene pesanti e leggere determinano diverse classi di

immunoglobuline e sottoclassi. Le classi più importanti sono le IgE, responsabili delle allergie per

esempio, ma anche delle difese nei confronti di diverse malattie parassitarie, le IgA che sono

importantissime, perché sono quelle dei secreti, si ritrovano sulle mucose, e rappresentano la

prima difesa anticorpale importante contro gli agenti estranei. Le IgD sono recettori trans-

membrana per i linfociti B, le IgG invece che sono le più abbondanti, legano con più affinità gli

antigeni, e si trovano soprattutto nel siero. Le IgM non hanno quella forma, sono polimeriche, si

trovano nel sangue, e sono formate da 5 monomeri, e sono la prima classe di anticorpi che

vengono prodotti.

Infatti, se andiamo ad analizzare che tipo di immunoglobuline vengono prodotte nella risposta

primaria e secondaria vediamo che c’è una certa differenza.

Nella risposta primaria vengono prodotte soprattutto IgM, che formano il picco, e non permangono

a lungo nell’organismo, dopo un po’ di tempo spariscono. Nella risposta secondaria invece, quindi

derivanti da un secondo contatto con l’antigene, vengono prodotte soprattutto IgG, quelle che

rimangono a lungo nell’organismo.

Le immunoglobuline hanno varie caratteristiche che dipendono dalla parte costante, dal frammento

FC della molecola, e quindi sono legate alla classe di immunoglobuline, abbiamo detto che la parte

costante determina la classe di immunoglobuline.

Che caratteristiche hanno? Per esempio possono passare attraverso la placenta, ma solo le IgG.

Si possono ritrovare alla superficie dei linfociti B – le IgD – ma anche le IgM monomeriche, mentre

quelle formate da 5 frammenti diversi si ritrovano nel sangue.

Poi possono legarsi a recettori presenti su diversi tipi di cellule, per esempio sui fagociti, sia le IgG

che le IgM. Si trovano soprattutto nelle secrezioni, invece, le IgA.

Come fanno veramente gli anticorpi a eliminare l’antigene.

Sono gli effettori finali, quindi devono essere capaci di eliminare l’antigene. Gli anticorpi sono

capaci di promuovere l’eliminazione dell’antigene attraverso diversi meccanismi.

La neutralizzazione di virus e batteri.

Gli anticorpi si legano alla superficie di questi agenti estranei (virus e batteri) e ricoprono le

molecole di adesione step del processo infettivo, il primo step è rappresentato dall’adesione del

microrganismo alle cellule dell’ospite. Se gli anticorpi si mettono sopra le molecole che fanno

l’adesione, questa non può avvenire, non c’è il primo step e non c’è processo infettivo.

Questa caratteristica degli anticorpi si chiama “neutralizzazione”. Neutralizzano il potere infettante

degli agenti estranei.

Poi, legandosi sempre a batteri o antigeni estranei, sostanze che derivano da agenti estranei ma

solubili (tossine ecc.) ne promuovono l’agglutinazione e la precipitazione, quindi si formano i

cosiddetti “immunocomplessi”, e anche questi vengono poi eliminati dalle cellule fagocitarie,

attraverso un processo di opsonizzazione.

Opsonizzazione. Alla superficie dei macrofagi e di altri fagociti, ci sono dei recettori per il

frammento FC degli anticorpi, e quindi se l’anticorpo è legato al batterio, oppure ha formato un

immunocomplesso, da che parte si lega l’anticorpo con l’antigene? Dalla parte dell’estremità

FAB, quindi l’FC resta libera, sono le corna della Y che si legano all’antigene (*). Il fagocita ha

invece dei recettori per il frammento FC, e quando si forma il legame tra il frammento FC e il

recettore sul fagocita, viene promossa la fagocitosi in modo più efficiente. Allo stesso modo

funziona la componente 3b del complemento, perché il macrofago, il fagocita ha anche dei

recettori per la componente 3b del complemento.

Gli anticorpi attivano il complemento per la via classica. Abbiamo detto che la via alternativa può

essere attivata anche da due immunoglobuline G o una IgM legata alla superficie del battere o

microrganismo, quindi viene attivata la cascata del complemento fino alla formazione del MAC, un

poro attraverso la membrana del batterio, con fuoriuscita del citoplasma e morte del battere, lisi

cellulare del battere.

Poi sono implicate nell’ADCC, cioè tossicità cellulare dipendente dagli anticorpi, nella quale

intervengono le Natural Killer. Nel caso visto l’altra volta non entravano in gioco gli anticorpi,

perché erano semplicemente delle proteine estranee alla superficie della cellula infettata che

mettevano in moto l’azione delle cellule Natural Killer. Questa attività citotossica delle NK è

amplificata di 100 volte dalla presenza degli anticorpi, perché gli anticorpi si legano alle proteine

estranee alla superficie della cellula, e rimane sporgente il frammento FC. La cellule NK ha dei

recettori per il frammento FC, e quando si forma questo legame, cioè cellula infetta – anticorpo -

frammento FC, anticorpo che media l’avvicinamento tra la cellula infetta e la NK, succede che la

NK fa uscire il contenuto dei granuli, perforina e granzima, che entra dentro la cellula e promuove

l’apoptosi della cellula.

Queste sono le principali funzioni degli anticorpi che riescono ad eliminare l’antigene.

Queste funzioni sono svolte in modo diverso dalle varie classi di immunoglobuline.

L’opsonizzazione da IgG e IgM, l’attivazione del complemento lo stesso (IgG e IgM) la

neutralizzazione dei batteri, delle tossine e dei virus anche dalle IgA, perché devono proteggere le

mucose, quindi devono impedire l’attacco alle cellule della mucosa dell’ospite. L’agglutinazione e

la precipitazione soprattutto IgG e IgM, l’ADCC soprattutto le IgG, e poi ci sono le IgE, importanti

per proteggere dalle infezioni parassitarie, soprattutto nel corso di elmintiasi, ma sono responsabili

di allergie, perché sensibilizzano i mastociti e inducono la degranulazione dei basofili.

Come avviene la reazione allergica?

Un antigene viene in contatto con un linfocita B. Il linfocita produce IgE, che si legano alla

superficie dei mastociti attraverso il frammento FC, perché il mastocita ha un recettore per il

frammento FC. Alla seconda esposizione, l’antigene verrà incontrato da questi mastociti che hanno

alla superficie IgE legate con la stessa specificità per quell’antigene. Quando si forma il legame tra

l’antigene e l’IgE si scatena un segnale che determina la liberazione del contenuto dei granuli dei

mastociti, e quindi istamina e altri mediatori chimici, che scatenano i fenomeni allergici e

infiammatori.

Abbiamo visto l’immunità naturalmente acquisita, cioè una reazione immunitaria derivante dal

contatto naturale con un agente estraneo, con qualcosa che non è self, e in questo schema di che

tipo è? (*) Naturalmente acquisita di tipo attivo, perché comporta una risposta immunitaria con la

produzione di effettori che hanno lo scopo di neutralizzare l’agente estraneo. Però l’immunità può

essere acquisita anche artificialmente, con i vaccini.

La vaccinazione è un’immunità acquisita artificialmente ma sempre di tipo attivo, perché comporta

una risposta immunitaria con produzione degli effettori dell’immunità sia umorale che cellulare che

hanno la funzione di proteggerci quando incontriamo per una seconda volta l’agente estraneo.

C’è anche un’immunità passiva che può essere acquisita in modo naturale o in modo artificiale.

La passiva naturale da cosa è data?

Dal passaggio di anticorpi attraverso la placenta dalla madre al feto. Le IgG possono attraversare

la placenta, andare dalla madre al feto, e anche durante i primi giorni di vita si può avere un

trasferimento di IgA dalla madre al feto attraverso il colostro, la prima secrezione della ghiandola

mammaria, ed ha una composizione molto ricca di proteine e lipidi, ed ha una grandissima

quantità di IgA. Questa è l’immunità passiva naturale. Quella artificiale consiste nell’inoculare in un

organismo anticorpi, immunoglobuline già formate, oppure fare un trapianto di cellule

dell’immunità, essenzialmente linfociti B. Lo scopo è quello di dare una protezione immediata. Nel

caso dell’immunità naturale, acquisita in modo passivo, questo è importante perché il neonato ha

un sistema immunitario che non è ancora perfettamente funzionante, ci vuole del tempo prima che

diventi perfettamente funzionante. Per cui il trasferimento di IgG ha questa funzione, di proteggere

il neonato fino a che non ha sviluppato un proprio sistema immunitario perfettamente funzionante.

Infatti queste immunoglobuline G trasferite attraverso la placenta rimangono nel neonato per

qualche mese. Intorno al 3-4 mese non ci sono più, perché il neonato ha già sviluppato la capacità

di difendersi da solo.

Le IgA, che vengono assunte attraverso il colostro vanno a finire sulla mucosa dell’apparato

digerente, e sono molto importanti per proteggere il neonato dalle infezioni intestinali, poiché non è

ancora capace di produrre immunoglobuline.

Non solo, proteggono anche dalle malattie respiratorie.

Nel colostro ci sono 5-10 grammi/litro di immunoglobuline A, mentre nel latte ce ne sono meno, per

questo è importante, almeno per i primi 4 mesi, l’allattamento al seno.

Le altre classi di Ig sono scarsamente rappresentate nel latte, ma comunque sono presenti perché

il latte va ad aderire sulle mucose dell’apparato digerente e a proteggerle.

C’è una malattia che si chiama eritroblastosi fetale, o malattia emolitica del neonato, o malattia

emolitica feto-neonatale, alla base della quale c’è proprio questo passaggio di Ig attraverso la

placenta, ed è una malattia che può colpire il feto quando la madre è Rh negativa, e il padre è Rh

positivo, e viene concepito un bambino che a sua volta è Rh positivo.

Il fattore Rh cos’è?

Sono proteine che stanno sui globuli rossi, e tra queste c’è un antigene. La maggior parte delle

persone possiede questo fattore Rh, si chiama Rh perché fu identificato per la prima volta in una

scimmia, la Rhesus. Ci sono delle persone che non hanno questo fattore Rh, quindi sono negativi.

Se la madre è Rh negativa, e viene concepito un feto Rh positivo, la madre non riconosce come

self il fattore Rh. Durante la gravidanza c’è sempre un piccolo scambio di sangue tra la madre e il

feto, però durante la prima gravidanza questo scambio di sangue non è sufficiente a stimolare una

risposta anticorpale.

Però durante il parto, o un aborto, o durante l’amniocentesi, possono esserci scambi di sangue più

massicci. Se i globuli rossi del feto vengono in contatto con le cellule del sistema immunitario della

madre si scatena una risposta immunitaria, quindi all’inizio una risposta primaria, però con

produzione di cellule della memoria che rimangono nel corpo della mamma.

Quindi per la prima gravidanza non ci sono problemi, ma alla seconda gravidanza sorgono i

problemi se viene concepito nuovamente un feto Rh positivo, perché anche questi piccoli scambi

di sangue che si hanno fisiologicamente, possono scatenare la risposta immunitaria e ci sono le

cellule della memoria, quindi la risposta immunitaria sarà molto massiccia a questo punto, con

passaggio di tante immunoglobuline all’interno del sacco amniotico, che possono venire in contatto

con il bambino, e questo succede già a partire dal 3-4 mese di gravidanza.

Il feto in genere muore tra la 25esima-35esima settimana di gravidanza.

Le IgG della madre si legano ai globuli rossi – perché questo fattore Rh sta sui globuli rossi –

quindi si legano e provocano l’opsonizzazione dei globuli rossi.

I macrofagi si legano al frammento FC di questi anticorpi e fagocitano i globuli rossi, soprattutto i

macrofagi del fegato e della milza, per cui distruggono i globuli rossi, e questo provoca anemia più

o meno grave di tipo emolitico, perché ne provocano la distruzione. Il sistema ematopoietico del

feto cerca di sopperire a questa distruzione dei globuli rossi producendo una gran quantità di

eritroblasti, precursori dei globuli rossi.

Questi globuli rossi disgregati liberano emoglobina, che viene trasformata in bilirubina non

coniugata, che attraverso il sistema circolatorio può arrivare al SNC e se arriva ad una

concentrazione elevata dà danni neurologici, altrimenti si presenta solo come un ittero. (*) Neonato

con ittero, e neonato con rush cutaneo dovuto alla distruzione dei globuli rossi.

Questa malattia si può prevenire dando alla madre subito dopo il primo parto anticorpi anti Rh.

Durante il parto può essere avvenuto questo scambio di sangue, quindi ci possono essere dei

globuli rossi del bambino in circolo nella madre. Si danno gli anticorpi anti Rh che si legano a

questi globuli rossi del bambino, i macrofagi li distruggono, e non si scatena la risposta

immunitaria, quindi anche una seconda gravidanza è tranquilla.

Questa procedura va fatta anche in caso di aborto.

Se viene praticata ad ogni gravidanza l’esito è sicuramente positivo.

Immunità passiva acquisita artificialmente consiste nell’iniezione di gammaglobuline già formate

che possono essere non specifiche, generiche, e si usano in caso di ipogammaglobulinemia per

esempio, una malattia che comporta una ridotta produzione di gammaglobuline. In genere

vengono purificate dal sangue dei donatori, o ci possono essere delle gammaglobuline specifiche

che vengono utilizzate per esempio in caso di avvelenamento acuto, punture di insetti, botulismo…

contro questo tipo di tossine.

O possono essere utilizzate in caso di infezioni, come in caso di morbillo, rabbia, e altre infezioni,

per limitare la sintomatologia o per prevenire la malattia.

Attualmente si usano quasi esclusivamente gammaglobuline di origine umana. Quelle specifiche

sono purificate da donatori che sono guariti da poco da quella malattia.

Un tempo si usavano gli animali da esperimento, che venivano immunizzati specificamente con

quel determinato antigene, per esempio il veleno di un determinato serpente. Però l’utilizzo dei

sieri preparati negli animali espone al rischio della malattia da siero, lo shock anafilattico da siero,

per via della risposta immunitaria.

Alla prima inoculazione del siero di un certo animale siamo sicuri che non succede niente, ma alla

seconda si inocula una quantità di antigeni grandissima, che può scatenare una reazione

immunitaria talmente acuta da dare lo shock anafilattico.

Si possono utilizzare anche per la profilassi post esposizione per i contatti a rischio: cioè se una

donna incinta viene in contatto con un malato di rosolia, per non ammalarsi può ricorrere all’utilizzo

di gammaglobuline specifiche contro il virus della rosolia.

Quali sono i vantaggi dell’immunità passiva? Una protezione immediata, sono già pronte.

La protezione che deriva però, non dura a lungo, dopo 15-20gg vengono completamente eliminate

le immunoglobuline. Se si usano sieri preparati negli animali, può esporre al rischio di malattia da

siero e shock anafilattico, se invece si usano sieri provenienti da donatori, può esporre al rischio

per quanto riguarda tutte le malattie che si trasmettono attraverso il sangue, come AIDS ed epatite.

Se invece di immunoglobuline si tratta di una donazione di linfociti T ci può essere il rigetto, perché

funziona esattamente come un trapianto di organo.

GENERALITA’ SUI BATTERI

Entità biologiche che sono capaci di provocare una malattia infettiva = cellulari (batteri procarioti,

miceti e protozoi eucarioti), oppure acellulari (virus, vironi…)

Batteriologia: scienza che studia i batteri procarioti, hanno dimensioni da 0,5 a 5 micrometri, i più

piccoli sono i micoplasmi, batteri privi di parete. Poi ci sono le spirochete = lunghezza di 5-250

micrometri, e molto sottili, per cui ad occhio nudo non si vedono. Alcuni batteri si vedono anche ad

occhio nudo, per esempio il Thiomargarita namibiensis, che vive al largo delle coste della Namibia,

di 0,7 millimetri, 700 micrometri.

In genere si osservano con il microscopio ottico, che ha un potere di risoluzione di 0,2 micrometri.

Si possono classificare in tanti modi, ad esempio prendendo in considerazione la morfologia

cellulare, che si può utilizzare come metodo di classificazione ed è determinata geneticamente, ed

è fissa per ogni genere e specie di battere.

Quindi avremo batteri di forma rotondeggiante che prendono il nome di cocchi, batteri a forma di

bastoncino con le estremità arrotondate che prendono il nome di bacilli, poi avremo spirilli e

spirochete con forma a spirale, e vibrioni con la forma a virgola.

La disposizione dei batteri nello spazio è dovuta al fatto che non sempre le cellule batteriche

quando si riproducono si separano l’una dall’altra, ma possono rimanere unite tra loro, per cui se i

piani di divisione cellulare sono tutti paralleli tra loro e le cellule non si staccano subito dopo la

divisione avremo delle catene di batteri, per esempio catene di cocchi. Se i piani sono

perpendicolari avremo dei raggruppamenti di quattro/otto batteri. Se invece i piani di divisione sono

disposti in modo irregolare avremo dei raggruppamenti irregolari.

I cocchi si possono presentare sottoforma di diplococchi, cioè due batteri rotondeggianti uniti

insieme, in catenelle derivanti dal fatto che i piani di divisione sono tutti paralleli e si chiamano

streptococchi, oppure in raggruppamenti irregolari che prendono il nome di stafilococchi. Se i

piani di divisione sono perpendicolari si possono avere gruppi di 4, tetradi, o di otto, le sarcine.

I bacilli si possono presentare a coppie, diplobacilli, oppure a catenelle – streptobacilli – (*). Il

microscopio elettronico a scansione fa vedere la superficie esterna dell’organismo, non sono

immagini ottenute con il microscopio ottico a scansione, che scansiona la superficie esterna.

I primi diplococchi sono Neisserie, ricordare il Neisseria meningitidis e il Neisseria gonorrhoaea, il

primo è l’agente della meningite. Quest’altri sono streptococchi, catenelle di cocchi. Gli altri in

raggruppamenti irregolari sono stafilococchi. Quello in basso che forma delle tetradi è il battere

Deinococcus radiodurans, resistente ad una gran quantità di radiazioni in grado di uccidere l’uomo,

il suo cromosoma si disgrega e poi si riassembla autonomamente.

Poi diplobacilli, quindi bastoncini uniti a coppie, streptobacilli cioè catenelle di bastoncini, questo in

fondo è lo Streptobacillus Moniliforme, l’agente della malattia da morso del gatto.

Si possono classificare per quanto riguarda le loro esigenze nutrizionali, per quanto riguarda la

fonte di energia e la fonte di carbonio, in gruppi nutrizionali. Quindi avremo fotoautotrofi che

utilizzano sia come fonte di energia che come fonte di carbonio qualcosa di inorganico, la luce

come fonte di energia e la CO2, in genere, come fonte di carbonio. Tra questi ci sono per esempio

i fagobatteri.

Fotoeterotrofi utilizzano come fonte di energia la luce e come fonte di carbonio dei composti

organici, e tra questi ci sono per esempio diversi batteri fotosintetici, e altri batteri che non sono

fotosintetici però contengono dei pigmenti colorati che servono per captare l’energia dalla luce

solare.

Poi ci sono i chemioautotrofi, che utilizzano come fonte di energia composti inorganici, ricavano

energia dalla degradazione di composti organici, e utilizzano come fonte di carbonio la CO2.

Questi sono batteri ambientali molto importanti che fanno i cicli dell’azoto, dello zolfo, del ferro,

ecc… e sono molto importanti per la vita sulla terra, però non interessano la patologia umana.

Quelli che interessano la patologia umana sono nella stragrande maggioranza chemioeterotrofi,

cioè utilizzano sia come fonte di energia che come fonte di carbonio dei composti organici. I

chemioeterotrofi a loro volta possono essere distinti in base all’accettore finale di elettroni. Se

l’accettore finale di elettroni è l’ossigeno fanno una respirazione aerobia, come quella dell’uomo

per esempio. L’accettore finale però può essere anche una molecola inorganica, per esempio il

nitrato, il fosfato, e allora avremo una respirazione di tipo anaerobio, con la formazione di

composti come l’azoto molecolare, oppure l’idrogeno solforato, a seconda di qual è la molecola

inorganica che funziona da accettore finale di elettroni. Oppure l’accettore di elettroni può essere

anche un composto organico, ad esempio soprattutto uno zucchero, come il glucosio. In questo

caso abbiamo una fermentazione anaerobia.

La fermentazione è un’ossidazione incompleta di carboidrati, ad esempio il glucosio, ma anche di

altre sostanze come amminoacidi, acidi grassi, che avviene in assenza di ossigeno. Può essere di

due tipi, omolattica, che porta alla produzione soltanto di acido lattico, come avviene per esempio

nello yogurt, oppure eterolattica in cui si forma acido lattico più altri acidi, si può formare gas

come CO2, idrogeno, ecc… per esempio il Clostridium della gangrena gassosa porta avanti una

fermentazione di questo tipo, eterolattica.

Abbiamo parlato dell’ossigeno, si possono anche classificare in base alla richiesta di ossigeno, e

avremo i batteri aerobi obbligati che vivono solo in presenza di ossigeno e che in genere fanno

una respirazione aerobia, e sono per esempio tutti quei patogeni delle vie respiratorie in genere,

come il Mycobacterium tubercolosis. Poi ci possono essere batteri anaerobi facoltativi, che sono

capaci di crescere sia in condizioni di aerobiosi – respirazione - sia in condizioni di anaerobiosi, e

in questo caso possono portare avanti la fermentazione. Alcuni di questi sono soltanto fermentativi,

come gli Streptococchi, chiamati anche microaerofili, perché vengono danneggiati da una

quantità eccessiva di ossigeno, bisogna che questo sia inferiore al 5%, e quindi nell’atmosfera

normale non crescono bene. A questo gruppo appartengono numerosi patogeni. Poi ci sono i

batteri anaerobi obbligati: si suddividono poi in “obbligati stretti”, per i quali l’ossigeno è tossico,

e non riescono a svolgere i loro processi metabolici. Appartengono a questo gruppo alcuni batteri

importanti per la patologia umana come il Clostridi, tutto il gruppo, Clostridium difficile, Clostridium

Tetani, Clostridium Botulinum ecc… e poi ci sono diversi microrganismi che si possono ritrovare

nell’apparato digerente e soprattutto nell’intestino.

Si possono poi classificare in base all’optimum di temperatura di sviluppo, cioè la temperatura

alla quale si moltiplicano e crescono. Quindi avremo organismi termofili, con una temperatura

ottimale di 55 gradi, vivono nelle acque calde, termali. I mesofili interessano la patologia umana,

perché hanno una temperatura ottimale da 32 a 37 gradi. Poi gli psicrofili che crescono a

temperature più basse, anche al di sotto dello zero, anche alla temperatura di frigorifero.

Si possono classificare in base alle loro caratteristiche tintoriali, cioè come si colorano in

laboratorio con i coloranti utilizzati. In genere per l’osservazione al microscopio dei batteri si usa

una certa colorazione altrimenti non si vedono bene. Poi hanno un indice di rifrangenza che è

vicino a quello dell’acqua, per cui non si differenziano molto dal mezzo in cui si trovano. Allora

vengono colorati per vedere meglio la loro morfologia, ma con la colorazione si possono mettere in

evidenza delle caratteristiche interne dei batteri. Una colorazione molto importante in batteriologia

ci permette di distinguere i batteri in due gruppi, i Gram+ e Gram- .

La colorazione dei Gram dà delle informazioni anche su com’è la struttura del battere, poiché il tipo

di colorazione dipende dalla loro struttura, ed è una colorazione messa a punto da Christian Gram,

medico danese.

Come si fa la colorazione dei Gram? Si prende un po’ di coltura o una gocciolina di acqua, si

deposita sul vetrino e ci si stempera un po’ di materiale preso da una colonia, poi si fissa, cioè si fa

un’operazione che fa sì che il materiale rimanga aderente al vetrino e non venga portato via nelle

fasi successive. La fissazione si può fare al calore, (*) si passa sulla fiamma il vetrino che

contiene il materiale che vogliamo colorare, oppure si può fare anche con delle sostanze chimiche.

Poi si mette un colorante, in questo caso - colorazione di Gram – si utilizza il cristalvioletto, si

lascia agire un po’, poi si sciacqua con l’acqua, si aggiunge un’altra sostanza giallina che si

chiama Lugol o soluzione iodo iodurata che non è un colorante, ma è un mordensante, cioè

facilita l’adesione del colorante al substrato, rende più stabile il legame tra il colorante e il

substrato. Si sciacqua tutto di nuovo e ci si mette un altro colorante sopra, che deve essere

diverso dal primo. Il primo era il cristalvioletto che ha un colore tra il blu e il violetto, stavolta ci si

mette un colorante rosso – fuxina o safranina – (colorazione di contrasto).

I batteri possono apparire in questo modo (*), o di colore viola-blu o rossi.

Quali Gram sono quali? I negativi sono i rossi, i positivi i blu. Questo dipende da com’è fatta la

loro parete esterna. Tutti i batteri sono circondati da una parete, e quella dei Gram+ è diversa da

quella dei Gram- . La parete dei Gram+ fa sì che quando il colore viene preso dal substrato,

quando si lega al substrato, non viene poi ceduto con i successivi lavaggi. Invece la parete dei

Gram- nei successivi lavaggi e trattamenti, cede il colore, per cui quando vado a fare la

colorazione di contrasto con il colorante rosso cosa succede? Nei Gram+ c’è già il colorante viola,

per cui non viene assorbito il rosso. Nei Gram- dopo che il colorante viola è stato portato via dalle

fasi di lavaggio e trattamenti successivi, il colorante rosso aderisce al substrato, per cui appaiono

rossi. Quindi Gram+ blu/viola, Gram- rossi.

Abbiamo parlato anche della parete, che fa parte delle strutture essenziali per la vita e la crescita

del battere. Ci sono alcune eccezioni. Oltre alla parete, partendo dall’esterno, le strutture

essenziali sono la membrana citoplasmatica che sta subito sotto la parete, verso l’interno, poi c’è

il citoplasma ma non ci sono altre membrane interne, per cui immersi nel citoplasma ci sono i

ribosomi, altre strutture fondamentali, e poi il materiale nucleare, il nucleoide o cromosoma

batterico, il DNA del battere. Queste strutture sono presenti in tutti i batteri.

La parete = la struttura più esterna. E’ rigida, per svolgere la sua funzione la rigidità è

fondamentale. Determina la forma costante, geneticamente determinata, che si mantiene nel

tempo. Essendo l’interfaccia tra l’interno e l’esterno del battere, dà una protezione al battere,

meccanica in quanto rigida, ma anche chimica e osmotica. Ci sono anche altre colorazioni che

mettono in evidenza altre caratteristiche della parete. E’ un fattore di virulenza e patogenicità, e

siccome contiene numerose molecole che possono funzionare da antigene, ha anche una

funzione immunitaria. Eccezioni: la parete è presente in tutti i batteri tranne i micoplasmi (batteri

più piccoli), le Chlamydie che hanno una parete con composizione diversa rispetto a quella di tutti

gli altri batteri, perché non contiene la componente fondamentale della parete di tutti gli altri batteri

che è l’acido muranico. Invece i micobatteri hanno una parete con una composizione diversa,

molto più ricca di lipidi. Per esempio non si colorano con la colorazione di Gram, ma hanno altre

caratteristiche. Ci sono altre entità biologiche che sono dotate di parete, per esempio le cellule

vegetali ne hanno una, ma ha una composizione diversa, è formata da cellulosa che è un

polimero del glucosio. La parete dei funghi invece contiene chitina = polimero della n-

acetilglucosammina. Sono tutti polimeri lineari che vanno a costituire queste strutture esterne alla

membrana citoplasmatica. Però sono tutte molecole semplici, formate o da ripetizioni di glucosio,

o ripetizioni di n-acetilglucosammina, ecc… invece la parete della cellula batterica non ha una

composizione così semplice, è un composto caratteristico che si trova solo nei batteri, e si chiama

peptidoglicano. Questo nome dice di cosa è formato, quindi ha una parte polisaccaridica e una

parte peptidica, si può chiamare anche mureina o mucopeptide. La parete è costituita da una

singola macromolecola che circonda tutto il battere, formata da un polimero lineare lunghissimo

che forma delle catene che sono unite tra loro da dei legami trasversali, e forma una specie di

rivestimento rigido intorno al battere, rigido e resistente, che protegge il battere dalla lisi osmotica.

In questo esempio (*) se la parete – cioè il peptidoglicano – non è integra succede che si forma il

protoplasto, il battere perde la forma, e in genere il battere si trova in un ambiente ipotonico

rispetto all’interno del battere. Al suo interno ci sono sali e altre molecole disciolte, quindi l’interno è

ipertonico rispetto all’ambiente esterno nel quale si trova, per cui succede che viene richiamata

acqua nel battere, perché si deve ristabilire un equilibrio osmotico. Se non c’è la parete intorno

viene richiamata molta acqua nel battere, e quindi questo si rigonfia finché non scoppia, e questa è

la lisi osmotica, impedita solo dalla presenza della parete rigida.

Dal punto di vista chimico abbiamo detto che la parete ha una parte peptidica e una parte

polisaccaridica. La parte polisaccaridica, il mattone fondamentale è formato da due

aminozuccheri che sono la n-acetilglucosammina e l’acido n-acetilmuranico, che sono uniti

insieme da un legame glucosidico. In alcuni testi è beta 1-6, in altri beta 1-4. Questo è il mattone

fondamentale per quanto riguarda la parte glucidica, n-acetilglucosammina e acido n-

acetilmuranico. All’acido n-acetilmuranico è legato un tetrapeptide. (*) Questi sono amminoacidi,

L-Alanina, acido d-glutammico, acido meso-diamminopimelico e D-alanina. Si vede che ci sono

anche degli amminoacidi particolari, perché si alternano. L’acido meso-diamminopimelico è di

solito presente nei batteri Gram- , mentre nei batteri Gram+ è presente la L-lisina. Questo

rappresenta il mattoncino fondamentale della mureina, del peptidoglicano. Poi succede che questi

mattoncini si legano tra loro con stavolta un legame beta 1-4 glucosidico, e formano una

lunghissima catena, alternanza di n-acetilglucosammina, acido n-acetilmuranico, al quale è legato

il tetrapeptide con quegli amminoacidi particolari. Poi succede che queste catene si uniscono tra

loro perché si formano dei legami tra gli amminoacidi del tetrapeptide. In questo modo si forma

una struttura tridimensionale. Questi legami prendono il nome di legami transpeptidici, perché

avvengono tra i tetrapeptidi di una catena e i tetrapeptidi della catena adiacente. Questo legame è

diverso, se prendiamo in considerazione i batteri Gram. Per esempio nei Gram- questo legame

avviene direttamente tra l’ultimo amminoacido di un tetrapeptide di una catena, che è la D-alanina

(l’ultimo amminoacido è sempre questo), e il penultimo che fa parte del tetrapeptide di un’altra

catena, che siccome qui siamo nei Gram- sarà l’acido diamino-pimelico. E qui si forma un

legame diretto. Mentre nei Gram+ il legame avviene sempre tra l’ultimo amminoacido del

tetrapeptide di una catena e il penultimo del tetrapeptide della catena vicina, ma stavolta il legame

non è diretto, bensì è mediato da altri amminoacidi, 3,4,5 amminoacidi che in questo esempio (*)

Staphylococcus Aureus, Gram+, il legame è mediato da 5 molecole di glicina, per cui si parla di

ponte penta-glicidico. Quindi il legame indiretto nei Gram+ mediato dal ponte pentaglicidico, tra la

D-alanina di un tetrapeptide di una catena, e la L-lisina (qui si sta parlando di Gram+ e quindi non

c’è acido diamino-pimelico ma L-lisina, al penultimo posto della catena del tetrapeptide) del

tetrapeptide di una catena vicina.

Diversi antibiotici agiscono sulla via di sintetizzazione della parete.

Come avviene la sintesi della parete?

In 3 comparti. Il comparto citoplasmatico, il comparto costituito dalla membrana della cellula

batterica, e il comparto esterno, al di fuori della membrana del battere, dove la parete si sta

formando.

Quindi si parte nel citoplasma, dove ci sono i precursori della parete.

Si parte da una molecola di n-acetilglucosammina fosfato che si lega all’uridin-trifosfato e si forma

l’UDP NAG al quale si attacca poi un piruvato, il quale viene ridotto ad acido lattico con formazione

di acido n-acetilmuranico, al quale è sempre legato l’UDP. Al NAM (acido n-acetil muranico) legato

all’UDP cominciano ad attaccarsi gli amminoacidi L-Alanina, acido D-glutammico, L-Lisina, e poi

invece della D-Alanina come abbiamo visto nell’esempio prima che è la struttura finale della

parete, in questa fase si attacca un dimero di D-Alanina, quindi due molecole di D-Alanina, non

sono solo 4 gli amminoacidi, sono cinque, e gli ultimi due sono due molecole di D-Alanina. Questa

è la fase citoplasmatica.

Poi c’è la fase di attraversamento della membrana, perché la parete si forma fuori dalla

membrana. In questa fase continua la formazione della parete, perché all’UDP NAM legato al

pentapeptide si lega anche la n-acetilglucosammina, quindi si forma il mattoncino fondamentale, e

in più si lega a una sostanza che si chiama bactoprenolo o undecaprenilfosfato, che è un lipide,

che ha la funzione di trasportare questi mattoncini al di fuori della membrana citoplasmatica. Al di

fuori c’è la parete che si sta formando, per cui quando questi mattoncini, o corti polimeri di parete

arrivano all’esterno della membrana citoplasmatica, si devono formare dei legami glicosidici con la

parete che sta crescendo, e i legami transpeptidici tra i tetrapeptidi – sono ancora tetra, ci sono

sempre due D-Alanine terminali -. Si stacca l’ultima D-Alanina e l’energia derivante da questo

distacco viene utilizzata per l’inserimento di questi frammenti che si sono già costituiti durante

questo percorso, nei siti in cui si sta allungando la parete, si sta formando. La cosa importante da

ricordare, a parte i passaggi, è che questi enzimi che catalizzano la transpeptidizzazione, cioè la

formazione dei legami transpeptidici, e gli enzimi che catalizzano la formazione dei legami

glicosidici, sono enzimi ai quali si possono attaccare, si possono legare le penicilline e le

cefalosporine, per cui vengono detti PBP, penicilline binding proteins. “Proteins” non sono altro

che gli enzimi che servono per la transpeptidizzazione e la formazione del legame betaglucosidico,

in modo da inserire i mattoncini nella parete che si sta formando.

(*) = questa immagine rappresenta la parete dei Gram+ e dei Gram-.

Infatti se si osservano al microscopio si vede la membrana citoplasmatica formata dai fosfolipidi

con la testa polare rivolta verso il citoplasma e verso l’esterno, e le code all’interno. Al di sopra di

essa c’è questo spesso strato di peptidoglicano marrone nei Gram+, mentre nei Gram- la struttura

è diversa.

Nei Gram- c’è lo strato marroncino è molto più sottile, e sopra c’è un’altra membrana.

Praticamente i Gram- sono l’unico esempio in biologia di cellula circondata da due membrane,

quella parte esterna prende il nome di membrana parietale esterna.

Gram+ = hanno uno strato molto alto di peptidoglicano, molecole lineari tutte unite tra loro in modo

lineare mediante questi legami transpeptidici indiretti, mediati dal ponte pentaglicidico oppure altri

amminoacidi a seconda della specie del battere Gram+. Tutti quanti sono legati insieme, e queste

strutture si sovrappongono in modo da costituire tanti strati fino ad uno spessore piuttosto

rilevante, 80-90 nanometri.

(*) altra immagine = il peptidoglicano è rappresentato come queste molecole lineari che però sono

intersecate da altre molecole che si dispongono in modo perpendicolare. Queste molecole sono di

acidi teicoici. Questi acidi sono polimeri di alcol polivalenti – glicerolo o ribitolo – che sono

esterificati con l’acido fosforico, e prendono il nome di acido ribitol-teitoico, o acido glicerol-

teitoico. A questi possono essere legati monosaccaridi, amminoacidi, che vanno a sostituire

variamente i gruppi OH, e sono quelli che sporgono dalla cellula, attraversano lo spessore del

peptidoglicano e sporgono dalla cellula. Hanno varie funzioni. Funzione di adesione per esempio.

Hanno anche una funzione di protezione, legano i cationi per esempio, e costituiscono un letto

anionico capace di legare diverse molecole come magnesio, fattori che servono per la funzionalità

di diversi coenzimi, e poi fornirli alla cellula. Alcuni di questi acidi teicoici legano anche i lipidi, per

cui si parla di acidi lipoteicoici. Questi hanno una disposizione diversa, in genere non sporgono

dalla cellula, e hanno la funzione di ancorare il peptidoglicano alla membrana citoplasmatica, con

la parte lipidica dell’acido lipoteicoico prendono contatto con i fosfolipidi della membrana e

ancorano lo strato di peptidoglicano alla membrana citoplasmatica. Altri costituenti della parete dei

Gram+ possono essere proteine, per esempio la proteina A dello Staphylococcus aureus, la

proteina M, che insieme agli acidi teicoici serve perché lo Streptococcus pyogenes possa aderire

alle altre cellule, oppure possono contenere numerosi lipidi, l’esempio classico è quello del

Mycobacterium Tubercolosis.

La conformazione della parete dei micobatteri è diversa, (*) a destra, perché contiene molti acidi

micolici e cere. Gli acidi micolici sono degli acidi grassi a catena molto lunga, fino a 70 atomi di

carbonio, con la porzione polare rivolta verso la membrana plasmatica, e la testa apolare rivolta

verso l’esterno. In questo modo hanno una funzione di protezione nei confronti della cellula del

Mycobacterium tubercolosis. Però la parete dei micobatteri contiene anche peptidoglicano. Questo

(*) è un altro schema della parete dei batteri Gram+ con gli acidi teicoici che sono quelli in nero, i

lipoteicoici che collegano il peptidoglicano con la membrana citoplasmatica e ribitol-teitoico e

glicerol-teitoico che invece sporgono all’esterno con funzione di protezione ed ancoraggio.

Nei Gram+ la parete è molto più spessa, ma è costituita quasi interamente da peptidoglicano.

Invece nei Gram- è molto più complicata. All’esterno della membrana plasmatica c’è uno strato di

peptidoglicano, queste molecole lineari gialle, poi c’è uno spazio – lo spazio periplasmatico – e poi

ancora più esternamente la membrana parietale esterna, che è fatta come tutte le membrane

biologiche, con un doppio strato di fosfolipidi. Però in questo caso lo strato più interno è costituito

dai soliti fosfolipidi con la testa polare, le code apolari, ecc…, lo strato più esterno invece è

diverso, è costituito da un componente che si ritrova soltanto nei batteri Gram- che è il

lipopolisaccaride. Quindi spessore minore rispetto ai Gram+, meno peptidoglicano, che ha anche

delle caratteristiche diverse perché ci sono meno legami trans peptidici; soltanto il 50% dei

tetrapeptidi sono legati ad altri tetrapeptidi, e in modo diretto, non con il ponte amminoacidico. Ne

consegue una struttura meno compatta rispetto ai Gram+.

Invece nei Gram- non tutti i tetrapeptidi sono legati tra loro. Quindi meno strati e meno legami

transpeptidici, struttura meno consistente, più lassa.

Al di sopra del peptidoglicano c’è lo spazio periplasmatico o periplasma. Questo è uno spazio ben

definito, e anche abbastanza rilevante, perché rappresenta il 20-40% del volume di tutta la cellula.

Contiene un gel nel quale sono immerse proteine, soprattutto proteine ad azione enzimatica. Sono

proteine in grado di digerire per esempio il DNA dei batteriofagi, oppure degradare le molecole di

antibiotico che riescono a penetrare nella membrana parietale esterna. E’ un sistema molto

efficiente, perché in questo comparto chiuso si trovano queste proteine ad attività enzimatica. Nei

Gram+ ci sono queste molecole enzimatiche, sono prodotte dal battere, però sono all’esterno,

passano al di fuori del peptidoglicano, e c’è una notevole dispersione, mentre il sistema dei batteri

Gram- è più efficiente. La membrana parietale esterna (*) è la parte più esterna della cellula, e

quindi ha funzione di protezione, per cui è costituita in modo da essere poco permeabile

soprattutto verso le sostanze idrofobe, che sono quelle che maggiormente possono creare danni

alla cellula, ed è relativamente permeabile alle sostanze idrofile. E’ simmetrica la parte che

guarda verso la cellula i soliti fosfolipidi, invece la parte che guarda verso l’esterno ha un composto

particolare, il lipopolisaccaride, LPS, quello riconosciuto dai Toll Like Receptor, per esempio,

come una molecola che è presente in grossi gruppi di agenti biologici estranei, agenti infettivi, ed è

presente in tutti i batteri Gram-, fa parte della parete dei batteri Gram-,

Lipopolisaccaride = fatto da una parte lipidica e una polisaccaridica.

Infatti è formato, partendo dall’interno verso l’esterno, da una parte lipidica, il lipide A = tossico,

endotossina, dove “endo” vuol dire che fa parte della cellula, non che sta dentro. Al lipide A è

legata una porzione polisaccaridica che si differenzia in due parti, una più vicina al lipide A che

costituisce il core o parte centrale, ed ha una struttura formata da zuccheri, che è costante in tutti i

Gram-, o perlomeno in tutti i Gram- appartenenti alla stessa specie. Segue poi una lunga catena

polisaccaridica che sporge dalla cellula, formata da zuccheri particolari, che sono diversi non solo

da una specie batterica all’altra, ma anche all’interno della stessa specie. Siccome hanno delle

spiccate proprietà antigene, ci permettono di distinguere all’interno di una stessa specie, batteri

con caratteristiche antigeniche diverse. E questa parte polisaccaridica che sporge fuori dalla

cellula prende il nome di antigene O.

Ricapitolando.

Lipide A, praticamente è un lipolipide, perché formato da un disaccaride, formato da n-

acetilglucosammina fosforilata NAG (*), e a queste molecole sono legati degli acidi grassi saturi a

catena lunga, che vanno a interagire con le code apolari del foglietto interno della membrana

parietale esterna. Segue poi la parte centrale, il core, formato da catene di zuccheri particolari che

si trovano solo nei batteri (eptoso, KDO = acido chetodesossioctonoico). Zuccheri particolari che

però si ritrovano in tutti i Gram- e questa parte qui è costante. Segue poi l’antigene O che non è

costante, ma varia all’interno della stessa specie, ed è un polisaccaride formato dalla ripetizione

anche per 40 volte di subunità formate da 3-4-5 zuccheri diversi, e sporge dalla cellula batterica.

Il lipide A è la cosiddetta endotossina, e contiene queste code polari, questi acidi grassi, che

servono a collegare il lipopolisaccaride al foglietto interno. Questi acidi grassi prendono rapporti

con le code apolari del foglietto interno della membrana parietale esterna. (*) Il foglietto esterno è

quello giallino più in alto. Le code prendono rapporto col foglietto interno, e quindi servono da

collegamento. Anche il core serve da collegamento tra l’antigene O e il lipide A. L’antigene O ha

funzione di protezione, perché queste strutture polari sono in grado di legare ioni, soprattutto

cationi bivalenti, che formano ponti con i cationi bivalenti, in modo da stabilizzare tutta la struttura,

renderla compatta, e sicuramente non fanno passare le molecole apolari, che sono quelle più

dannose per la cellula batterica, e rendono difficile anche il passaggio delle molecole polari. Infatti

nella membrana parietale esterna sono inserite delle proteine chiamate porine, che si riuniscono

insieme e formano dei fori nella membrana parietale esterna, rendendo possibile la diffusione

passiva delle molecole polari, idrofile, che altrimenti non riuscirebbero a passare nella cellula.

(*) Schema della parete dei batteri Gram- = complicata. Diversa rispetto alla parete dei funghi.

Deve efficientemente regolare gli scambi e non solo, deve proteggere la cellula. Al di sotto della

parete c’è la membrana citoplasmatica, ed ha la stessa struttura delle membrane biologiche

(fosfolipidi…). E’ caratterizzata, rispetto alle altre membrane della cellula eucariotica, dal fatto che

non ci sono gli steroli = nella membrana della cellula eucariotica servono per renderla più fluida.

Invece qui non ci sono, però ci sono un numero maggiore di proteine, che servono da regolatore di

scambi che possono avvenire anche nella cellula eucariotica. Nella membrana della cellula

batterica possono svolgersi delle sintesi importanti, abbiamo visto la sintesi della parete, che ha

una fase che avviene durante l’attraversamento della membrana citoplasmatica. Ma la membrana

citoplasmatica è importante anche per la duplicazione del cromosoma batterico, e poi per quei

batteri che fanno la respirazione, è sede degli enzimi della catena respiratoria. Il citoplasma è

formato principalmente da acqua, è un gel in cui ci sono molte macromolecole disciolte, e tanti sali

inorganici che lo rendono ipertonico rispetto all’ambiente esterno. Inoltre è presente RNA

messaggero per la sintesi delle proteine, RNA associato ai ribosomi e RNA di trasferimento. Altra

struttura sono i ribosomi = rispetto alla cellula eucariotica hanno una costante di sedimentazione

minore, però sono costituiti come nelle cellule eucariotiche da due subunità, la più grande ha

forma che presenta concavità, in cui si adagia la subunità più piccola. Sono costituiti da r-Rna e

proteine. La subunità più grande contiene 34 proteine e due tipi di RNA. La subunità più piccola

contiene 21 proteine e un solo tipo di RNA.

Altra struttura essenziale è il materiale genomico del battere, costituito da DNA, è a doppia elica

e non presenta estremità libere. Quindi si dice che è circolare ma prende forme diverse. Al DNA

dei batteri non sono legati istoni ma sono legate delle proteine acide che si staccano facilmente dal

DNA. In genere il materiale genomico si raggruppa in un punto ben preciso della cellula, che

quando si osserva al microscopio si vede una colorazione diversa, o è meno colorato, e questo

punto si chiama nucleoide. Non c’è una membrana nucleare, perché la cellula è procariotica, e

quindi non ci sono membrane interne.

GENETICA E RIPRODUZIONE BATTERICA

Strutture accessorie, non indispensabili per la vita del battere. Quindi sono presenti in alcune

specie, in altre no, o sono presenti in una parte del loro ciclo vitale, e non costantemente.

Spora = forma di resistenza del battere, deriva dalla trasformazione della forma vegetativa

normale in un’altra forma completamente diversa e che serve al battere per resistere in condizioni

ambientali avverse.

Esterno: la capsula e gli strati mucosi.

Si tratta di una sostanza amorfa, in genere costituita da polisaccaridi, polimeri polisaccaridici, che

vanno a costituire o uno strato esterno al battere, ben formato e aderente alla superficie esterna

del battere detta capsula, oppure uno strato non ben organizzato che sembra si distacchi dalla

superficie esterna del battere stesso, che prende il nome di glicocalice o strato mucoso. E’

formato soprattutto da polisaccaridi lineari, in alcuni casi può essere anche poliamminoacidico ma

mai costituito da proteine vere e proprie.

Questa struttura, la capsula, è accessoria, quindi solo in alcune specie è presente, e poi non è

presente costantemente durante il ciclo vitale del battere stesso. Spesso i batteri patogeni che si

isolano dal malato, presentano una capsula ben evidente, e invece quando si coltivano in

laboratorio in vitro, nei terreni artificiali, quando vado ad osservarli al microscopio non vedo la

capsula, perché è un importante fattore di virulenza, è un fattore che contribuisce a dare

protezione al battere stesso. Come? Lo protegge dalla fagocitosi, e soprattutto impedisce

l’opsonizzazione = si può avere ad opera della componente 3B del complemento, che si lega al

battere da una parte, e a recettori specifici sulla cellula fagocitaria dall’altra, e questo fa sì che

venga più facilmente fagocitata, oppure si deve agli anticorpi, con forma a Y, dove c’è il sito di

reazione specifica con l’antigene, la parte variabile della catena proteica che reagisce

specificamente con l’antigene, e quindi si legano da quella parte lì col battere, mentre sporge il

frammento FAB. Sulle cellule fagocitarie ci sono recettori per il frammento FAB, il legame con il

recettore favorisce la fagocitosi del battere. Se questi antigeni di superficie del battere sono

ricoperti dallo strato mucoso o dalla capsula, l’opsonizzazione non può avvenire, ed impediscono

anche l’attivazione del complemento. L’attivazione del complemento per la via classica avviene

tramite due immunoglobuline G legate al battere, ma se questo legame non è possibile non si ha

nemmeno l’attivazione del complemento. Lo stesso, l’azione degli antibiotici viene diminuita perché

una parte di questi viene assorbita in questa matrice polimerica, quindi è un importante fattore di

virulenza la capsula. Poi in alcuni casi serve per l’adesione del battere alle mucose o a superfici

inerti. Per esempio lo Streptococcus Mutans, che è stato ritenuto responsabile dell’avvio del

processo della carie, utilizza proprio la capsula per aderire alla superficie dei denti. La capsula poi

ha anche altre funzioni, come proteggere il battere dall’essiccamento. Può costituire una riserva di

costituenti, può costituire un deposito di sostanze di rifiuto. Può servire per l’adesione perché,

soprattutto il glicocalice, è la componente essenziale per la costituzione del biofilm. Il biofilm è una

comunità di microrganismi immersi in una matrice amorfa, che aderisce ad una superficie che può

essere biologica – i tessuti dell’ospite – oppure inerte. La presenza del glicocalice favorisce la

formazione del biofilm. Negli ultimi anni si è scoperto che la formazione di biofilm aumenta

notevolmente la virulenza dei batteri, e aumenta la resistenza agli antibiotici.

Sempre dall’esterno, appendici che possono essere presenti al di fuori della superficie del battere.

I pili e le fimbrie: sono appendici filamentose, anche di notevole lunghezza, che si ritrovano

soprattutto nei batteri Gram- e queste appendici sono formate dalla ripetizione di 1-2 proteine che

prendono il nome di pirine, sono proteine globulari che si organizzano in una simmetria elicoidale

a formare queste strutture cilindriche rigide.

I pili e le fimbrie possono essere più o meno numerose, ci sono batteri che possiedono molte di

queste appendici, anche 100-300 per ogni cellula, e sono lunghe 0,5/6 micrometri al massimo, e

possiamo distinguere i pili comuni che servono per l’adesione, sono organi di ancoraggio, e

vedremo come condizionano anche la patogenicità dei microrganismi. Le fimbrie hanno la stessa

funzione, sono strutture deputate all’ancoraggio del battere alla mucosa, ma sono più grandi dei

pili, non sono cave e sono più efficienti nello svolgere questa funzione.

Poi ci sono i pili sessuali = sono meno numerosi delle fimbrie e dei pili comuni, sono al massimo

una decina per cellula, sono più lunghi e più larghi e sono cavi, perché devono permettere il

passaggio di materiale al loro interno. Sono codificati da fattori extracromosomici, perché nella

cellula batterica oltre al DNA del battere ci sono anche altre molecole di DNA circolare, il DNA dei

plasmidi. I pili sessuali sono codificati da plasmidi.

Poi ci sono i flagelli = ugualmente delle appendici filiformi che sporgono dalla superficie del

battere, e sono in genere molto più lunghi rispetto ai pili e alle fimbrie (15-20 micrometri). La loro

funzione è diversa, sono organi di movimento. Li possiedono quei batteri che si muovono. I cocchi

rotondi non si muovono, stanno in ambiente secco. I bacilli hanno i flagelli. Sono quindi l’organo di

propulsione dei batteri, e sono implicati in particolare nella chemiotassi = un moto direzionato che

fa sì che il battere si avvicini per esempio nella zona dove sono presenti i nutrienti, sostanze

attrattive, e che si allontani dalla zona dove invece ci sono sostanze che possono essere dannose

per il battere. Esperimento con il capillare. Se non contiene niente viene messo in una

sospensione con batteri, e non succede niente. Se attraverso questo capillare si fa uscire del

materiale nutriente, come amminoacidi, zuccheri ecc… si ottiene che i batteri si muovono e si

addensano nel punto in cui escono i nutrienti. Viceversa, se facciamo uscire un acido, una

sostanza dannosa per il battere, questi si allontanano. Nel primo caso abbiamo una chemiotassi

positiva, nel secondo caso negativa. Questo è possibile per il moto dei flagelli = questi non si

muovono per ondulazione come le ciglia dell’epitelio ciliato delle cellule eucariote per esempio, ma

si muovono rotando, come l’elica di un elicottero, e gira a 10-100 giri al secondo, in senso orario o

antiorario. E’ il senso della rotazione del flagello che determina la direzione del moto del battere,

perché ci sono dei campionatori che si possono trovare o nello spazio periplasmico della

membrana dei Gram- oppure sulla parete dei Gram+, che fa dei campionamenti direzionali, in

modo da dare informazioni per la direzione del moto al battere stesso. (*) come possono essere

disposti i flagelli, avremo batteri con uno o più flagelli, monotrico, anfitrico, ecc… (*) foto con

esempi di movimento. A sinistra c’è il Proteus Vulgaris che è un battere peritrico, e quella sotto è

una piastra Petri dove è stato seminato al centro il Proteus Vulgaris, e le onde che si vedono sono

dovute ai batteri che si muovono verso l’esterno della piastra. (*) com’è fatto il flagello. Il flagello è

formato da proteine tutte uguali che si chiamano flagelline, che si organizzano a formare il

filamento, la parte che sporge dalla cellula batterica. Questo filamento è seguito da un’unica

proteina che si chiama uncino, proprio perché ha questa forma ricurva, ed è un’unica proteina che

mette in comunicazione il flagello con quest’altra parte che invece sta immersa nella membrana

citoplasmatica – questo è di un Gram- . Nei Gram+ è diversa. L’uncino dei Gram- mette in rapporto

il filamento con le altre strutture che stanno nella parete e nella membrana. Queste strutture sono

formate da anelli, e anche se queste strutture sono diverse tra Gram- e Gram+, vanno tutte a

formare questo corpo basale dove possiamo distinguere un anello MS collegato alle proteine MOT

che sono le proteine che servono per il movimento, che avviene con un moto di protoni, e poi ci

sono le proteine FLI che sono quelle che danno il senso di rotazione, quelle che invertono il

movimento del flagello stesso. Sono immerse nella membrana. La parete è indispensabile, senza

questa i batteri non si muovono. Serve una struttura rigida di ancoraggio perché possa avvenire

questo movimento.

(*) un altro tipo di flagelli = endoflagelli. Hanno sempre funzione di movimento ma avviene in

modo diverso. Quello che si vede non è il flagello ma è tutta la spirocheta, è tutto il battere che

possiede gli endoflagelli che si muove con questo movimento a spirale. In questo caso

l’endoflagello prende origine sempre nello stesso modo, dalla membrana citoplasmatica attraversa

lo strato di peptidoglicano, ma non fuoriesce dalla cellula. Percorre tutta la lunghezza del battere

tra il peptidoglicano e la membrana parietale esterna. E’ tipico dei batteri Gram- e si trova nello

spazio periplasmico. Per esempio il Treponema pallidum, e quindi il battere si muove in questo

modo, a spirale.

Le inclusioni citoplasmatiche ci possono essere anche nei batteri. Ricordare che non ci sono

vacuoli nel battere, non ci sono membrane interne, per cui questi sono semplicemente granuli di

sostanze varie, in genere di riserva, quindi possono essere della composizione più varia,

glicogeno, polisaccaridi, quella al centro è la (*) Thiomargarita namibiensis, è il battere più grande

che si conosce, arriva fino a 700 micrometri (0,7 millimetri) e contiene dei granuli che sono sia di

zolfo che di nitrati, e servono al battere per il suo metabolismo. Questo a destra (*) è l’agente della

difterite, e quei pallini rossi sono granuli di polifosfati che sono metacromatici, cioè se io coloro con

un certo colorante, in questo caso un colorante verde, queste sostanze assumono una colorazione

diversa, in questo caso rossa, e può essere molto utile quando si fa uno striscio di materiale per

individuare questi microrganismi.

Poi ci sono i mesosomi = presenti soprattutto nei batteri Gram+ e sono costituiti da invaginazioni

della membrana citoplasmatica, hanno varie funzioni, partecipano a diversi processi come la

fosforilazione ossidativa per quei batteri che la fanno, poi la biosintesi della parete, la duplicazione

del cromosoma, però non è stato ben chiarito ancora quale sia la loro funzione principale.

Le spore = derivano dalla trasformazione della cellula batterica normale, la loro forma vegetativa

normale. La formazione della spora inizia quando le condizioni ambientali sono sfavorevoli, ad

esempio per mancanza di acqua o altri nutrienti, in condizioni di temperatura non ottimale per lo

sviluppo del battere, però ci sono dei batteri che pur avendo la capacità di formare la spora, fanno

il loro ciclo vitale senza mai formarla, cioè se queste condizioni ambientali rimangono favorevoli.

Quindi non è una tappa obbligata del ciclo di sviluppo del battere. Ricordare che non è una forma

di riproduzione del battere, ma è un tipo di differenziamento cellulare a partire dalla cellula in forma

vegetativa. Hanno delle caratteristiche completamente diverse rispetto alla cellula vegetativa, per

esempio non hanno per niente metabolismo, e quindi non hanno esigenze di acqua, né di nutrienti.

Per i batteri che utilizzano l’ossigeno non hanno esigenza di ossigeno. Sono resistenti a tutta una

serie di fattori fisici e chimici, e anche agli antibiotici, ai solventi, alle temperature estreme. Per

esempio 100 gradi non riescono ad uccidere una spora, sono necessari 121 gradi per 15/30

minuti. Mentre la maggior parte delle forme vegetative dei batteri, a 80 gradi per 10/15 minuti sono

già morti. Questo ha delle implicazioni pratiche notevoli, per esempio per la preparazione di

conserve alimentari, oppure per la sterilizzazione del materiale sanitario, bisogna sterilizzare alla

temperatura giusta. Possono resistere senz’acqua anche a temperature molto basse, quindi per

l’ambiente rimangono molto a lungo, decine di anni, anche 40 anni.

Se le condizioni ambientali tornano favorevoli sono capaci di riassumere acqua, rigonfiarsi,

germinare, e dare luogo di nuovo alla forma vegetativa del battere.

Come sono fatte le spore?

Sono fatte da strati concentrici. La parte centrale, il core, rispecchia la struttura della forma

vegetativa, quindi ci sarà un citoplasma ma molto modificato, che ha perso quasi tutto il contenuto

di acqua, è un gel denso dove ci sono i ribosomi, qualche proteina ecc… Il materiale genomico è

addossato sulla faccia interna della membrana della cellula batterica, cui segue una serie di strati

concentrici che hanno la funzione di proteggere questo core centrale. Sopra la membrana

citoplasmatica della cellula c’è la corteccia, formata da due parti, una più interna che non è altro

che il residuo della parete del battere, che quindi è formato da peptidoglicano con molti legami

trasversali, e non verrà perso durante la germinazione della spora, ma andrà a costituire proprio la

parete della nuova forma vegetativa del battere. Segue un altro strato non molto spesso più

trasparente agli elettroni, che invece è costituito da un peptidoglicano più lasso, con meno legami

transpeptidici, e contiene una gran quantità di una sostanza, l’acido dipicolinico, sottoforma di

dipicolinato di calcio, che serve a stabilizzare tutta questa struttura e a renderla più resistente.

Sopra la corteccia ci sono le tuniche, distinte sempre al microscopio elettronico, in tunica esterna e

interna, però sono costituite tutte da proteine soprattutto, contenenti amminoacidi in particolare

valina, serina e soprattutto cisteina. Questa è un amminoacido che è capace di formare legami,

ponti di solfuro, con amminoacidi uguali. La formazione di tutti questi ponti di solfuro rende tutta

questa struttura rigida (rigidità data dalle tuniche) e resistente ai solventi, alle alte temperature, agli

antibiotici.

All’esterno ci può essere un’altra struttura chiamata esosporio, che ha una struttura simile alle

membrane citoplasmatiche normali, contiene fosfolipidi, proteine e anche acidi teicoici. La

sporulazione è un processo rapido, avviene in 90 minuti fino a un massimo di 8 ore, e dapprima si

forma un’endospora che può essere vista molto bene al microscopio ottico, può essere centrale o

periferica (*) come in questo caso, e si vede bene perché non prende il colore, perché è rivestita

da tutti questi strati impermeabili, e appare molto rifrangente. (*) Clostridio, che ha la spora ad

un’estremità del battere. Poi si disgrega il resto del battere e rimangono soltanto le spore, che

possono rimanere nell’ambiente esterno per tantissimo tempo, e rimanere ancora capaci di dare la

forma vegetativa attraverso la germinazione. Il processo di germinazione viene attivato (anche in

laboratorio con uno shock termico) dalla presenza di nutrienti come glucosio, certi amminoacidi,

l’L-Alanina, l’asparagina, ecc… dopodiché si ha la vera e propria germinazione della spora.

Incomincia ad assorbire acqua, quindi si ha un rigonfiamento della spora, una parziale

disgregazione delle tuniche sporali, la perdita della resistenza (perché le tuniche si stanno

disgregando), la perdita del dipicolinato di calcio, e di una parte dei componenti della corteccia,

che vengono degradati da degli enzimi, autolisine.

E poi c’è la sintesi delle nuove componenti, e come si vede (*) in fondo a destra, il battere sembra

che emerga dai resti delle tuniche. Questo battere che germina è praticamente una nuova forma

vegetativa, e quindi metabolicamente attiva, mentre la spora è metabolicamente inerte, e quindi ha

perso la resistenza, però questo processo di sporificazione gli ha permesso di superare una fase

inadatta alla sua sopravvivenza.

Quali sono i batteri che possono formare la spora?

Solo i bacilli, i batteri a forma di bastoncino, non i cocchi, e tra i bacilli quelli che interessano

l’uomo sono quelli appartenenti al genere Bacillus, il Bacillus Antracis per esempio, aerobio e

anaerobio facoltativo, Gram+. In relazione agli animali carbonchio. Gli animali che morivano

venivano sepolti nei pascoli, e il battere una volta che l’animale era stato degradato si trova in una

condizione sfavorevole, quindi produce le spore che rimangono a lungo nel terreno, anche per

40-50 anni. Possono essere portati in superficie dai lombrichi, si possono disperdere con la

polvere nell’aria o depositare sui vegetali, così gli erbivori mangiandoli si infettano di nuovo, la

spora penetrata nell’animale germina, e i batteri si riproducono e danno la malattia. Dopo che

Pasteur mise a punto il vaccino, la patologia umana è praticamente scomparsa, però nell’800 si

ammalavano soprattutto gli addetti ai lavori, e poi c’è stato l’episodio delle lettere con la polvere

bianca dopo l’11 settembre. L’altro è il Bacillus thuringensis, batterio sporigeno che vive nel

terreno. Quando viene ingerito, mediante vegetali contaminati, il battere sporula nell’ospite

stavolta, per cui non ingeriamo le spore ma la forma vegetativa, per cui nell’ospite sporula perché

si trova in un ambiente non adatto, e durante questo processo libera delle tossine che

danneggiano il tratto digerente oppure causano una malattia paralitica, ma non nell’uomo, di larve

e ditteri come le zanzare, e causa la paralisi di bruchi e lepidotteri. Infatti è il cosiddetto insetticida

biologico. Altro battere che può sporulare sono i batteri del genere Clostridium. I clostridi sono

anaerobi, Gram+, vivono come saprofiti nell’ambiente esterno, oppure fanno parte del microbiota

intestinale di diversi erbivori. Il Clostridium difficile può far parte anche del microbiota dell’intestino

umano.

Genetica batterica. Tutte le cellule batteriche possiedono del materiale filamentoso che è

costituito da DNA a duplice spirale che è immerso nel citoplasma, non è separato da esso da

nessuna membrana dal resto del citoplasma. Quindi si raccoglie in una zona precisa del

citoplasma che può prendere il nome di nucleoide. E’ molto lungo, fino a 1mm, per cui è super

avvolto, cioè avvolto due volte. Oltre a questo si dispone a formare delle anse che vengono tenute

stabilizzate da delle molecole di RNA. Non ha estremi liberi. Per quanto riguarda l’organizzazione

dei geni nel DNA del cromosoma batterico, bisogna dire che i geni sono senza introni, per cui c’è

la colinearità tra la sequenza delle basi azotate e quella degli amminoacidi della proteina che il

gene codifica. La lunghezza è di 1000-5000 geni, che corrisponde a 1-5 milioni di paia di basi,

perché si calcola che 1000 basi corrispondano a una chilobase che corrisponde a un gene in

genere. Quasi tutta la sequenza del DNA del battere codifica per delle proteine oppure per

elementi che servono per la regolazione della trascrizione. I geni sono organizzati in operoni, sono

una serie di geni che codificano per funzioni correlate, codificano per proteine che in genere

servono per la stessa funzione, e la loro espressione è regolata da uno stesso promotore, in modo

che vengono sintetizzate insieme tutte queste proteine che servono per la stessa funzione.

Oltre al materiale genetico batterico, presente in ogni battere, ci sono altre unità accessorie che

sono i plasmidi, anch’essi costituiti da DNA in forma circolare.

Come si duplica il DNA?

E’ di tipo semiconservativo come quella delle cellule eucariotiche, cioè la duplice spirale del DNA si

apre, un enzima – elicasi – rompe i legami tra le basi azotate, e ciascuno dei due filamenti separati

funziona da stampo per la DNA polimerasi, che sintetizza il filamento mancante, così che si

abbiano due copie identiche del DNA.

Nella Escherichia Coli sono state identificate almeno 3 DNA polimerasi, di cui la DNA polimerasi è

quella principalmente implicata nella duplicazione del DNA, mentre la DNA polimerasi 1 è

implicata nella riparazione e un po’ nella replicazione e la 2 solo nella riparazione del DNA. (39:50)

La duplicazione del DNA batterico inizia in un punto ben preciso “origine della duplicazione”, la

elicasi rompe i legami tra le basi azotate e si inizia a formare la forcella di replicazione, poi (*) la

replicazione prosegue in tutte e due le direzioni, e quindi si ferma nel punto opposto dell’origine. In

questo modo abbiamo ottenuto due copie perfette del DNA di partenza. Questa (*) è un particolare

della forcella di replicazione. Il DNA nel battere rimane sempre circolarizzato, la molecola non si

apre, e questo crea più problemi durante la replicazione a causa degli avvolgimenti del DNA, per

cui ci sono diverse topoisomerasi. La topoisomerasi 1 che rimuove gli avvolgimenti eccessivi e

rilassa il DNA durante la replicazione, e poi serve anche a separare le due molecole di DNA, e poi

la DNA girasi, che è una topoisomerasi di tipo 2 che ha bisogno dell’ATP per svolgere la sua

funzione, che invece è capace di tagliare i filamenti di DNA ed è responsabile sia del rilassamento

durante la replicazione del DNA, che del superavvolgimento dopo la replicazione.

Come si replicano i batteri?

Per schizogonia, o divisione semplice, processo mediante il quale da una cellula madre si

formano due cellule figlie identiche. La divisione del battere è sincrona con la duplicazione del

DNA. Il DNA per riprodursi si lega ad un punto ben preciso della membrana citoplasmatica. Nel

caso della presenza di mesosomi, può essere un mesosoma, oppure può essere un altro punto

della membrana citoplasmatica. Questo legame non è presente costantemente nel battere, ma

solo quando inizia il processo di duplicazione del DNA. Poi inizia la duplicazione del DNA e nello

stesso tempo si duplica anche questo punto di ancoraggio alla membrana, comincia a formarsi

della nuova membrana nella parte centrale del battere, in modo che questi due punti di

ancoraggio, meccanicamente vengono allontanati l’uno dall’altro perché cresce la membrana tra

questi due punti, e quindi la cellula batterica si allunga. Quando si è allungata la membrana

comincia a dirigersi in senso centripeto, cioè verso il centro del battere, fino a che non si forma un

setto di membrana. Contemporaneamente anche la parete si sta accrescendo, e si forma anche

un setto di parete che se è completato provoca la divisione delle due cellule batteriche. Se non si

completa determina la disposizione spaziale dei batteri che abbiamo visto precedentemente,

streptococchi, stafilococchi, sarcine, tetradi, ecc…

In questo processo di divisione semplice non si forma il fuso mitotico, come si forma invece nelle

cellule eucariotiche, però questo sistema di ancoraggio alla membrana citoplasmatica fa sì che i

due cromosomi batterici siano ripartiti in modo esatto nelle due cellule figlie, è un processo molto

semplice che però porta alla formazione di due cellule figlie identiche.

C’è anche dell’altro DNA nei batteri, non indispensabile per la vita del battere, ma presente in

quasi tutti i batteri; si tratta dei plasmidi. Il DNA del plasmidi in genere è circolare, a duplice spirale

circolare, con una lunghezza che va da 1.000 a 200.000 paia di basi. Non è presente un solo

plasmide, ma in genere ce n’è più di uno nella cellula batterica. Quelli più grossi sono presenti in

poche copie, 4-5 massimo 10, mentre quelli più piccoli possono essere anche molto numerosi

nella cellula batterica. Questo DNA extracromosomico si replica in modo sincrono con il

cromosoma batterico, e viene trasmesso perfettamente alle cellule figlie, quindi c’è una possibilità

di trasmissione verticale del plasmide. Alcuni plasmidi sono capaci di integrarsi nel cromosoma

batterico e prendono il nome di episomi. I plasmidi, a differenza dei virus, non hanno mai una vita

extrabatterica, non hanno una vita al di fuori del battere, ma si ritrovano soltanto all’interno di esso,

e vedremo che possono essere trasmessi anche da una cellula batterica all’altra, oltre che dalla

cellula madre alle cellule figlie. Non sono indispensabili, ma interessano perché codificano per

funzioni accessorie che possono essere molto importanti, hanno dei risvolti importanti per quanto

riguarda la patologia umana.

Si parla di funzioni metaboliche che per esempio permettono al batterio di utilizzare certe sostanze

nutritive, che altri che non possiedono il plasmide non possono utilizzare.

Oppure i plasmidi di resistenza = molto importanti per quanto riguarda la patologia umana.

Resistenza può essere una resistenza a agenti fisici come i raggi ultravioletti, agli ioni, ecc, però

questi plasmidi R portano anche l’informazione genetica per la resistenza agli antibiotici, e questo

è molto importante. Poi ci sono plasmidi che codificano per fattori di virulenza e patogenicità,

codificano per esempio per la produzione di tossine, esotossine, codificano per alcuni pili e fimbrie

che servono per l’adesione del battere, e quindi sono molto importanti per la virulenza e la

patogenicità dei batteri stessi.

Possono essere trasferiti verticalmente e orizzontalmente, cioè verticalmente dalla cellula madre

alle cellule figlie, e orizzontalmente da una cellula batterica all’altra, con un processo che si chiama

coniugazione batterica. Come è possibile? Perché ci sono dei plasmidi che possiedono dei geni

“TRA” che codificano per tutto quello che serve per il passaggio da una cellula all’altra. Questi

plasmidi vengono detti “plasmidi auto-trasmissibili”. Poi ci sono anche dei plasmidi che non

possiedono questi geni, e che non si possono trasferire autonomamente da una cellula all’altra,

ma vedremo che anche questi è possibile che si trasferiscano con altri metodi.

I batteri – diffusi in tutti gli ambienti esterni e interni, adattati a vivere negli ambienti più disparati –

devono avere un meccanismo di adattamento in qualche modo. Finora abbiamo parlato di

meccanismi rigidi, di duplicazione del DNA e basta, invece il genoma batterico ha una certa

plasticità che gli conferisce delle possibilità evoluzionistiche e di adattabilità all’ambiente. Oltre

questo ci sono dei meccanismi di trasferimento orizzontale del materiale genetico che

permettono uno scambio di materiale genetico da una cellula all’altra, in alcuni casi anche una

cellula batterica di specie differente.

Questi meccanismi sono la trasformazione, la coniugazione, la trasduzione. Poi all’interno del

genoma è possibile anche uno spostamento di alcune sequenze geniche, soprattutto ad opera

delle sequenze di inserzione, i trasposomi e altri meccanismi.

Analizziamo le mutazioni del genoma che avvengono all’interno di una sola cellula nel genoma

batterico, e nella maggioranza dei casi perché ci sono degli errori nella duplicazione del DNA, e

analizziamo il trasferimento di materiale genomico da una cellula batterica all’altra.

La mutazione in genere deriva da un errore nella duplicazione del DNA, ed è un evento

totalmente casuale e raro. Le mutazioni spontanee hanno una frequenza di 10 alla 6, 10 alla 9

eventi di replicazione, cioè ogni milione/miliardo di duplicazione del DNA c’è una mutazione, che

può avvenire spontaneamente o può essere indotta per esempio da radiazioni, da certe sostanze

chimiche. La mutazione quando riguarda una sola base si chiama puntiforme, nei batteri sono

possibili anche mutazioni che riguardano più basi per inserzione o delezione di frammenti del DNA

eccetera. La mutazione puntiforme può essere missenso, nonsenso o silente.

Silente quando la mutazione di una base dà origine ad un codone che codifica per lo stesso

amminoacido. Il codice genetico è ridondante, un amminoacido può essere codificato da più

codoni, e quindi verrà sintetizzato una proteina uguale a quella selvaggia, e quindi la mutazione

non ha nessuna conseguenza.

Oppure può essere una mutazione nonsenso, e quindi quello che viene fuori è un codone di stop,

la sintesi proteica si blocca, si forma una proteina incompleta che non funziona come dovrebbe.

Lo stesso con la mutazione missenso, quando invece di un amminoacido, il codone ne codifica un

altro in seguito alla mutazione, e quindi viene sintetizzata una proteina che non funziona come

quella selvaggia. Che conseguenze ha questa mutazione? Può essere letale. La proteina è

indispensabile per la vita del battere, per cui se non funziona bene il battere muore. Oppure ci

possono essere delle mutazioni non letali che possono conferire un vantaggio al battere, cioè per

esempio possono conferirgli delle caratteristiche che gli permettono di sopravvivere in condizioni

sfavorevoli, utilizzare una determinata sostanza, essere resistente a determinati antibiotici, e così

via. Le mutazioni sono un evento molto raro, però va detto che i batteri sono aploidi, hanno un

cromosoma solo, e quindi ogni mutazione, ogni cambiamento del genoma, si riflette in un

cambiamento del fenotipo. Poi hanno una velocità di divisione molto elevata, per cui se la

mutazione porta un vantaggio in quell’ambiente, ben presto tutta la popolazione di batteri che c’è

in quell’ambiente sarà mutata. Quindi queste mutazioni rimangono nel genoma se sono favorevoli,

se il battere non muore, e quando il DNA si duplica durante la scissione del battere, anche il DNA

mutato si duplica e quindi vengono trasmesse alle cellule figlie le mutazioni. Invece in questo caso

parliamo di scambio di materiale genetico tra cellule batteriche differenti con questi tre

meccanismi, trasmissione, coniugazione e trasduzione. Nella cellula eucariotica, durante la meiosi,

avviene il cross-over, i cromosomi omologhi si appaiono e si ha lo scambio per ricombinazione.

Invece nella cellula batterica questo non è possibile perché la meiosi non avviene. L’unica

possibilità di scambio del materiale genetico è data da questi tre meccanismi.

TRASFORMAZIONE. Un processo durante il quale dei frammenti di DNA che si trovano

nell’ambiente sono assunti da altre cellule batteriche, e questi frammenti vengono incorporati nel

DNA del battere ricevente. In genere riguarda solo un piccolo frammento, e quindi sono pochi i

geni che vengono integrati nella nuova cellula. E questo DNA si può trovare nell’ambiente soltanto

quando altre cellule batteriche sono morte, sono andate incontro a lisi, e quindi hanno rilasciato il

loro materiale genetico, è stato degradato dalle dnasi e quindi si trova in piccoli frammenti

nell’ambiente.

Il primo a scoprire questo meccanismo di passaggio di materiale genetico fu Griffith, nel 1928,

con un esperimento famoso. Egli studiava lo Streptococcus Pneumoniae murino, con i topi da

esperimento. Lo Streptococcus Pneumoniae infetta i topi e li fa ammalare di polmonite. Prendendo

del materiale da questi topolini infetti e seminandolo su delle piastre di Petri, terreno solido, vide

che otteneva due tipi di colonie diverse. (*) in alto a destra. Un tipo si presentava con un aspetto

mucoso, lucido, e un tipo di colonia più piccola, non mucosa ma anzi dall’aspetto secco, opaco e

rugoso, e andò a vedere com’erano i microrganismi che facevano queste colonie. La capsula si

mette in evidenza con una colorazione che non è una colorazione, usando l’inchiostro di china,

che forma uno strato scuro, non penetra dentro la capsula, per cui si vede il corpo del battere

circondato da un alone chiaro su uno sfondo scuro dato dall’inchiostro di china. Quindi, quelli che

venivano dalle colonie mucose avevano la capsula (*) hanno una forma lanceolata, e sono a

coppie, sono diplococchi. Mentre quelli che venivano dalla colonia rugosa erano senza capsula, e

provò a infettare i topolini con questi due tipi di battere. Quelli infettati con i batteri capsulati

facevano venire la polmonite e il topo moriva, quelli infettati con i batteri senza capsula non si

ammalavano, quindi la capsula è un importante fattore di virulenza per lo Streptococcus

Pneumoniae. Quelli senza capsula non sono virulenti. Andando avanti con gli esperimenti, uccise i

batteri capsulati, poi inoculò in un topolino un miscuglio di batteri senza capsula vivi, e batteri con

la capsula morti. Vide che il topolino si ammalava e moriva, e suppose che dai batteri capsulati si

fosse liberata una qualche sostanza che fosse andata nel battere senza capsula e aveva dato la

possibilità di costruire una capsula, infatti dal topolino morto poteva isolare dei batteri capsulati.

Questa sostanza che aveva trasformato le cellule senza capsula in cellule capsulate, Griffith non

sapeva cosa fosse. Una ventina di anni dopo questa sostanza fu identificata come DNA, quindi era

l’informazione genomica per la produzione della capsula che era passata dal battere ucciso a

quello vivo.

Come avviene la trasformazione?

In varie vasi. Abbiamo detto che il DNA deve essere a duplice spirale e deve trovarsi libero nel

mezzo in cui si trovano gli altri batteri vivi. Quindi si assorbe alla cellula batterica, deve entrare al

suo interno e deve ricombinarsi.

La ricombinazione è un appaiamento in zone di omologia e uno scambio di frammenti di DNA,

quindi deve esserci una zona di omologia, e si avrà in specie identiche, per cui la trasformazione

avviene all’interno di una stessa specie. Il DNA trasformante deve essere della stessa specie del

battere accettore. Deve avere anche un peso molecolare non tanto basso, e la cellula ricevente

deve essere competente.

La competenza è uno stato fisiologico che permette di accettare il DNA. La trasformazione è

naturale in alcune specie batteriche come lo Streptococcus Pneumoniae di Griffith, oppure può

essere indotta, alcuni battere possono essere resi competenti, ad esempio l’Escherichia Coli,

trattandola con ioni bivalenti e poi raffreddandola.

Nelle colture giovani di Streptococcus Pneumoniae non ci sono tante cellule competenti. Alla fine

della fase di crescita esponenziale le cellule competenti producono delle proteine, il fattore di

competenza. Il fattore di competenza va a legarsi a dei recettori posti sulle cellule vicine, questo

legame fa sì che vengano espressi alcuni geni che codificano per delle proteine che sono coinvolte

nel processo di trasformazione, autolisine e nucleasi in particolare. Cosa fanno?

L’autolisina digerisce una parte della parete e mette a nudo i recettori per il DNA a duplice spirale.

La nucleasi digerisce una delle due spirali del DNA, il filamento residuo viene introdotto nella

cellula ricevente, e se non trova zone di omologia viene degradato dal dnasi, se trova zone di

omologia si appaia con il DNA ricevente, viene sintetizzata l’elica mancante e si ha la

ricombinazione. Il DNA ricevuto rimane stabilmente nel genoma della cellula ricevente e quindi

questo carattere che viene assunto con la trasformazione viene trasmesso verticalmente. Quindi

prima il trasferimento orizzontale di materiale genetico, e poi un trasferimento verticale, in modo

che tutta la popolazione batterica che ne deriva avrà questo nuovo carattere.

TRASDUZIONE. Trasferimento di materiale genetico da un battere ad un altro mediato da un

batteriofago. Il batteriofago è il virus dei batteri. Tutti gli esseri viventi hanno i loro virus. Ha una

morfologia costituita da una testa di forma geometrica detta “ecosaedro”, dentro la testa protetta

da un rivestimento proteico c’è il genoma, costituito da DNA a duplice catena, segue poi una coda

che termina con una piastra nella quale sono inserite delle fibre. Il batteriofago funziona

praticamente da vettore, trasporta frammenti di DNA genomico del battere da un battere a un altro.

Come fa?

Anzitutto aderiscono alla superficie del battere e c’è un riconoscimento specifico da parte delle

proteine, delle fibre della coda del battere, a dei recettori posti sulla superficie del battere stesso,

quindi è un riconoscimento specifico, ogni battere ha i suoi fagi. Una volta avvenuta l’adesione

succede che la coda si contrae e fa sì che il genoma passi all’interno del battere stesso, i recettori

possono essere numerosi alla superficie del battere, per cui può darsi che più di un fago si associ

sulla superficie del battere e iniettino dentro il battere il loro DNA. Una volta che il DNA è entrato si

possono avere cicli diversi a seconda del fago. Se il fago è virulento abbiamo un ciclo litico,

produttivo perché porta alla formazione di virioni figli, di virus figli, e litico perché causa la lisi della

cellula. E’ entrato il DNA e inizia la replicazione del batteriofago, e segue tappe ben precise, che

corrispondono alla trascrizione e poi traduzione di geni ben precisi nel genoma del batteriofago. I

primi sono i messaggeri precoci immediati, che codificano per una nucleasi, una dnasi, che cosa

fa? Attacca il DNA del battere, che viene frantumato e si formano piccoli pezzetti, perché la cellula

non deve svolgere le proprie funzioni, ma solo quelle codificate dal genoma del fago stesso,

perché il fago ha bisogno di tutte le vie sintetiche della cellula per produrre le proprie componenti e

riprodursi, quindi nucleasi che degrada il DNA del battere. Seguono poi i messaggeri precoci

ritardati, che codificano per una nuova base azotata, la 5-idrossimetilcitosina. Ha un significato

molto importante perché questa nuova base azotata va a sostituirsi alla citosina, e quindi rende il

nuovo DNA che si sintetizzerà inattaccabile dalle nucleasi. Il dna genomico del fago non viene

degradato dalle nucleasi per la presenza di questa nuova base azotata, che si sostituisce alla

citosina. Segue poi la trascrizione dei geni ritardati, e la traduzione dei messaggeri ritardati delle

proteine, proteine strutturali che sono quelle che andranno a sostituire la testa, la coda, le fibre

ecc. Quando tutto questo materiale si è accumulato all’interno della cellula si auto-monta, prima la

testa, seguendo delle regole della cristallizzazione (anche le proteine sono capaci di cristallizzare,

come i sali), quindi si auto-monta la testa, si inserisce il DNA del fago nella testa, e poi le altre

strutture. Quando si sono accumulati tanti batteriofagi all’interno della cellula, inizia la lisi della

cellula, la parete e la membrana si disgregano, e fanno uscire tutti i batteriofagi. Questo è il ciclo

litico, produttivo, tipico dei fagi virulenti.

Come fanno a trasportare il materiale genomico batterico da un battere ad un altro?

Due tipi di trasduzione.

Trasduzione generalizzata, opera dei fagi virulenti, quando abbiamo il ciclo litico. Il trasporto di

materiale genomico da un battere infettato dal fago ad un altro è dovuto al fatto che all’interno

della testa del fago può inserirsi non solo il DNA fagico, ma anche quei frammenti che si formano

ad opera delle nucleasi fagiche, che degradano tutto il DNA della cellula batterica. Quindi

consegue a degli errori di montaggio del batteriofago stesso. Avremo quindi fagi normali e fagi che

nella loro testa non hanno DNA del fago, ma frammenti del DNA del battere, però questi una volta

liberati nell’ambiente esterno sono capaci di adsorbirsi ad un altro battere e trasferire materiale

genomico all’interno del battere. Questo materiale genomico proviene dal primo battere infettato, e

se trova zone di omologia può esserci, anche in questo caso, una ricombinazione che può dare

nuovi caratteri al battere stesso, che possono trasmettersi alle cellue figlie. Questa è la

trasduzione generalizzata, perché all’interno della testa del fago ci sarà un frammento qualsiasi di

DNA del battere, può esserci un frammento a caso, non necessariamente preciso che si inserisce

nella testa del fago. Però alcuni fagi non fanno il ciclo litico, o per lo meno non subito, ma vanno

incontro al ciclo lisogeno, e sono i cosiddetti fagi temperati. (*) in alto. Succede che il DNA del fago

non viene tradotto subito, ma si trasforma in profago e si inserisce nel genoma del battere, non si

sostituisce, si inserisce. Quando la cellula batterica si replica, si replica anche il profago, per cui

questo viene trasmesso alle cellule figlie, si crea una popolazione di cellule che portano il DNA del

fago, quindi una moltiplicazione del genoma fagico senza che si abbia lisi della cellula. In questo

caso i geni che servono per la replicazione del fago sono completamente repressi e si parla di

lisogenia. Però come si è visto (*) in basso, il profago si integra ma si può anche escindere dal

DNA del cromosoma batterico, per vari motivi può uscire dal DNA del cromosoma batterico e dar

luogo di nuovo al ciclo litico.

In questo caso avremo una trasduzione specializzata, perché in questo caso il trasferimento dei

geni avviene per degli errori di taglio, durante l’escissione del genoma fagico. Se non viene

effettuato dalle nucleasi un taglio preciso nel punto di inserimento del DNA del fago, all’interno

della testa dei fagi figli ci saranno anche dei geni di provenienza batterica. Non è generalizzata ma

specializzata perché la possibilità che all’interno della testa dei fagi figli ci siano geni batterici

dipende dal punto in cui sono situati. Più sono vicini al punto di inserimento del fago che è sempre

lo stesso e più probabilità avremo che possano essere trasferiti con questo meccanismo di

trasduzione specializzata. Quindi non sono geni a caso, ma quelli vicini al punto di trasferimento

del profago.

Tornando indietro, durante il ciclo lisogeno i geni che servono per la replicazione del fago sono

totalmente inespressi, però alcuni geni possono essere espressi e possono dare delle

caratteristiche alla cellula batterica molto importanti, ad esempio la produzione di tossine. La

tossina della difterite viene codificata da un profago inserito nel cromosoma del Corynebacterium

Diphtheriae. Lo stesso la tossina eritrogenica dello Streptococcus pyogenes, quello responsabile

della scarlattina, e anche altri caratteri.

CONIUGAZIONE. (*) Trasferimento di materiale genetico da un battere donatore a un ricevente

tramite un contatto tra le due cellule mediante il pilo sessuale, o coniugativo. Coniugazione

perché? Ci deve essere un contatto tra cellula donatrice e ricevente, e questo contatto avviene

tramite un pilo sessuale. E’ un fenomeno che è stato studiato soprattutto per l’Escherichia Coli,

però diversi batteri Gram- sono capaci di trasferire materiale genomico attraverso la coniugazione.

Questo processo di trasferimento è mediato dai plasmidi coniugativi. Le cellule di E. Coli che

portano i plasmidi coniugativi sono dette cellule F+. F da fertilità. Il plasmide F della fertilità

contiene i geni TRA, che servono per il trasferimento, e codificano anche per il pilo sessuale, non

solo, anche per tutte quelle proteine enzimatiche necessarie per il trasferimento del materiale

genomico dalla cellula F+ a quella F-. Se si mettono insieme nella stessa provetta delle cellule F+,

dopo poco tempo si vede che la F+ prende rapporto con la cellula F- e terminato questo processo,

anche la cellula F- è diventata F+. Come avviene questo processo? Il pilo aderisce ad un recettore

ben preciso sulla cellula F- e comincia a ritrarsi in modo da mettere in contatto le due cellule. A

questo punto cosa succede? Il plasmide è costituito da DNA circolare bi-catenario, una delle due

catene viene tagliata da una nucleasi, e attraverso dei pori (*) costituiti da proteine codificate dal

plasmide stesso, cominciano ad entrare uno dei due filamenti nella cellula ricevente. Nel frattempo

che uno dei due filamenti si sposta verso la cellula ricevente, viene sintetizzato l’altro filamento, sia

nella cellula donatrice che in quella ricevente. Quindi alla fine del processo avremo che nella

donatrice è presente il plasmide F, nella ricevente c’è anche il plasmide F, perché è stata trasferita

un’elica, e l’altra, la mancante è stata sintetizzata di nuovo, e quindi anche la cellula F- è diventata

F+. Questo processo è importante perché i plasmidi possono conferire delle caratteristiche molto

importanti alla cellula ricevente, la resistenza, la capacità di produrre tossine, ecc.

Un genetista italiano scoprì che il plasmide F può anche funzionare da episoma, si può integrare

nel cromosoma della cellula ricevente, che prende il nome di HFR, alta frequenza di

ricombinazione. Questi plasmidi che possono trasformarsi in episomi e integrarsi nella cellula

ricevente, sono coniugativi, e oltre al gene TRA, per la trasmissione, contengono delle sequenze di

inserzione, che fanno sì che il plasmide si possa integrare nel cromosoma batterico in

corrispondenza delle sequenze di inserzione presenti nel cromosoma batterico. Quando la cellula

HFR entra in contatto con una cellula F- si ha il trasferimento del DNA del plasmide che inizia dal

punto in cui si è inserito nel cromosoma batterico, e procede fino a che non si è trasferito tutto il

plasmide dalla cellula donatrice alla ricevente. Nel caso delle cellule HFR non succede mai che si

trasferisca tutto quanto il plasmide dalla donatrice alla ricevente, anzi spesso il taglio non è

precisamente in corrispondenza dell’inserimento del plasmide nel cromosoma batterico, per cui

possono essere trasferiti anche dei geni del DNA batterico. Quindi la cellula HFR dona una parte

del plasmide alla ricevente e spesso anche dei geni situati vicino al punto di inserzione del

plasmide, ma la cellula ricevente non diventa mai F+, perché non riceve tutto il plasmide intero.

Questi geni che vengono trasferiti con questo metodo, possono a loro volta integrarsi nel

cromosoma della cellula ricevente, possono anche essere degradate da delle nucleasi presenti nel

citoplasma della cellula ricevente, oppure se trovano delle zone di omologia possono ricombinarsi,

e possono conferire nuove caratteristiche che vengono poi trasferite alle cellule figlie.

Come all’interno del genoma batterico si possono avere degli spostamenti del materiale genomico,

delle inserzioni e delezioni? E’ possibile per la presenza di elementi genetici mobili, chiamati

elementi trasponibili. Sono frammenti di DNA che si possono trasferire autonomamente da una

parte all’altra del genoma, ma anche dal genoma a un plasmide o viceversa, e codificano per tutti

gli elementi necessari a questa operazione di trasposizione, codificano in particolare per degli

enzimi che si chiamano trasposasi, che servono per questa operazione di trasferimento da un sito

ad un altro del cromosoma batterico. Cosa sono le sequenze di inserzione? Sono delle corte

sequenze di DNA (fino a 1500 paia di basi) che sono caratterizzate da sequenze ripetute e

invertite all’inizio e alla fine, e codificano per una trasposasi, cioè un enzima che serve per il

trasferimento di queste sequenze da una zona all’altra del genoma del cromosoma batterico.

Anche sul plasmide F sono state identificate queste sequenze di inserzione, e per questo può

verificarsi la ricombinazione omologa, non la trasposizione in questo caso, con le sequenze

identiche presenti sul cromosoma del battere. Queste sequenze di inserzione, per mezzo della

trasposasi, possono escindersi dal sito del cromosoma dove si trovano ed inserirsi in un’altra zona

del cromosoma. I trasposoni invece sono più lunghi e complicati, hanno delle sequenze di

inserzione all’inizio e alla fine, codificano per una trasposasi sicuramente, e codificano anche per

dei caratteri che possono avere dei riflessi sulla patologia umana, perché possono codificare per

fattori di resistenza agli antibiotici, capacità di sintetizzare delle tossine, ed altri fattori di virulenza.

Sono elementi trasponibili più complessi che si possono trasferire da una zona all’altra del

cromosoma batterico, o dal cromosoma batterico ad un plasmide, e poi ci sono anche dei

trasposoni auto-trasmissibili, che si possono trasferire ad un’altra cellula batterica. La

trasposizione può essere di tipo conservativo o replicativo. Conservativo = del tipo taglia e

incolla. Replicativo del tipo copia e incolla.

Conservativo. Taglia e incolla = la trasposasi escinde il trasposone dalla posizione in cui si trova

nel cromosoma e lo fa inserire in un’altra zona. Questo può comportare che se il trasposone si

inserisce in un operone che codifica per una funzione importante per il battere, questo può

causare un danno e quindi anche la morte, però possono causare delle mutazioni anche favorevoli

per il battere. Lo stesso per la trasposizione replicativa, dove si forma una nuova copia (*), si

avvicina il sito nel quale andrà ad inserirsi il nuovo trasposone, si forma una copia del nuovo

trasposone, in modo che lo stesso trasposone si trova in due punti distinti del cromosoma

batterico. Anche in questo caso si può inserire un operone, può causare varie mutazioni, tutta una

serie di trasformazioni che rendono più plastico il genoma del battere e possono determinare un

adattamento all’ambiente. La trasposizione avviene di solito all’interno della stessa cellula, quindi

in siti diversi del cromosoma batterico, però ci sono i trasposoni coniugativi che invece si possono

trasmettere da una cellula all’altra con un processo simile a quello dei plasmidi. Ci sono anche

trasposoni non coniugativi che però si possono trasferire da una cellula all’altra con l’intervento dei

plasmidi coniugativi. Tutte queste cose ci interessano perché possono contribuire a diffondere la

resistenza agli antibiotici.

VIRULENZA E PATOGENICITA’

Batteri patogeni = in grado di instaurare un’infezione e provocare un danno nell’ospite. La

differenza tra patogeni e non patogeni non è netta, perché ci sono dei batteri assolutamente

patogeni che possono non dare malattia, mentre ci sono dei batteri saprofiti che invece possono

dare malattia. E’ sempre relativo al rapporto con un determinato ospite.

Bilancia della patogenicità = l’evolversi verso la malattia è determinato da fattori legato a

quell’organismo e fattori legati all’ospite. Infatti ci sono altri batteri che vengono detti “patogeni

opportunisti” che sono capaci di causare malattia solo negli individui che non hanno un corredo di

difese perfettamente funzionante, e vengono detti anche patogeni occasionali o a patogenicità

condizionata (condizionata dallo stato di difese dell’ospite). Mentre i patogeni primari sono quelli

che sono in grado di dare malattia in un individuo che ha un corredo di difese perfettamente

funzionante.

I batteri all’interno dell’ospite possono ritrovarsi negli spazi intercellulari o all’interno delle cellule.

L’interno delle cellule offre un certo vantaggio ai batteri se questi riescono a sopravvivere al loro

interno, perché sono protetti dalle difese dell’organismo, dagli anticorpi, dal complemento, ecc.

Per alcuni batteri questa fase è transitoria, ad esempio le Shigelle (enterobatteriacee, Gram-), la

Salmonella (Gram- , asporigeno, anaerobio facoltativo) ecc, utilizzano questa fase di passaggio

intracellulare per spostarsi dalla superficie della mucosa intestinale ai tessuti più profondi. Mentre

ci sono altri microrganismi che non hanno la via sintetica dell’ATP (Chlamydie, ecc.) per cui

devono utilizzare quelle della cellula, e quindi sono dei parassiti endocellulari obbligati, che per

moltiplicarsi utilizzano l’ATP prodotto dalla cellula nella quale si trovano, e quindi hanno una vita

intracellulare per tutto il periodo in cui si instaura l’infezione e poi la malattia nell’ospite. La maggior

parte degli altri batteri si moltiplica nello spazio intercellulare, e questi possono essere coltivati su

normali terreni di coltura in laboratorio, perché non hanno bisogno di cellule ma soltanto di

sostanze nutrienti. I terreni di coltura vengono chiamati “abiotici” = privi di vita, senza organismi

viventi. Gli altri organismi Chlamydie e Rickettsie hanno bisogno, per essere coltivati in vitro, di un

terreno che contenga anche cellule, perché altrimenti non si riproducono. Il potere patogeno di un

battere è dato dalla virulenza e dalla patogenicità.

Virulenza = capacità di instaurare un’infezione e di cambiarla, di moltiplicarsi in vivo.

Patogenicità = capacità di causare un danno e quindi la malattia che ne deriva.

La virulenza è dovuta ad un insieme di meccanismi e fattori diversi che sono tutto quell’insieme di

meccanismi che consentono al battere di causare un’infezione e di estenderla. Invece i fattori di

patogenicità sono tutti quei meccanismi che causano un danno alle difese dell’ospite. (*)

diagramma di flusso dell’infezione verso la malattia.

Primo step: adesione, incontro causale del microrganismo con l’ospite. Oltre a questo bisogna che

il microrganismo sia capace di rimanere dove si è adeso, deve avere meccanismi che gli

permettano di non farsi portar via dai flussi (urina, muco vie respiratorie, peristalsi intestinale),

deve aderire bene alle mucose. Poi deve avere la capacità di superare le difese dell’ospite. Dopo

che si è instaurata l’infezione e il battere comincia a moltiplicarsi, produce delle sostanze,

soprattutto enzimi extracellulari che si concentrano in un punto e gli permettono poi di degradare la

sostanza intracellulare e danneggiare le cellule, in modo che possa invadere il tessuto, e questo

sono le sostanze invasive.

ADESIONE. Deve avvenire tra strutture che si trovano sulla superficie del battere, e altre che si

trovano sulla superficie delle cellule dell’ospite, principalmente delle mucose, perché una delle vie

di ingresso più frequenti è rappresentata dalle cavità che si aprono verso l’esterno, tutte rivestite

da mucose. Queste strutture di superficie del battere in genere sono strutture proteiche, e non

hanno un’adesione casuale, ma riescono ad aderire e riconoscere specificamente delle molecole

presenti sulle cellule della mucosa, in genere glicoproteine o glicolipidi. Per i Gram- ci sono

strutture proteiche vere e proprie che servono per l’adesione, e quindi si identificano con le

adesine (pili e fimbrie). Nei Gram+ sono le stesse proteine della parete (non c’è membrana

parietale esterna!!) che svolgono questa funzione di adesine, per esempio nello Streptococcus

Pyogenes c’è una proteina, la M, che complessa con gli acidi teicoici e serve per l’adesione alla

mucosa della faringe, quindi non ci sono strutture vere e proprie. Le adesine determinano anche la

sede iniziale della colonizzazione da parte del battere, perché riconoscono specificamente delle

molecole che si trovano alla superficie delle cellule delle mucose, e quindi non tutte sono uguali.

(*) esempi = ceppi produttori di enterotossina di E.Coli possiedono un pilo specifico che permette

di aderire alla mucosa dell’intestino tenue e quindi di dare la forma patogena = diarrea. Lo

S.Pyogenes ha la proteina M complessata con gli acidi teicoici per l’adesione, e oltre a quello ha la

proteina F che si lega specificamente alla fibronectina della mucosa della faringe, ed è infatti uno

dei principali responsabili delle faringiti. Altre strutture di adesione sono la capsula e il glicocalice,

o strato mucoso che dir si voglia. La capsula è una sostanza amorfa che circonda il battere ed è

costituita da polimeri polisaccaridici. Per lo Streptococcus Mutans (Gram+, anaerobio facoltativo) è

un importante fattore di virulenza perché gli permette di attaccarsi ai denti. Ci sono anche altri

batteri che utilizzano la capsula per aderire soprattutto alle mucose, per esempio il Bacteroides

fragilis (anaerobio, Gram-, asporigeno) è circondato da una capsula che gli permette di aderire alla

mucosa intestinale. Fa parte del microbiota intestinale ma in alcuni casi può dare anche della

patologia.

Il glicocalice o strato mucoso è importante perché è alla base della formazione dei biofilm, che si

è scoperto essere molto importanti, in quanto offrono ai microrganismi una protezione nei confronti

di diversi fattori di difesa sia dell’organismo, sia per quanto riguarda l’attività degli antibiotici. I

biofilm si possono formare sia su tessuti vivi che su superfici inerti. I tessuti vivi in genere sono le

mucose, mentre le superfici inerti sono rappresentate da dispositivi medici impiantabili, che

vengono utilizzati sempre di più in medicina, per esempio le protesi dentarie, le valvole cardiache, i

cateteri vascolari, le protesi ortopediche, ma anche cose più semplici come fili di sutura. Su tutte

queste superfici inerti si possono formare dei biofilm all’interno dell’organismo, che possono

essere formati da una sola specie batterica, o più frequentemente da più specie.

Dal punto di vista medico sono più importanti quelli formati da una sola specie batterica, perché

sono responsabili di infezioni difficilissime da curare, ad esempio tra i Gram- lo Pseudomonas

Aeruginosa e l’Escherichia Coli che possono formare dei biofilm costituiti da una sola specie.

Mentre tra i Gram+ lo Staphylococcus Epidermidis e lo Staphylococcus Aureus possono formare

biofilm. I batteri di solito hanno una vita libera, viene detta planctonica quindi sono liberi nello

spazio intercellulare o nei fluidi corporei, possono però aderire a delle superfici biologiche o inerti.

All’inizio ci sarà un legame debole, formato solamente dalle forze di van der Waals. Se i sistemi di

difesa dell’organismo non sono capaci di allontanare subito questo battere dalla superficie inerte,

si possono stabilire dei legami più stabili, dopodiché il battere comincia a produrre questa matrice

polisaccaridica polimerica e comincia a riprodursi, e così si ha l’inizio della formazione del biofilm.

A questo punto anche batteri che non sono capaci di aderire autonomamente alla superficie inerte

possono essere inseriti nel biofilm, perché si possono attaccare o alla matrice polimerica

polisaccaridica, o al battere stesso, così che il biofilm comincia a crescere sia per la

moltiplicazione dei primi colonizzatori, sia perché si aggiungono altri batteri dall’esterno. Poi

raggiungono un equilibrio in cui alcune cellule muoiono, e altre si riproducono. I batteri all’interno

del biofilm hanno delle proprietà diverse rispetto ai batteri con vita libera, hanno un metabolismo

molto molto ridotto, si trovano in questo gel denso e si riproducono molto lentamente, e poi sembra

che comunichino tra di loro. Possono comunicare tra loro in modo da mettere in atto una risposta

biologica a degli stimoli ambientali, ad esempio si è scoperto che possono comunicare tra loro con

il sistema del Quorum Sensing, cioè “valore soglia”, e questo metodo si attua mediante delle

molecole segnale, che sono prodotte dal battere stesso, che ha anche sulla superficie della

membrana dei recettori per queste molecole segnale. Quando queste si accumulano

nell’ambiente, nel biofilm, si legano ai recettori, e questo legame fa partire un segnale che provoca

la trascrizione e poi traduzione di geni particolari che determinano una risposta, ma questo

succede in tutti i batteri che fanno parte del biofilm. Per questo, in questo modo, i batteri del biofilm

rispondono tutti insieme alle condizioni ambientali con questo sistema. Importanza del biofilm per

la resistenza agli anticorpi, in quanto i batteri sono protetti da questa matrice, e quindi gli antigeni

di superficie sono inaccessibili agli anticorpi. Resistenza alla fagocitosi e al complemento che non

si può attivare, proprio perché i batteri sono tutti ricoperti da questo biofilm. L’altra resistenza è

ovviamente quella agli antibiotici, con due meccanismi: uno è l’adsorbimento aspecifico ai polimeri

polisaccaridici della matrice, e l’altro è dovuto al fatto che la maggior parte degli antibiotici e

antibatterici, sono attivi su batteri che sono attivamente metabolizzanti, cioè che crescono e si

riproducono ecc, però nel biofilm i batteri sono quasi inerti, hanno un metabolismo ridotto, per cui

l’antibiotico da una parte arriva all’interno della cellula batterica in concentrazione più bassa, e poi

essendo le cellule batteriche quasi quiescenti, non ha attività. E da qui il problema delle infezioni

sostenute dal biofilm.

Tornando all’adesione: quando il battere si è ben ancorato alla parete, trova le condizioni

ambientali favorevoli e comincia a moltiplicarsi e a colonizzare il tessuto. Durante la moltiplicazione

produce diversi metaboliti, alcuni di questi sono degli esoenzimi o vere e proprie tossine, che

vanno a danneggiare il tessuto, essendo tutti concentrati in un punto della colonia. Questo

danneggia la mucosa e favorisce l’invasione del battere verso i tessuti più profondi. L’invasione è

mediata da queste molecole dette invasine, che sono esoenzimi che vanno ad attaccare la

sostanza intercellulare soprattutto, disgregano il tessuto digerendo la sostanza intercellulare, e per

questo favoriscono la diffusione del battere. (*) Esempi = ci sono dei batteri che producono

ialuronidasi, collagenasi, e quindi disgregano l’acido ialuronico del tessuto connettivo, il collagene,

e permettono la diffusione del battere. Le invasine sono un’infinità di sostanze prodotte dai batteri,

ci sono la streptochinasi che provoca la lisi della fibrina, poi la pneumolisina che viene prodotta

dallo Streptococcus Pneumoniae, che distrugge l’epitelio ciliato delle vie respiratorie. La dnasi che

sembra renda più fluido il pus, permettendo un’invasione da parte dei batteri. Il battere può

rimanere localizzato nel punto della prima infezione e diffondere soltanto nei tessuti vicini, e quindi

dare un’infezione localizzata, oppure può essere drenato a livello dei linfonodi vicini, e da qui

passare al sangue, e dare batteriemia = presenza del battere nel sangue, che si mette in evidenza

con le emocolture, oppure con lo striscio di sangue, in cui si vedono i globuli rossi e le catenelle di

streptococchi (*). La presenza del battere nel sangue può essere anche solo transitoria, ad

esempio in alcune malattie da una localizzazione primaria, in cui si ha il sito dell’infezione, e poi

l’iniziale moltiplicazione e colonizzazione del battere, attraverso il sangue il battere si porta a quegli

organi nei quali si moltiplica più attivamente e dà veramente il processo morboso, la malattia. Nel

caso di batteriemia il battere non svolge la sua azione patogena quando è presente nel sangue, si

può avere, in caso di batteriemia, un rialzo della febbre per esempio, è caratteristico della fase

batteriemica. Invece nel caso della setticemia, la presenza del battere nel sangue è costante, si

può anche moltiplicare qui, e svolgere la sua azione patogena. Non è detto che vada a localizzarsi

in un organo secondario. La setticemia può evolversi in sepsi. Quando abbiamo una anomala

risposta infiammatoria accompagnata da una produzione notevole di citochine che determinano

una reazione dell’organismo fino allo shock settico e poi la morte. La moltiplicazione in vivo dei

batteri è influenzata da vari fattori, tra i quali la disponibilità di ferro, senza il quale non si

moltiplicano. Nell’ospite il ferro libero è quasi assente, ma è legato a vari tipi di molecole, per

esempio fa parte dell’eme dell’emoglobina, oppure legato a delle proteine che si trovano nel

sangue, la lattoferrina, la transferrina, la ferritina, che servono a trasportare il ferro, per cui è poco

disponibile per i batteri. Però i batteri hanno sviluppato tutta una serie di strategie per utilizzare

anche questo ferro che non sarebbe normalmente disponibile, cioè possono produrre siderofori =

molecole capaci di veicolare il ferro direttamente all’interno del battere, oppure possono utilizzare

direttamente la ferritina, che si lega alla superficie del battere cui è attaccato il ferro, e viene

portata all’interno della superficie del battere. Oppure possono produrre delle sostanze che

provocano la lisi dei globuli rossi, e quindi sono chiamate emolisine, e utilizzare direttamente il

ferro contenuto nell’eme. Sono tante strategie per utilizzare il ferro anche se legato a queste

proteine. Poi devono superare le difese dell’ospite, che saranno difese dell’immunità innata e

acquisita.

Difese dell’immunità innata: la prima difesa, a parte barriere e flussi, quando il battere è già

entrato nei tessuti, è la fagocitosi, quindi i batteri hanno sviluppato strategie per difendersi. Una di

queste è la capsula. Ma anche la stessa proteina M protegge dalla fagocitosi. Quando invece

alcuni batteri sono fagocitati hanno sviluppato altre strategie, ad esempio, possono sopravvivere

all’interno della cellula perché impediscono il trasporto delle vescicole dei lisosomi verso il

fagosoma, per cui non si ha mai la fusione del fagosoma con il lisosoma, e quindi non si ha la

distruzione del battere nella cellula. Oppure escono dal fagosoma prima che si abbia la fusione

con il lisosoma, oppure producono delle sostanze che fanno si che non possa avvenire il killing

ossidativo ad opera degli enzimi contenuti all’interno del lisosoma. Ad esempio tutti gli stafilococchi

producono un enzima che si chiama catalasi che scinde il perossido di idrogeno tossica per il

battere in acqua e ossigeno che non sono tossici. Altre strategie antifagocitarie = inibizione della

fusione dei fagociti. I batteri producono delle sostanze con azione nei confronti dei fattori chemio

tattici, cioè di quei fattori come le citochine, che determinano il richiamo dei fagociti nel punto in cui

c’è l’infezione, producono questi enzimi che degradano le citochine, oppure possono produrre altre

sostanze. Lo Staphylococcus Aureus può produrre la coagulasi, enzima che determina la

coagulazione del plasma, si forma un coagulo (*) intorno ai batteri, e quindi questo fa da

protezione. Poi viene prodotto un altro enzima, una chinasi, che scinde questo coagulo e libera i

batteri. Possono produrre anche delle vere e proprie tossine che vanno ad uccidere le cellule

fagocitarie. Invece contro i meccanismi dell’immunità acquisita sono state sviluppate altre

strategie: ad esempio l’Haemophilus influenzae produce degli enzimi proteasi che vanno ad

attaccare le immunoglobuline, oppure possono avere mimetismo antigenico, cioè sulla superficie

del battere ci sono molecole o sostanze che non sono riconosciute come estranee, e quindi verso

queste molecole non ci sarà una risposta immunitaria. Esempio: la capsula di acido ialuronico

dello Streptococcus pyogenes: l’acido ialuronico è anche nell’organismo ospite, per cui non viene

riconosciuto come estraneo e non c’è una risposta immunitaria verso questa componente. Oppure

l’esistenza di un elevato numero di tipi antigenici. Il lipopolisaccaride dei Gram- ha una parte

lipidica e una parte saccaridica che sporge all’esterno della cellula, una lunga catena

polisaccaridica chiamata antigene O che è diversa anche all’interno della stessa specie. Questo

determina vari tipi antigenici all’interno della stessa specie. Anche lo Streptococcus pneumoniae

ha vari tipi antigenici, dovuti alle differenze antigeniche del polisaccaride che costituisce la capsula

vantaggio dato dal fatto che se un organismo incontra uno di questi microrganismi di un certo

tipo antigenico, mette in atto una risposta immunitaria che sarà primaria se siamo al primo

incontro, nei confronti di quel determinato tipo antigenico. Se dopo un certo periodo di tempo

incontra un microrganismo della stessa specie ma di un altro tipo antigenico, la risposta sarà

sempre primaria. La risposta primaria è meno efficiente rispetto alla secondaria per eliminare il

microrganismo. Quindi l’organismo ha sviluppato una resistenza per un determinato tipo

antigenico, ma se incontra un microrganismo della stessa specie ma di un tipo antigenico diverso

non ha più questa resistenza, da qui un vantaggio per il microrganismo.

Poi altri meccanismi di difesa contro gli anticorpi = alcuni microrganismi legano gli anticorpi dalla

parte sbagliata. Di solito l’anticorpo si lega tramite le due estremità dove è situata la zona

intervariabile della proteina che riconosce specificamente l’antigene e si lega specificamente

all’antigene. Invece, alcune proteine come la proteina A dello Staphylococcus Aureus, e la

proteina M del Pyogenes, legano l’anticorpo non dalla parte del frammento AB, ma dalla parte del

frammento FC, e questo comporta per esempio che non si può avere opsonizzazione (determinata

dal frammento FC non disponibile perché legato al battere), o non si attiva il complemento per la

via classica, anche questa determinata dall’FC non disponibile.

Fattori di patogenicità. Essenzialmente le tossine batteriche, che causano un danno ai tessuti

dell’ospite. Possono essere secrete dal battere, o fare parte del corpo del battere. Danneggiano i

tessuti dell’ospite o alterano le funzioni biologiche delle cellule dell’ospite. Da un punto di vista

della funzionalità e della composizione chimica si distinguono le esotossine e le endotossine, dove

ESO = secreto all’esterno dal battere. ENDO = non sta dentro il battere, ma FA PARTE del corpo

della cellula batterica, e passa nell’ambiente dopo che il battere è morto ed è stato disgregato. Le

ESO sono tutte proteine, prodotte dai Gram + e -. L’ENDO si identifica con il lipopolisaccaride che

si trova solo nella membrana parietale esterna dei Gram- , e viene liberato nell’ambiente esterno,

cioè nelle sostanze intercellulari o nei fluidi dell’ospite, dopo che il battere si è disgregato. Finché

fa parte della parete del battere non ha nessuna funzione, non funziona da endotossina, funziona

solo quando il battere è stato disgregato, e quindi l’endotossina è libera nei fluidi corporei

dell’ospite o negli spazi intercellulari. Le esotossine sono termolabili, inattivate dal calore, e le

endotossine no. Le eso provocano una forte reazione immunitarie, e gli anticorpi contro le

esotossine in genere sono protettivi, riescono a neutralizzare l’azione delle esotossine. Invece le

endotossine sono immunogene, cioè determinano una produzione di anticorpi nell’ospite, ma

questi non riescono a neutralizzare la tossicità delle endotossine. Le esotossine possono essere

trasformate, gli si può togliere la parte tossica, trasformandole nelle anatossine, per esempio

trattandole con formaldeide, mentre le endotossine non possono trasformarsi. Le esotossine sono

specifiche per i singoli batteri che le producono, nel senso che un battere produce una determinata

esotossina che ha una determinata azione biologica sulle cellule dell’ospite. Mentre le endotossine

hanno un’azione generale, uguale per tutti i batteri Gram- .

Sono tante le esotossine, e possono essere classificate in vari modi, ad esempio secondo l’organo

bersaglio principale. Se l’organo/sistema è il sistema nervoso si parla di neurotossine, se è

l’intestino di enterotossine. Ci sono anche tossine che agiscono su numerosi tipi di cellule e allora

vengono dette tossine pantrope o possono essere classificate secondo la specie che le produce e

la malattia che causano. Avremo la tossina colerica prodotta dal vibrione colerico che provoca il

colera. O la tossina difterica, prodotta da Batterium Difteriae che provoca la difterite. La tossina

tetanica, prodotta dal Clostridium Tetani che provoca il tetano. Si possono classificare secondo

struttura ed attività, quindi avremo delle tossine binarie dette tossine AB, in cui possiamo

distinguere una o più subunità B, da binding, cioè legame, infatti questa subunità ha la funzione di

legarsi ad un recettore specifico di una cellula bersaglio. E un’altra porzione, la A, che svolge

l’attività biologica, una determinata attività enzimatica, ed è responsabile della tossicità. Poi ci sono

tossine citolitiche che hanno una meno netta divisione tra queste due subunità A e B, e vanno a

distruggere le cellule in particolare agiscono sulle membrane cellulari dell’ospite. Poi ci sono i

superantigeni che invece provocano la stimolazione politonale dei linfociti T Helper in assenza di

un riconoscimento specifico dell’antigene portato dall’APC nel complesso maggiore di

istocompatibilità di classe 2. Quindi senza riconoscimento specifico. Abbiamo parlato di

un’attivazione di linfociti T quando il T riconosce specificamente l’antigene portato nel complesso

maggiore. In questo caso si tratta di stimolazione - attivazione dei T Helper indipendentemente dal

fatto che l’antigene sia specifico.

ESOTOSSINE AB: (*) esempio in cui si vedono più subunità B, che hanno la funzione di legarsi a

particolari recettori presenti sulle cellule delle mucose. La A invece ha la funzione tossica, che

viene svolta solo quando la subunità A è all’interno della cellula. Dopo che è avvenuto il legame tra

la subunità B e il recettore, la subunità può entrare all’interno della cellula bersaglio con due

meccanismi, traslocazione attraverso la membrana citoplasmatica della cellula bersaglio, oppure

endocitosi seguita da traslocazione attraverso la membrana dell’endosoma. Una volta che è libera

nel citoplasma, la subunità A svolge la sua azione enzimatica tossica. Esempio di tossina AB.

Tossine AB ADP ribosilanti. In questo caso la subunità A ha un’attività ADP ribosilante. Cosa fa?

Stacca la nicotinammide in alto (*) e la parte che rimane, quindi l’ADP più due ribosi fosfato, viene

trasferita, inserita, in una proteina bersaglio, da cui il nome ADP ribosilante. Provoca il

trasferimento dell’ADP ribosio in una proteina bersaglio. La proteina bersaglio quando vi viene

trasferito l’ADP ribosio verrà inattivata, per cui l’attività di questa tossina AB dipenderà dalla natura

di questa proteina bersaglio. Un esempio è la tossina difterica. E’ prodotta dal Batterium Diphteriae

che è un bacillo Gram+ non invasivo. Il battere viene acquisito per via aerea, e ha una prima

localizzazione in genere nell’orofaringe, qui provoca infiammazione che a volte è accompagnata

da produzione di membrane fibrinose. Se colonizza anche la laringe, queste membrane fibrinose

possono rendere difficile la respirazione. Però la pericolosità della malattia è data dalla tossina,

che viene prodotta per conversione lisogena ad opera di un fago beta, e viene prodotta a livello

della localizzazione del battere, però diffonde su tutto l’organismo, e ha come bersaglio vari tipi di

cellule. E’ una tossina pantropa, che agisce su tanti tipi di cellule, ma i suoi effetti si sentono

principalmente su alcuni organi, come il cuore, fegato, reni, ecc.

E’ formata da una subunità A e una subunità B, uniti insieme da ponti di solfuro. La subunità B si

lega al recettore per la tossina alla superficie di numerosi tipi di cellule. Una volta avvenuto il

legame si ha l’endocitosi di questo complesso con la formazione di un endosoma. A questo punto

avviene l’acidificazione dell’endosoma, anche ad opera della rottura dei ponti di solfuro che

indebolisce la membrana e l’endosoma stesso, e permette la traslocazione della frazione A della

tossina. La frazione A è ADP ribosilante, quindi provoca il trasferimento dell’ADP ribosio sul fattore

di allungamento EF2, per la sintesi delle proteine, e quindi blocca la sintesi proteica all’interno

della cellula, fino a che questo blocco non porta a morte la cellula stessa.

Altro esempio è la tossina colerica, enterotossina, agisce a livello intestinale. Il colera è una

malattia che si acquisisce per via feco-orale. I vibrioni del colera si moltiplicano nell’intestino e

vengono emesse con le feci, da qui possono contaminare le acque e possono contaminare vari tipi

di alimenti, vegetali, frutti di mare ecc, e si acquisisce la malattia per via alimentare. Il battere si

moltiplica sulla superficie della mucosa intestinale, non è invasivo, ma produce una tossina, una

enterotossina, che è formata da 2 subunità A e 5 subunità B. La cellula bersaglio è rappresentata

dall’enterocita maturo. La subunità B si lega ad un recettore sulla superficie dell’enterocita maturo,

un ganglioside, e fa traslocare all’interno dell’enterocita le subunità A, che si staccano, una delle

due agisce sulla produzione di AMP ciclico, fa sì che all’interno della cellula si accumuli una gran

quantità di AMP ciclico, e questo provoca il blocco della pompa sodio potassio, l’eliminazione di

ioni all’esterno del lume intestinale, di una gran quantità di acqua che non viene poi riassorbita a

livello del colon, per cui alla fine la sintomatologia è data da una diarrea acquosa molto

abbondante, anche litri al giorno, e se non si ha un apporto di liquidi all’organismo necessari per

riequilibrare tutta questa perdita, si può avere anche morte per disidratazione. La subunità A1

determina l’accumulo di AMP ciclico nell’enterocita. Come? La formazione di AMP ciclico è

regolata da due proteine, che vanno ad agire sull’AMP ciclasi. Una proteina che si chiama GS,

proteina stimolatoria che stimola l’AMP ciclasi a formare AMP ciclico, e una proteina GI, G

inibitoria, che invece inibisce l’adenilato ciclasi. Come agisce la subunità A1 dell’enterotossina

colerica? Va a bloccare la proteina GS, la stimolatoria, in modo che questa continui a stimolare

l’AMP ciclasi a formare AMP ciclico, e questo provoca un accumulo diarrea, disidratazione, ecc.

Anche l’E.Coli produce tossine, una termolabile che agisce come la tossina colerica, mantenendo

nello stato attivato la proteina GS, che stimola continuamente l’adenilato ciclasi a produrre AMP

ciclico. Le altre due tossine che produce l’E.Coli sono TS1 e TS2, termo-stabile, che invece

provocano un accumulo di GMP ciclico, che però ha gli stessi effetti dell’AMP ciclico, cioè perdita

liquidi e diarrea.

C’è anche un’altra tossina che provoca accumulo di adenilato ciclasi, la tossina prodotta dalla

Bordetella Pertussis = pertosse. Malattia che colpisce la prima infanzia, il battere viene acquisito

per via aerea, si localizza prima nelle prime vie aeree e causa infiammazione di naso e faringe, e

poi si estende alle vie aeree profonde. La Bordetella Pertussis produce una tossina che è ADP

ribosilante per la proteina GI, G inibitoria, e la inattiva, provoca la sua ADP ribosilazione e la

inattiva, quindi non essendoci più la proteina GI, la GS funziona in continuo, quindi induce

l’adenilato ciclasi a produrre AMP ciclico, grande accumulo di AMP ciclico stavolta non

nell’intestino ma nelle cellule della mucosa respiratoria, e anche in questo caso perdita di liquidi,

produzione di una gran quantità di muco, che determina problemi respiratorio, soprattutto accessi

improvvisi di tosse, dovuto a questo rilascio di liquidi e formazione di tanto muco.

La tossina tetanica è una tossina di tipo AB ma non è ADP ribosilante, provoca il tetano, causato

dal Clostridium Tetani, battere sporigeno Gram+, anaerobio obbligato, che si trova come saprofita

nel terreno, e poi si trova anche nell’intestino di diversi animali, soprattutto nei ruminanti. Il C.

Tetani nell’organismo si mantiene nel punto della prima infezione, però produce delle tossine,

neurotossine, la tetanospasmina, che si diffondono in tutto l’organismo e vanno ad agire sulle loro

cellule bersaglio, cioè quelle del SNC. Nell’ambiente esterno si trovano soprattutto le spore di

questo microrganismo, se ingerite non succede niente in genere (adulto sano). Se ci sono ferite

profonde, in particolare dei traumi dovuti ad incidenti stradali per esempio, sporche di terriccio o

polvere che veicolano le spore del C.Tetani. Se la ferita è profonda e c’è molto materiale necrotico,

si forma un ambiente anaerobio che è adatto alla germinazione della spora del Clostridium, la

spora germina e abbiamo la forma vegetativa che comincia a moltiplicarsi e a produrre la

neurotossina, tetanospasmina, che attraverso il sistema circolatorio si diffonde in tutto l’organismo,

arriva alle cellule del sistema nervoso, e provoca una paralisi spastica. Come? La neurotossina è

di tipo A1 B1, e va ad agire sulle sinapsi del sistema nervoso, in particolare le sinapsi inibitorie dei

motoneuroni spinali e bulbari con lo stesso sistema. Prima si attacca alla subunità B, e la subunità

A1 viene traslocata all’interno. L’impulso nervoso si trasmette mediante mediatori eccitatori e

mediatori inibitori. Gli eccitatori permettono la depolarizzazione della membrana post sinaptica, e

quindi il passaggio dell’impulso nervoso, che poi determina alla fine la contrazione muscolare. Gli

inibitori impediscono questo processo. La neurotossina del tetano va ad impedire il rilascio del

mediatore inibitorio del neurotrasmettitore inibitorio, quindi se manca questo l’impulso passa

continuamente, e questo porta ad una continua contrazione del muscolo, e quindi ad una paralisi

spastica. Il tetano si può presentare in 3 forme: generalizzato, localizzato e neonatale. Nel

generalizzato la sintomatologia comincia dalla testa, c’è una contrazione dei muscoli masseteri e

muscoli della faccia che danno un aspetto particolare al volto, poi la sintomatologia si diffonde alle

altre parti del corpo (*) dipinto in cui si vede la contrazione della muscolatura dorsale. Tutte queste

contrazioni sono molto dolorose. Alla fine avviene la paralisi dei muscoli respiratori. Nel tetano

localizzato la sintomatologia rimane localizzata nel punto in cui è entrato il battere, e nel tetano

neonatale invece si ha un’infezione a livello del cordone ombelicale.

Il Clostridium Botulinum produce la neurotossina botulinica, di tipo AB, non ADP ribosilante, e

provoca intossicazione alimentare. Il C.Botulinum è Gram+ , sporigeno, anaerobio obbligato, vive

come saprofita nel suolo e nell’intestino di diversi animali tra i quali molti ruminanti,e può

contaminare l’ambiente. Qui si ritrovano essenzialmente le spore, non la forma vegetativa. Può

passare dall’ambiente agli alimenti. Se le condizioni in cui si trova l’alimento sono favorevoli la

spora può germinare, dare luogo alla forma vegetativa e produrre la tossina botulinica. Se questa

tossina viene ingerita viene assorbita a livello intestinale, attraverso il sistema circolatorio va nel

sistema nervoso e in particolare va ad agire sulle placche neuromuscolari, cioè la congiunzione tra

il nervo e il muscolo, e qui dà una paralisi di tipo flaccido. Ha una struttura di tipo A1 B1, e a livello

di queste placche blocca la trasmissione dell’impulso della contrazione del muscolo, quindi il

muscolo rimane sempre rilassato, e da qui la paralisi flaccida. Il botulino può essere alimentare,

ma anche neonatale o da ferita. In quello alimentare sono implicate soprattutto le conserve fatte in

casa, tipo i carciofini, i funghi sott’olio, perché possono essere sporchi di terriccio, e quindi

contaminati dalle spore del Clostridium botulinum. La bollitura non fa nulla alla spora, fino a 100

gradi questa resiste. Carciofi e funghi si mettono in olio, che crea atmosfera anaerobia, perché

isola la spora dall’aria, e quindi in queste conserve la spora germina e dare la forma vegetativa

che produce la tossina. La tossina viene disattivata ad 80 gradi, però questi alimenti in genere si

mangiano senza cuocerli, per cui la tossina attraverso il sistema circolatorio arriva alle placche e

determina la paralisi.

Non sono a rischio i sottaceti o le conserve di pomodoro perché sono acide, il pH è inferiore a 4.7

e la spora non si trasforma nella forma vegetativa, così come le marmellate che hanno troppo

zucchero, ed impedisce la germinazione.

Neonatale: ingerendo le spore, nell’intestino del neonato si trovano condizioni che permettono la

germinazione della spora. L’intestino è ancora immaturo e ne permette la germinazione. Si ha

produzione in vivo della tossina botulinica.

Da ferita: funziona come il Chlostriudium Tetani.

Foto in basso (*) = iniezione. La tossina botulinica viene usata a scopo estetico antirughe, poiché

causa la paralisi flaccida, rilassa la muscolatura facciale e determina attenuazione delle rughe,

azzerando però la mimica facciale.

Controllo genetico della produzione di queste tossine può essere di molti tipi: cromosomico

(tossina pertosse), fagico, cioè dovuto ad un fago temperato (tossina botulinica), plasmide (tossina

tetanica).

Le tossine citolitiche. Sono tantissime, alcune hanno effetti più specifici, cioè la cellula bersaglio

e il tipo di azione che svolge è più specifico, ed altre hanno effetti più generali.

La tossina alfa dello Staphylococcus aureus è specifica. E’ una proteina che si riunisce insieme a

formare degli ettameri (*) che costituiscono dei pori inserendosi nella membrana citoplasmatica

della cellula bersaglio. La formazione di questi pori provoca scompensi nella pompa sodio

potassio, scompensi negli scambi tra l’interno e l’esterno della cellula, finché la cellula non muore.

Queste tossine vengono chiamate anche emolisine, perché provocano l’emolisi dei globuli rossi. Il

loro bersaglio naturale nell’ospite non sono i globuli rossi, ma altre cellule, in particolare i linfociti.

Poi ci sono altre tossine, prodotte sempre dallo S.aureus, che hanno dei meccanismi d’azione

meno specifici e più generici, come la tossina delta, funziona come un detergente, ha una parte

idrofila e una idrofoba, e va a scompaginare il doppio strato fosfolipidico delle membrane della

cellula dell’ospite, scompaginando il foglietto. Lo stesso l’emolisina beta dello S.aureus.

La tossina alfa del Clostridium Perfringens invece provoca l’idrolisi dei fosfolipidi.

Superantigeni. Sono molecole soprattutto proteiche, che hanno la capacità di legarsi (*) a destra.

A sinistra (*) c’è l’attivazione normale del linfocita T Helper che avviene quando il T Cell Receptor

del linfocita T Helper riconosce specificamente un antigene, portato nel complesso maggiore di

istocompatibilità di classe 2 da un APC, un macrofago, o una cellula dendritica. Invece il

superantigene si mette a ponte, legandosi tra le proteine del TCR, e le proteine del CMI,

indipendentemente dal riconoscimento specifico dell’antigene. Quindi in questo modo vengono

attivati tantissimi linfociti T Helper, non solo quello che riconosce specificamente l’antigene, perché

non è necessario questo riconoscimento. Normalmente quando il T Helper viene attivato comincia

a produrre una gran quantità di citochine che vanno ad agire sulle cellule e promuovono

l’infiammazione di tutta una serie di fenomeni che hanno una funzione di difesa. Però se queste

citochine sono troppo abbondanti causano un danno enorme all’organismo, quindi dei fatti

patologici che possono arrivare fino allo shock tossico. Esempi sono le enterotossine e le tossine

pirogene dello Staphylococcus Aureus, e la tossina dello shock tossico 1 dello Staphylococcus

Aureus.

La tossina dello shock tossico fu identificata negli anni ’70 in una paziente che era andata incontro

a shock tossico, e fu scoperto che lo Staphylococcus Aureus si era moltiplicato in tamponi

mestruali che erano stati tenuti per una settimana. Quindi si moltiplica in un punto ben preciso, che

non erano i tessuti dell’ospite ma questi tamponi intrisi di sangue, e da lì produceva questa tossina

che andava in circolo e dava la sindrome dello shock tossico.

La stessa cosa la possono fare le enterotossine che a bassa dose danno dei sintomi intestinali,

diarrea ecc, ma quando sono troppo numerose si comportano da superantigene, che provoca lo

shock, così come le tossine biogeniche, cioè quelle che fanno venire la febbre. Meno la tossina

eritrogenica dello S.Pyogenes, che provoca la scarlattina.

Endotossina. Membrana parietale esterna dei batteri Gram- , la parte più esterna e in particolare

il lipopolisaccaride. La parte tossica è il lipide A, formato da due molecole di glucosammina fosfato,

con attaccati degli acidi grassi che prendono rapporti con il foglietto interno della membrana

parietale esterna. Questa è la parte tossica.

L’endotossina è immunogena, quindi provoca una risposta con produzione di anticorpi, ma gli

anticorpi prodotti non sono capaci di neutralizzare l’effetto tossico, perché la parte antigenica del

lipopolisaccaride è rappresentata dall’antigene O, le lunghe catene polisaccaridiche che sporgono

dalla cellula batterica. E’ questa parte che determina la risposta anticorpale, quindi gli anticorpi

saranno diretti verso l’antigene O ma la parte tossica è il lipide A, per cui gli anticorpi non sono

capaci di neutralizzare l’attività tossica. Endotossina non disattivata dal calore. Il lipopolisaccaride

è lo stesso in tutti i Gram- , quindi l’effetto è sempre lo stesso, non si differenzia come le

esotossine, ma i Gram- fanno tutti lo stesso effetto. E’ attiva solo se inoculata nell’organismo, e

non attiva se viene ingerita, perché viene degradata dagli enzimi digestivi, e poi i suoi effetti sono

dose dipendente. In piccole dosi ha una funzione difensiva, nel senso che attiva le difese

dell’organismo. In basse dosi stimola la febbre, è pirogenica, che ha sempre un valore protettivo. A

volte il rialzo della temperatura corporea anche di un solo grado impedisce la moltiplicazione dei

batteri, però ad alti livelli può provocare degli effetti gravi fino allo shock tossico come i

superantigeni visti prima. Come fa? La sua azione tossica si esplica solo quando il battere è morto

e disgregato, e il lipopolisaccaride è libero nei fluidi dell’organismo, come il sangue. Quando è

libero nel sangue trova delle proteine particolari, le LPS binding proteins, che sono prodotte dal

fegato, e sono riversate nel sangue. Queste proteine legano il lipopolisaccaride, si forma un

complesso tra il lipopolisaccaride e queste proteine prodotte dal fegato, che ha un recettore

specifico sul macrofago. Questo recettore specifico è rappresentato dal CT14. Il complesso

lipoproteina LPS binding protein viene riconosciuto dal CT14, si lega specificamente, e questo fa sì

che vengano attivati una gran quantità di Toll Like Receptor, cioè recettori di membrana che una

volta attivati mandano dei segnali intra - citoplasmatici, e tra questi ci saranno dei segnali che

vanno a deprimere i geni che promuovono la produzione di un gran numero di citochine. Sono le

citochine le molecole effettrici dell’attività endotossica, non è il lipopolisaccaride in sé che svolge

l’azione endotossica. Le citochine agiscono soprattutto sulla permeabilità dei vasi sanguigni, e

sulla coagulazione sanguigna, aumentano la permeabilità dei vasi sanguigni, cosi che esca il

plasma e anche i globuli bianchi, e quindi c’è una caduta della pressione sanguigna, e una

leucopenìa che poi viene rimpiazzata da una gran quantità di globuli bianchi, e quindi è seguita da

una leucocitosi.

Poi il lipopolisaccaride provoca delle alterazioni nella coagulazione del sangue, fino ad avere una

coagulazione all’interno dei vasi stessi, con la formazione di trombi intravasali. Se l’endotossina è

molto numerosa, il quadro procede con la sindrome da insufficienza respiratoria acuta, la sindrome

da insufficienza multipla ad organi, fino allo shock settico e alla morte. La presenza di

lipopolisaccaride, di sostanze pirogeniche, deve essere controllata in tutte le preparazioni

iniettabili, l’acqua per costituire antibiotici, l’acqua per la dialisi, tutto ciò che può essere iniettato

deve essere apirogeno e riportato in etichetta. Per rilevare la presenza di lipopolisaccaride viene

usato un test, il LAL test, o “Saggio del lisato di amebociti di Limulos” che è molto efficace. Il

Limulos è un animale con un occhio solo, chiamato granchio reale, più parente degli scorpioni,

vive nell’oceano atlantico e quando si riproduce si sposta verso la costa. Qui questi animali

vengono catturati e viene prelevato il sangue. Quando prelevato è incolore, poi diventa blu perché

contiene emocianina, contenente rame, che si ossida all’ossigeno. All’interno del sangue c’è un

solo tipo di cellule, l’amebocita, che ha funzioni di difesa. In presenza di batteri Gram- forma un

ammasso gelatinoso che ingloba questi batteri e serve per neutralizzarli. Questa proprietà è stata

sfruttata proprio per mettere su questo saggio, per identificare il lipopolisaccaride. E’ talmente

sensibile che mette in evidenza anche piccolissime quantità del lipopolisaccaride. Dal sangue

vengono estratti gli amebociti, vengono lisati, e vengono messi in contatto con l’acqua, con il

liquido nel quale si può mettere in evidenza se è presente o meno il lipopolisaccaride. Se è

presente si forma un coagulo talmente denso che anche se si rigira la provetta rimane adeso al

fondo della provetta. L’acqua iniettabile non deve contenere più di 0,25 unità internazionali per ml

di endotossina batterica. Poi ci sono anche delle endotossine diverse dal lipopolisaccaride. Lo

stesso peptidoglicano a volte è poco degradabile, e quindi rimane a lungo nell’organismo,

soprattutto i peptidoglicani incompleti, ma anche gli acidi lipoteicoici possono funzionare anch’essi

da endotossina, con attività sicuramente meno potente, però hanno proprietà simili all’endotossina.

Riassunto patogenesi malattie batteriche: malattia data dal danno causato dalla presenza del

microrganismo. Danno può essere diretto, dovuto alla moltiplicazione del microrganismo stesso,

soprattutto i batteri fermentanti producono gas, acidi, che danneggiano direttamente i tessuti,

quindi danno diretto dovuto a metabolismo batterico, enzimi, e tossine. Poi la malattia può essere

dovuta anche a un danno indiretto, si è visto che molti prodotti batterici attivano una risposta

immunitaria data dall’infiammazione, e non solo, dall’attivazione del complemento, produzione di

citochine ecc, e questa risposta può causare un danno ai tessuti dell’ospite. Oppure danni

esclusivamente su base immunitaria, quindi dovuti alla formazione di immunocomplessi che

possono depositarsi in varie parti dell’organismo, nell’articolazione ecc, la presenza di

superantigeni, oppure una reazione dell’organismo verso le proprie componenti, una risposta

immunitaria verso se stesso, cioè danni su base autoimmunitaria. Alcuni batteri causano il danno

perché invadono i tessuti, quindi danneggiano i tessuti. Altri invadono e producono tossine, altri

solo per la produzione di tossine. I Clostridium tetani rimane in un punto ben preciso, però produce

una tossina che causa danni su tutto l’organismo. Altri provocano un danno indiretto dovuto alla

reazione dell’ospite. Tutte le malattie che finiscono in -ite, appendicite, colite, gengivite, sono tutte

dovuto a un danno indiretto relativo alla presenza del microrganismo. Il danno al tessuto lo causa

l’infiammazione alla fine, scatenata dal microrganismo, oppure possono essere delle malattie

causate proprio da una reazione dell’organismo verso le proprie componenti, le malattie

autoimmuni.

FARMACI ANTIBATTERICI

Le sostanze ad azione antibatteriche sono tantissime ed esistono da tanto tempo ma non tutte

possono essere utilizzate nella terapia. Bisogna fare una distinzione tra sostanze chimiche che

agiscono su strutture molteplici, su bersagli non specifici, e invece sostanze chimiche che

agiscono su strutture e bersagli precisi.

Queste sostanze chimiche che non agiscono su bersagli specifici sono ad esempio i disinfettanti.

Sono molecole che hanno una parte idrofila e una parte idrofoba che vanno ad interagire con i

fosfolipidi delle membrane, e quindi non fanno differenziazione tra la membrana della cellula

eucariotica e quella procariotica. I disinfettanti non possono essere usati in terapia. Mentre le

sostanze chimiche con azione antimicrobica che si possono utilizzare in terapia devono agire su

bersagli precisi, su delle strutture presenti nel microrganismo e non nelle cellule eucariotiche, e

sono i farmaci antibatterici. Tra questi ci sono gli antibiotici propriamente detti, sostanze di origine

naturale, sostanze biologiche naturali, che sono prodotte da batteri o miceti che hanno un’azione

chiaramente di uccidere gli altri microrganismi, in particolari altri batteri, non sono invece attivi sulla

specie che li produce.

Quindi antibiotico = sostanza chimica di origine naturale. I chemioterapici invece sono sostanze

chimiche che hanno una qualche attività terapeutica, non è detto che siano antimicrobica, può

essere anche antinfiammatoria, antitumorale, antiallergica, ecc… e sono sostanze chimiche di

sintesi, sono molecole ottenute per reazioni chimiche. Invece gli antibiotici semi sintetici sono

antibiotici che derivano da quelli naturali modificati con delle reazioni chimiche per conferirgli delle

proprietà che sono utili nella terapia.

Il primo antibatterico commercializzato è stato commercializzato nel 1935, ed è il Prontosil,

commercializzato dalla Bayer, e si tratta di un colorante rosso azoico che è un “prodrug” una volta

assunto dall’organismo viene metabolizzato da un sulfamidico, la sulfamide, che è un

antibatterico. Gli antisulfamidici sono antibatterici che vengono utilizzati anche attualmente. Poi ci

fu la scoperta della penicillina da parte di Fleming nel 1928. Il primo che ha intuito il fatto che le

muffe producono delle sostanze con azione antibatterica alla fine non fu Fleming (scoperta

casuale). Invece un italiano nel 1895 pubblicò su una rivista italiana un articolo in cui illustrava gli

effetti delle muffe sulla crescita batterica, Vincenzo Tiberio. Dimostrò scientificamente l’attività

antibatterica di estratti di muffe. Non fu una scoperta casuale, fu dettata da osservazioni di tipo

epidemiologico, era un medico igienista. Pozzo con condomini che si ammalavano di

gastroenterite (esperimento). La sua pubblicazione non suscitò l’entusiasmo della comunità

scientifica. Alla fine il nobel lo prese Fleming.

Poi ci fu la penicillina, e tanta ricerca sui nuovi antibiotici, con un programma ben studiato, perché

la fonte principale degli antibiotici è rappresentata dai microrganismi del suolo, per cui negli anni

‘60/’70 vennero proprio studiati questi microrganismi del suolo per vedere se erano capaci di

produrre antibiotici, e quindi in quel periodo furono messe a punto numerose sostanze con attività

antibatterica.

Cosa sono gli antibiotici? Quali caratteristiche?

Sostanze chimiche di origine naturale che hanno la capacità di uccidere i batteri o inibirne la

moltiplicazione. Antibatterici sono prodotti principalmente da funghi e actinomiceti, in particolare

streptomiceti. Questo suffisso “streptomiceti”, “mices”, non vuol dire che sono funghi, sono batteri,

la colonia degli streptomiceti somiglia ad una colonia fungina perché sono batteri molto allungati

che si dispongono un po’ come le ife fungine, e per questo hanno questo nome. Producono

antibiotici anche alcuni germi appartenenti al genere bacillus. Dal punto di vista biochimico sono

delle molecole organiche complesse, che non sono indispensabili per la vita del microrganismo

che li produce, e in genere vengono prodotti alla fine della fase di crescita logaritmica, nella fase

stazionaria, e vengono prodotti perché? Non si sa bene. Sicuramente hanno una funzione

antagonista, perché uccidono gli altri microrganismi che possono competere con il substrato che

serve al microrganismo che li produce per nutrirsi, accrescersi, ecc. Poi per quanto riguarda i

funghi, sembra che abbiano un ruolo nella riproduzione del fungo, nella formazione delle spore. Le

spore dei funghi non sono come quelle dei batteri, non sono forme di resistenza, ma sono una

forma per la riproduzione, e sicuramente hanno un’importanza nel ciclo vitale del microrganismo

che li produce, perché il microrganismo consuma una gran quantità di energia per produrre queste

molecole, ma ad oggi non è chiarito.

Come possiamo utilizzare, e perché possiamo utilizzare queste molecole?

Perché hanno un’azione sul microrganismo ma non sull’ospite. Sono dotati di tossicità selettiva.

La selettività è possibile perché le cellule procariotiche sono diverse dalle cellule eucariotiche. I

batteri sono procarioti, hanno una cellula diversa da quella dell’ospite, eucariota, per cui vengono

sfruttate queste differenze per avere una selettività nell’azione delle molecole di antibiotico.

Bisogna che l’antibiotico inibisca una via biosintetica o agisca su delle strutture che sono presenti

nel battere e non nella cellula dell’ospite. In genere agiscono soltanto sulle vie metaboliche,

bloccandole, per cui hanno una certa attività solamente nei batteri che hanno in funzione queste

vie. I batteri quiescenti non sono sensibili dagli antibiotici, ad eccezione delle polimixine. Da cosa

deriva questa selettività? Ci sono strutture presenti nel battere ma non nella cellula eucariota, per

esempio la parete cellulare, che rappresenta un ottimo bersaglio per l’antibiotico, infatti molti di

questi agiscono sulla fase di sintesi della parete della cellula batterica. Le cellule eucariotiche non

hanno parete. Oppure possono sfruttare una diversa capacità di penetrazione attraverso gli

involucri esterni, sempre per la presenza della parete, ma anche la membrana del battere, che è

leggermente diversa rispetto a quella delle cellule eucariotiche. Oppure possono avere una diversa

affinità per strutture presenti sia nella cellula eucariotica che in quella procariotica, però strutture

che sono leggermente diverse, come i ribosomi. Quelli della cellula procariotica sono più piccoli,

hanno un’organizzazione diversa, per cui ci sono degli antibiotici che hanno come bersaglio i

ribosomi dei batteri, oppure le polimerasi, DNA e RNA polimerasi, soprattutto RNA polimerasi

batterica, è diversa rispetto a quella della cellula eucariotica, e ci sono alcuni antibiotici che vanno

ad agire proprio sulla RNA polimerasi della cellula batterica. Rispetto all’attività dell’antibiotico nei

confronti dei batteri si possono distinguere gli antibiotici batteriostatici che inibiscono la

moltiplicazione del battere, la sua crescita, e gli antibiotici battericidi, che li uccidono. In questi

grafici in basso (*) di vede l’effetto su una coltura di batteri che ha l’aggiunta di un antibiotico

batteriostatico (a sinistra), si vede che il numero di batteri non aumenta nel tempo, rimane

costante, fino a che non si ha l’esaurimento della cellula batterica che muore per cause diverse

dalla presenza dell’antibiotico. Mentre a destra vediamo come influisce l’aggiunta di un

antibatterico battericida su una coltura batterica. Il numero delle cellule batteriche diminuisce

subito dopo l’aggiunta. Perché i batteri vengono veramente uccisi. Questo ha un riflesso anche

nell’uso in terapia dei vari antibiotici. I battericidi sono sempre da preferire nelle infezioni gravi, e

quando si trattano gli individui immunocompromessi, mentre i batteriostatici possono essere

utilizzati quando si presume che le difese immunitarie dell’individuo riescano ad eliminare quei

batteri che rimangono, quindi non vanno usati negli individuo immunodepressi. I battericidi a loro

volta si distinguono in antibiotici tempo-dipendenti e concentrazione-dipendenti.

I “tempo-dipendenti” sono quelli per i quali quando io aumento la concentrazione, non aumenta il

numero dei batteri uccisi, quindi devo mantenere una concentrazione superiore alla MIC, che è la

minima concentrazione vivente, vicino alla MIC, per un tempo molto lungo. Funzionano così la

vancomicina, e diversi antibiotici betalattamici.

Poi ci sono quelli “concentrazione-dipendenti”, più aumento la concentrazione e maggiore è il

numero dei batteri uccisi, quindi in questo caso dal punto di vista terapeutico dovrò somministrare

un’unica dose molto elevata in modo da raggiungere una concentrazione all’interno dell’organismo

superiore anche di 10 volte alla MIC, così sono sicura che uccido il maggior numero di batteri

possibile. Eventualmente posso somministrare un’altra dose a distanza di tempo. Mentre nel caso

dei tempo-dipendenti devo mantenere costante la concentrazione dell’antibiotico nell’organismo,

vicino alla MIC, per cui è preferibile un’infusione continua oppure somministrazioni più ravvicinate

di dosi minori di antibiotico. Si possono classificare in molti modi, oltre che battericidi,

batteriostatici, anche secondo il cosiddetto spettro d’azione. Secondo lo spettro d’azione avremo

gli antibiotici ad ampio spettro, a spettro medio e ristretto.

Quelli ad ampio spettro sono attivi sia sui batteri Gram+ che Gram-.

Spettro medio = Gram+ e pochi Gram- oppure viceversa.

Mentre a spettro ristretto o solo Gram- o solo Gram+.

Si possono classificare secondo la modalità d’azione e la struttura bersaglio, quindi avremo

degli antibiotici che interferiscono sulla sintesi della parete cellulare che è un buon bersaglio,

antibiotici che inibiscono la sintesi degli acidi nucleici, che inibiscono la sintesi proteica sempre per

via dei ribosomi che sono diversi, che vanno ad attaccare delle strutture già presenti, in particolare

disgregano la membrana parietale esterna dei Gram- oppure che funzionano da antimetaboliti

sono delle sostanze chimiche che hanno una struttura simile a dei metaboliti del battere stesso,

che entrano in una certa via metabolica. L’enzima che ha come substrato naturale un certo

metabolita lega con maggiore affinità l’antimetabolita, questo legame diventa stabile, così che

l’enzima non può più svolgere la sua funzione, e invece che il substrato naturale lega questo

metabolita, così che la via biosintetica si interrompa.

(*) Schema dove sono riportati i principali gruppi di antibiotici e il loro bersaglio.

Cominciamo a vedere gli antibiotici che agiscono sulla parete della cellula batterica.

Schema della parete = unità fondamentale costituita da n-acetil-glucosammina e acido n-acetil-

muramico, legati insieme da un legame glucosidico. All’acido n-acetil-muramico è legata una

catena peptidica laterale formata da L-Alanina, acido d-glutammico, acido ammino pimelico o L-

lisina a seconda che si tratti di un Gram- o Gram+, e l’ultima la D-Alanina. Questi mattoncini

fondamentali sono legati insieme dal legame beta 1-4 glucosidico, e poi le varie catene che si

formano sono legate tra loro con legami transpeptidici che si formano tra le catene laterali, tra

l’ultimo amminoacido di una catena – una D-alanina – e l’ultimo amminoacido della catena

adiacente, un legame che può essere diretto oppure mediato da altri amminoacidi.

(*) Via biosintetica della parete. Avviene in 3 comparti; il comparto citoplasmatico, poi c’è

l’attraversamento della membrana della cellula, e poi l’inserimento all’esterno della membrana

della cellula nella parete che sta nascendo, che si sta formando. Ci sono antibiotici che agiscono in

tutte e tre queste fasi della via biosintetica della parete. Vediamo quali sono gli antibiotici che sono

attivi sulla prima tappa della sintesi del peptidoglicano.

La fosfomicina (ampio spettro). E’ un antibiotico prodotto da Streptomices, un battere, ha una

struttura simile al fosfoenolpiruvato. Nel citoplasma si parte dalla n-acetil-glucosammina,

intervengono alcuni enzimi, e trasformano l’n-acetil-glucosammina in acido n-acetil-muramico. Uno

di questi enzimi è il piruvato UDP NAG transferasi, che ha come substrato naturale il

fosfoenolpiruvato, che viene aggiunto alla n-acetil-glucosammina per trasformarla in acido n-acetil-

muramico. La fosfomicina è un antimetabolita, un antagonista, ha una struttura simile, e l’enzima

piruvato UDP NAG transferasi ha un’affinità maggiore per la fosfomicina rispetto che al suo

substrato naturale, per cui si forma questo legame con la fosfomicina, e si interrompe la via

sintetica che porta alla formazione di acido n-acetil-muramico. Che succede ora? Non si può

formare il peptidoglicano, quindi non si può formare la parete della cellula batterica, quindi la

cellula batterica muore. La fosfomicina è un antibiotico ad ampio spettro che viene utilizzata

soprattutto nelle infezioni delle vie urinarie, ma siccome ha anche un’ottima diffusione tissutale,

viene utilizzata in quelle infezioni localizzate in punti difficilmente raggiungibili da altri antibiotici,

come per esempio le infezioni alle meningi, alle ossa, ecc. Si conoscono delle resistenze

batteriche nei confronti di questo antibiotico, però sono stabili nel tempo, altre purtroppo sono in

aumento, e ciò costituisce un bel problema.

Sempre sulla prima tappa della sintesi del peptidoglicano, la fase citoplasmatica, c’è un altro

antibiotico, la D-cicloserina, una molecola con struttura ciclica, però assomiglia alla D-Alanina (*).

La D-cicloserina funziona da antagonista, antimetabolita. Si lega a quegli enzimi che servono a

trasformare la L-Alanina in D-Alanina, e a formare il dimero D-Alanina D-Alanina che verrà inserito

nell’ultima parte del polipeptide, attaccato all’acido n-acetil-muramico. Quindi vengono bloccati

questi enzimi, per cui non si completa il peptide attaccato all’acido n-acetil-muramico, e quindi non

si ha la formazione del peptidoglicano. Questa D-Cicloserina viene prodotta da un battere, un

Actinomicete, e viene utilizzata come farmaco di seconda scelta nella terapia delle infezioni da

Mycobacterium tubercolosis, che risulta resistente ad altri farmaci di prima scelta.

Antibiotici attivi nella seconda tappa della sintesi del peptidoglicano.

Seconda tappa = trasferimento del mattoncino dell’unità fondamentale del peptidoglicano o corti

polimeri di peptidoglicano attraverso la membrana della cellula batterica, mediata da un

trasportatore lipidico, il bactoprenolo.

La bacitracina è un antibiotico prodotto da un battere “bacillus subtilis”, si tratta di una miscela di

prodotti diversi che sono dei polipeptidi ciclici. Questi polipeptidi si legano in modo covalente, in

modo indissolubile, al bactoprenolo, e fanno sì che questo non possa svolgere la sua funzione di

trasporto dell’unità fondamentale del peptidoglicano al di fuori della membrana citoplasmatica. La

bacitracina è un antibiotico utilizzato soprattutto per uso topico, su superfici come la cute, le

mucose, come creme, lozioni, spray, eccetera, e contro gli stafilococchi che sono resistenti ad altri

antibiotici. Entra anche in composizioni miste insieme ad altri antibiotici, per esempio il Bimixin,

che viene utilizzato soprattutto per le infezioni intestinali, ed è costituito da bacitracina più

neomicina. La neomicina è un aminoglicoside che inibisce la sintesi proteica. Queste molecole a

livello intestinale non vengono assorbite, si concentrano a livello intestinale e svolgono la loro

attività durante le infezioni, in caso di infezioni intestinali. C’è un altro prodotto, il cicatrene,

costituito da bacitracina e neomicina, è per uso topico, e contiene anche amminoacidi come la

glicina, cisteina e la treonina che facilitano la cicatrizzazione. La bacitracina, a parte questi usi,

deve essere utilizzata con molta prudenza perché è neurotossica.

Terza tappa della sintesi del peptidoglicano. Succede che le unità fondamentali sono state

trasportate fuori dalla membrana citoplasmatica, e entrano in gioco degli enzimi che catalizzano la

formazione del legame glucosidico beta 1-4 glucosidico tra le varie unità e la transpeptidazione,

cioè il legame tra le catene peptidiche legate all’acido n-acetil-muramico. Ci sono diversi antibiotici

che agiscono su questa tappa, tra questi la vancomicina e la ristocetina. Sono lipopeptidi. La

vancomicina è prodotta da Streptomices orientalis, un actinomicete, e ha una struttura tale che va

ad inserirsi all’estremità del pentapeptide legato all’acido n-acetil-muramico, praticamente ha

un’affinità per le due D-Alanine, si inserisce tra esse, e sequestra il substrato alle transpeptidasi,

che dovrebbero formare il legame transpeptidico. Non rende più disponibile le alanine per la

formazione del legame transpeptidico. La ristocetina agisce nello stesso modo, prodotta dal

Nocardia Lurida, sempre un actinomicete, però non è più usata in terapia, perché determina

coagulazione intravasale dovuta all’aggregazione piastrinica. Mentre la vancomicina è ancora

molto usata, anzi è una buona arma, perché utilizzata per le infezioni sostenute da batteri Gram+

che producono betalattamasi, e quindi sono resistenti alla penicillina per esempio, e a tutti i suoi

derivati.

Antibiotici betalattamici.

Si legano alle PBP, penicilline binding proteins, che sono le proteine enzimatiche che catalizzano

la transpeptidizzazione. Si legano a queste proteine in modo covalente indissolubile, perché hanno

un’affinità strutturale con il dimero D-Alanina D-Alanina, che rappresenterebbe il substrato naturale

di questi enzimi. Una volta che si è formato il legame con la penicillina questo non si rompe più, e

rende l’enzima non più funzionante, per cui non si ha la transpeptidazione. Allora non si forma

nuovo peptidoglicano. Però questi antibiotici sono battericidi, e la non formazione di nuovo

peptidoglicano non spiega tanto bene il fatto che siano battericidi, infatti sembra che entrino in

azione altri enzimi. Cioè, si arresta la sintesi della parete, ma gli antibiotici betalattamici sembra

che provochino l’attivazione di altri enzimi, delle autolisine, in particolare l’amidasi e la glicosidasi.

La glicosidasi rompe i legami beta 1-4 glicosidici, e l’amidasi rompe il legame n-acetil-muramico e

il pentapeptide o tetrapeptide.

Tutto questo che conseguenze ha?

Di disgregare anche la parte di parete che è già stata sintetizzata, per cui si avrà la lisi osmotica

della cellula batterica.

I più importanti betalattamici, prendono questo nome perché hanno un anello tetratomico, tre

carboni ed un azoto, (*) foto, che forma un’ammide ciclica, il cosiddetto anello betalattamico. Il

lattame è il (*) doppio legame tra carbonio ed ossigeno. Questo è il sito attivo dell’antibiotico, è

quello che si lega alle transpeptidasi e ne impedisce l’azione. Il primo gruppo di antibiotici

betalattamici è costituito dalle penicilline, prodotte dal fungo Penicillium notatum e il nucleo

fondamentale è costituito proprio da questo gruppo betalattamico, l’anello betalattamico, al quale è

condensato un altro anello tiazolidinico a costituire l’acido 6-amino-penicillanico. Da notare che

all’anello betalattamico è attaccata una catena N acilica R.

L’altro gruppo di antibiotici betalattamici importante è costituito dalle cefalosporine. Anch’esse

presentano l’anello betalattamico con attaccata la catena N acilica, condensato stavolta con un

anello diidrotiazinico, a costituire l’acido 7-amino-cefalosporanico. Le cefalosporine sono prodotte

da un fungo, il Cefalosporium Acremonium. Queste catene laterali R che nelle cefalosporine sono

presenti anche nell’anello diidrotiazinico possono essere variate, sia facendo sviluppare questi

funghi in mezzi di coltura a composizione differente, sia con reazioni chimiche, in modo da

ottenere delle proprietà diverse di questi antibiotici.

La penicillina naturale è quella in alto (*), benzilpenicillina o penicillina G, e ha delle

caratteristiche particolari. Non è stabile in ambiente acido, per cui non si può assumere per bocca,

perché passando attraverso il pH dello stomaco viene inattivata. Poi è sensibile alle betalattamasi,

e è attiva solo sui batteri Gram+. Facendo crescere il fungo che produce la penicillina G in un

mezzo di coltura differente oppure chimicamente, questi radicali attaccati ai due anelli si possono

cambiare in modo da ottenere delle penicilline con caratteristiche migliori, e quindi sono state

ottenute delle penicilline resistenti alla betalattamasi, per esempio la meticillina e l’oxacillina, stabili

in ambiente acido, per cui possono essere assunte anche per bocca. Queste qui hanno – quello lì

è il radicale (*) molto voluminoso, così che le betalattamasi non lo possano attaccare.

Poi si sono ottenute delle aminopenicilline, come l’ampicillina.

(*) Hanno questo gruppo amminico NH2, che permette alle amminopenicilline di passare anche

attraverso la membrana parietale esterna del Gram-, per cui sono attivi anche su questi batteri. E

poi sono resistenti alle betalattamasi.

La carbenicillina invece è stata messa a punto per essere attiva per un microrganismo battere, lo

Pseudomonas Aeruginosa, che è resistente a quasi tutti gli antibiotici.

Le cefalosporine e le cefamicine che sono correlate alle cefalosporine, vengono prodotte dal

Cefalosporium Acremonium, sono state scoperte intorno al 1945 da un italiano, Giuseppe Brozzu,

che era un medico che lavorava all’istituto di igiene di Cagliari, anche in questo caso attraverso

un’osservazione epidemiologica. Scarichi fognari nel golfo di Cagliari, e chi ci faceva il bagno

difficilmente si ammalava, cosa che succedeva a chi faceva il bagno nel golfo di Napoli. Cominciò

a studiare cosa c’era nell’acqua del golfo di Napoli e vi coltivò dei microrganismi. Vide che il

Cefalosporium Acremonium produceva sostanze che inibiva la crescita delle salmonelle e altri

batteri. Andò avanti, fece sperimentazioni in vivo, estratti di coltura di C.A. e li utilizzò per curare un

paziente molto ammalato di tifo e ottenne ottimi risultati, li pubblicò e chiese finanziamenti che non

gli vennero concessi (eccetera).

Nucleo fondamentale delle cefalosporine è l’acido 7-amino-cefalosporanico, diversamente dalle

cefamicine che al carbonio in posizione 7 hanno un radicale metossile, (*) il gruppo CH3O. Le

cefamicine non sono prodotte da funghi ma da batteri Streptomices. Anche le cefalosporine

possono essere variamente modificate, e sono state modificate variamente, in modo da ottenere

delle cefalosporine che avessero uno spettro d’azione maggiore, quindi attive sia sui Gram+ che

sui Gram-, e fossero resistenti alle betalattamasi. Siamo arrivati alla quarta generazione di

cefalosporine che hanno un ampio spettro d’azione, e sono resistenti alle betalattamasi.

Altri antibiotici betalattamici diversi dalle penicilline e dalle cefalosporine, sono caratterizzati

dall’avere sempre l’anello betalattamico, però sono condensati con altri anelli diversi rispetto a

cefalosporine e penicilline, per esempio il Carbapenem, un antibiotico molto utilizzato quando la

terapia con gli altri antibiotici betalattamici fallisce. Oppure possono non essere stati condensati

con nessun altro anello, come i monobattamici che hanno soltanto l’anello betalattamico e basta.

Hanno lo stesso spettro d’azione degli altri antibiotici betalattamici, e sono anch’essi sensibili alle

betalattamasi. Queste sono degli enzimi prodotti dai batteri capaci di inattivare gli antibiotici

betalattamici. La parte attiva dell’antibiotico betalattamico è anello betalattamico. Le betalattamasi

vanno a rompere il legame tra il carbonio del lattone e l’azoto, aprono l’anello e trasformano l’acido

7-amino-penicillanico in acido penicilloico che è inattivo. Ci sono delle betalattamasi generiche che

agiscono su tutti gli antibiotici betalattamici, e ci sono invece delle betalattamasi più specifiche,

penicillinasi o cefalosporinasi, o carbapenemasi, che sono state identificate molto recentemente,

che sono più specifiche per questi antibiotici.

Sono stati anche individuati degli antibiotici come l’acido clavulanico, prodotto dallo

Streptomyces Clavuligerus, e il sulbactam che invece deriva dalla penicillina per modificazione

chimica, un solfone dell’acido penicillanico, che hanno una certa attività antibatterica molto

modesta, ma hanno la capacità di legarsi alle betalattamasi formando un legame irreversibile. Le

betalattamasi hanno un’affinità molto elevata per queste due molecole, per l’acido clavulanico e

sulbactam, molto più elevata rispetto agli altri antibiotici betalattamici, per cui queste molecole non

sono sfruttate per la loro capacità di uccidere i microrganismi, ma per questo fatto. Somministrate

insieme ad un altro antibiotico betalattamico, le betalattamasi hanno una maggiore affinità per

queste molecole, le legano, e l’antibiotico betalattamico più attivo che viene somministrato insieme

a questo è disturbato nella sua azione, e per questo si chiamano inibitori suicidi. Non fanno

nessuna azione antibatterica, vanno soltanto a bloccare il sito attivo delle betalattamasi.

Augmentin = formato da acido clavulanico più amoxicillina, che è un’aminopenicillina, una di quelle

ad ampio spettro, con il gruppo amminico che passa anche attraverso la membrana parietale

esterna del Gram-. Ce n’è un altro meno prescritto, l’Unasyn, formato da sulbactan più ampicillina,

altra aminopenicillina.

L’acido clavulanico lega le betalattamasi, e l’amoxicillina può svolgere la sua funzione.

Gruppo degli antibiotici che inibiscono la sintesi del DNA, i chinoloni. Agiscono sulle

topoisomerasi. Gli enzimi che inducono i cambiamenti spaziali del DNA o conformazionali del

DNA, in particolare la DNA girasi, sono il primo bersaglio dei chinoloni nei Gram-. La DNA girasi

induce un rilassamento del DNA durante la replicazione, e dopo la replicazione determina la

superspiralizzazione negativa del DNA. E’ un enzima che per funzionare ha bisogno dell’ATP ed è

formata da due subunità, una A doppia che ha la funzione enzimatica dove c’è il sito attivo

dell’enzima, e una B doppia che invece gli fornisce l’energia, l’ATP. Il chinolone si lega nel sito

attivo della DNA girasi e ne impedisce l’attività. Il chinolone è un antibatterico di sintesi, non è un

antibiotico propriamente detto, non è di origine naturale, è un prodotto che viene ottenuto

attraverso reazioni chimiche.

C’è un altro antibiotico, la novobiocina, che si lega alla subunità B della DNA girasi ed ha lo

stesso effetto dei chinoloni. Questo è un vero e proprio antibiotico prodotto dagli Streptomices,

dagli actinomiceti.

Ci sono dei derivati dei chinoloni che sono attivi anche sui Gram+ e sono i fluorochinoloni in

particolare, che invece vanno ad agire sulla topoisomerasi 4, che funziona anche senza ATP, ed ha

la funzione di dividere le molecole di DNA batterico quando si è replicato.

I chinoloni quindi sono di sintesi, il primo è l’acido nalidixico e derivano da farmaci che venivano

utilizzati per la terapia della malaria. L’acido nalidixico attualmente viene utilizzato poco in terapia,

di solito nelle infezioni del tratto urinario, perché viene escreto rapidamente dalle vie urinarie. Più

recentemente sono stati sintetizzati dei chinoloni che possono essere utilizzati anche per infezioni

sistemiche, però la maggior parte dei chinoloni che si utilizzano attualmente sono i fluorochinoloni,

che derivano dai chinoloni per sostituzione del carbonio in posizione 6 con un atomo di fluoro. Ce

ne sono una serie che vengono utilizzati frequentemente in terapia perché sono farmaci ad ampio

spettro, e sono attivi anche sui micobatteri, però si conoscono delle resistenze anche contro i

fluorochinoloni.

Poi ci sono gli antibiotici inibitori della sintesi dell’RNA.

Rifampina, rifampicina… sono derivati della rifamicina, si legano alla subunità beta della RNA

polimerasi DNA dipendente batterica che è diversa da quella della cellula eucariotica, per cui è un

po’ un bersaglio selettivo. Legandosi alla RNA polimerasi impediscono la trascrizione del DNA in

mRNA e quindi la sintesi proteica viene bloccata. Sono attivi sia su Gram+ che Gram- e sono usati

soprattutto per il trattamento delle infezioni da Mycobacterium tubercolosis. Siccome si possono

sviluppare rapidamente delle resistenze verso la rifamicina o rifampicina, vengono utilizzati in

associazione con altri farmaci contro il Mycobacterium tubercolosis. Sono degli antibiotici, perché

sono prodotti da un altro actinomicete, la Nocardia Mediterranea, e sono stati scoperti verso la fine

degli anni ’60.

Poi ci sono gli inibitori della sintesi proteica. Derivano la loro selettività dal fatto che i ribosomi della

cellula batterica sono diversi da quelli della cellula eucariotica. Alcuni di questi antibiotici inibitori

della sintesi proteica si legano alla subunità 30s, altri alla 50s, inibiscono la sintesi proteica e sono

batteriostatici.

Questo (*) è lo schema della sintesi proteica con sullo sfondo il ribosoma, e poi l’RNA messaggero.

Il cloramfenicolo si lega alla subunità 50s e va a bloccare la peptidiltransferasi, per cui inibisce il

legame peptidico. Il cloramfenicolo è un antibiotico utilizzato attualmente solo in ospedale, non è

più commercializzato, perché si è rivelato molto tossico. Inibisce soprattutto l’emopoiesi e quindi

viene utilizzato solo in ospedale per quei batteri che sono resistenti alla maggior parte degli altri

antibiotici. Anche i macrolidi si legano alla subunità 50s.

L’eritromicina si lega alla 50s, e inibiscono la traslocazione della catena peptidica dal sito A al sito

B. In pratica impediscono lo scorrimento dei ribosomi lungo il messaggero. Dal punto di vista

chimico i macrolidi si chiamano così perché hanno un anello lattonico, come la penicillina, ma

molto più grande, macrocitico, che è formato da diversi atomi, diversi termini, 14, 15, 16 termini

diversi. Sono attivi soprattutto sui Gram+ e sulle Brucelle.

Poi ci sono le tetracicline, che si legano alla subunità 30s del ribosoma. Sono prodotte da

streptomiceti e bloccano la sintesi proteica in una fase molto iniziale, bloccano la formazione del

polisoma all’inizio, e impediscono l’attacco dell’aminoacil-transfer-RNA al sito accettore A. Hanno

un ampio spettro di attività, sia Gram+ che Gram-.

Gruppo degli aminoglicosidi, sono tanti.

Streptomicina, gentamicina, neomicina, che non si sa ancora per bene come agiscono, però

sembra che determinino una variazione conformazionale tale che non venga letto bene il

messaggero, l’RNA messaggero. Hanno un ampio spettro di azione, però gli streptococchi sono

resistenti agli aminoglicosidi.

Poi ci sono gli antimetaboliti, i principali dei quali sono i sulfamidici e trimetoprim. Questi

agiscono sulla via biosintetica dell’acido folico.

I mammiferi non hanno questa via biosintetica, assumono l’acido folico con la dieta (folico da

foglia), mentre diversi batteri, quasi tutti, hanno questa via biosintetica per l’acido folico. I

sulfamidici sono antimetaboliti, hanno un’affinità maggiore per un enzima di questa catena

metabolica, la diidropteroato sintetasi, rispetto al substrato naturale, che è l’acido

paraminobenzoico, quindi interrompono la catena, la via biosintetica per l’acido tetra-idrofolico.

Invece il Trimetoprim inibisce la diidrofolato reduttasi, e quindi impedisce la formazione dell’acido

tetraidrofolico a partire dall’acido diidrofolico. Questi non sono antibiotici, sono dei chemioterapici,

prodotti di sintesi.

Il primo chemioterapico che fu utilizzato in terapia era proprio un precursore di un sulfamidico, il

Prontosil. Il Trimetoprim poi ha una caratteristica che può dare un’azione sinergica con altri

sulfamidici. Questa proprietà viene sfruttata per esempio, c’è un farmaco, il Bactrim, che viene

utilizzato per le infezioni intestinali, ed è formato dall’associazione di Trimetoprim con un

sulfamidico, il Sulfametossazolo. Sono gli antibiotici che agiscono sulla membrana parietale

esterna dei Gram-, le polimixine, e sono prodotte da Bacillus Polimixa, sono un gruppo di

antibiotici attivi solo sui Gram-, in quanto agiscono sulla loro membrana parietale esterna, ed

hanno una struttura formata da un polipeptide ciclico (*) parte in alto, seguito da un polipeptide

lineare che termina con un acido grasso, quindi agiscono in maniera analoga ai disinfettanti, hanno

una parte polare costituita dal polipeptide ciclico e da quello lineare, e una parte apolare costituita

dagli acidi grassi. In questo modo possono legarsi al lipide A del lipopolisaccaride e a altri

fosfolipidi di membrana, disorganizzare la membrana parietale esterna dei Gram- e alterare la

permeabilità della membrana fino ad avere un’azione battericida, cioè provocare la morte del

battere stesso. Siccome agiscono su una struttura già formata, la membrana parietale esterna,

hanno attività anche nei confronti dei batteri che non sono metabolicamente attivi, mentre per

esempio i sulfamidici, bisogna che la via sintetica dell’acido folico sia attiva perché ci sia attività dei

sulfamidici. Nel caso delle polimixine questo non è necessario, perché agiscono su una struttura

già presente, già formata. Però non sono molto selettivi, questo meccanismo di azione fa sì che

abbiano un’attività anche sulla membrana delle cellule eucariotiche per cui sono abbastanza

tossiche, e vengono utilizzate specialmente per uso topico, cioè in creme lozioni o spray, per

lesioni sulle mucose o sulla cute. Vengono usate per infezioni sistemiche da batteri Gram- solo

quando la terapia con gli altri antibiotici fallisce.

(*) Schema riassuntivo sui principali antibiotici e modalità d’azione.

Farmaci antibatterici possono essere usati anche in associazione di due o più, allo scopo di

trattare le infezioni miste quando i batteri non rispondono allo stesso modo ai vari antibiotici,

oppure per prevenire l’insorgenza di resistenze. La rifampicina si usa per trattare le infezioni da

Mycobacterium tubercolosis, ma siccome ci sono molto spesso delle resistenze, si usa in

associazione con altri antibiotici. Sembra però che l’associazione di due antibiotici possa anche

favorire l’insorgenza delle resistenze, per cui sono sempre da controllare. Oppure possono essere

utilizzati in associazione per trattare infezioni gravi come sepsi, delle quali ancora non si conosce

l’agente eziologico, oppure per sfruttare la sinergia. Questa viene definita come l’azione

combinata di due o più antibiotici che dà degli effetti superiori rispetto alla somma dell’attività dei

singoli antibiotici. Due antibiotici in combinazione hanno un effetto maggiore rispetto all’effetto che

avrebbero presi singolarmente. Però ci può essere anche l’antagonismo tra gli antibiotici, e questo

si ha quando uno di questi antibiotici, in genere il meno attivo, interferisce con gli effetti degli altri.

Di combinazioni per sfruttare la sinergia ne abbiamo parlato: augmentin, bimixin, che sono molto

utilizzati.

Problema che sta acquistando sempre maggiore rilevanza, la antibiotico resistenza.

Un battere si dice resistente ad un farmaco quando si può moltiplicare ad una concentrazione che

normalmente inibisce i ceppi appartenenti a quella specie, oppure se non si sa qual è questa

concentrazione – perché per tanti antibiotici non si conosce qual è la concentrazione capace di

uccidere un determinato microrganismo – allora si dice che un battere è resistente quando non

viene inibito dalla massima concentrazione di antibiotico che si può raggiungere in terapia.

Come può essere la resistenza? Naturale o acquisita. La naturale deriva dalle caratteristiche

stesse del battere, ad esempio l’assenza del bersaglio.

Ci sono batteri privi di parete i micoplasmi. Sono insensibili a tutti quegli antibiotici che

agiscono sulla parete. La resistenza naturale è presente in tutti i tipi di una determinata specie, e

una volta conosciuta la specie è conosciuta anche la resistenza, per cui da un punto di vista clinico

non è molto importante. Se quella specie è resistente a quel determinato antibiotico non

somministrerò quell’antibiotico. Molto più importante sono le resistenze acquisite. Possono essere

acquisite per mutazione o per acquisizione di nuovi geni, con una di quelle modalità già viste in

precedenza. In genere l’acquisizione di nuovi geni può avvenire con tre meccanismi, coniugazione,

traduzione e trasformazione. Il trasferimento dei geni che codificano per la resistenza, di solito

avviene per coniugazione, o attraverso i trasposoni, meno per trasduzione o trasformazione.

La resistenza acquisita in genere si verifica in un solo ceppo. Questa singola cellula che

acquisisce la resistenza dipende dall’ambiente in cui si trova. Se si trova in un ambiente in cui è

presente l’antibiotico verso il quale ha acquisito la resistenza, l’antibiotico stesso esercita una

pressione selettiva, ammazza tutti i batteri sensibili e rimane la cellula che ha la resistenza che si

moltiplica finchè tutta la popolazione presente sarà una popolazione che porta la resistenza a quel

determinato antibiotico. Esempi di resistenza naturale: la parete dei Gram- ha una struttura diversa

rispetto a quella dei Gram+, più complicata, con la membrana parietale esterna, quindi

probabilmente ha una permeabilità diversa rispetto a varie sostanze, tra le quali anche gli

antibiotici, per cui diversi batteri Gram- sono insensibili alla penicillina G, ai glicopeptidi, ai

macrolidi.

Poi ci sono altri batteri che sono insensibili agli aminoglicosidi, che inibiscono la sintesi proteica

legandosi alla subunità 30s del ribosoma. Perché avvenga questo legame bisogna sia presente

ossigeno, quindi questi antibiotici sono inattivi sugli anaerobi. Lo stesso sono inattivi anche sugli

streptococchi, microaerofili, quindi anche in questo caso l’ossigeno non è disponibile perché

avvenga questo legame. I sulfamidici sono inattivi su tutti quei batteri che non hanno la via

metabolica per la sintesi dell’acido folico, come gli enterococchi e i lattobacilli.

Abbiamo detto che la resistenza acquisita può essere dovuta a mutazioni o all’acquisizione di geni

mediante lo scambio di materiale genomico. La resistenza dovuta a mutazioni è una resistenza di

tipo cromosomico, viene selezionata dalla presenza dell’antibiotico nell’ambiente, e si trasmette

solo per via verticale. La cellula che si riproduce genera tutte cellule che hanno quel gene di

resistenza a quell’antibiotico. La resistenza extracromosomica, che principalmente risiede sui

plasmidi o sui trasposoni, può essere trasmessa da una cellula all’altra mediante soprattutto la

coniugazione, e quindi anche per via orizzontale, da una cellula all’altra anche di specie diversa.

Le resistenze di Gram- si diffondono da una specie all’altra, E.Coli, Klebsiella pneumoniae

eccetera, Pseudomonias aeruginosa, si possono trasmettere il plasmide della resistenza l’uno con

l’altro attraverso la coniugazione, succede meno per i trasposoni. Quindi trasmissione di tipo

orizzontale ma anche verticale. Una volta che la presenza dell’antibiotico ha selezionato il ceppo

resistente, queste cellule si moltiplicano e la resistenza all’antibiotico viene passata anche alle

figlie, perché ricordare che i plasmidi si duplicano insieme al cromosoma batterico, e si

trasmettono anche alle cellule figlie. Quindi resistenza cromosomica = trasmissione solo verticale.

Resistenza plasmidica extracromosomica = trasmissione orizzontale e verticale.

La mutazione è un evento del tutto casuale, che avviene per errori di appaiamento delle basi ogni

10 alla 6/9 eventi di replicazione della cellula, quindi molto raro, e non è detto che sia favorevole.

Se il battere con la mutazione acquisisce la resistenza all’antibiotico, può anche non succedere

niente, se però quel battere si trova in un ambiente in cui è presente l’antibiotico, l’antibiotico

ucciderà tutti i batteri sensibili, e rimarrà l’unico resistente, che moltiplicandosi darà origine ad una

popolazione tutta resistente. Quindi vuol dire che è la presenza dell’antibiotico che seleziona i

ceppi resistenti. E dove sono presenti gli antibiotici? In ospedale circolano ceppi resistenti o

multiresistenti, molto più che nella comunità normale.

Questo è il sistema di acquisizione di resistenza più importante, rappresenta il 90% di tutte le

resistenze. Mentre quelle per mutazione, quindi cromosomiche, sono molto più rare.

L’altra cosa da dire è che possono essere acquisite anche resistenze multiple, non solo verso un

antibiotico ma anche verso più antibiotici.

Come fanno i batteri a resistere all’azione degli antibiotici?

Per funzionare un antibiotico deve penetrare all’interno della cellula, deve raggiungere una

concentrazione tale da poter essere attivo, e poi deve andare ad interagire con una struttura, una

via metabolica che è indispensabile per la vita del battere. I batteri hanno sviluppato dei

meccanismi di resistenza che agiscono su una o più di queste caratteristiche che sono

indispensabili all’antibiotico per svolgere la sua attività. Quindi ci saranno quei batteri che resistono

all’azione dell’antibiotico perché modificano la permeabilità della cellula batterica, quindi

l’antibiotico non può più entrare all’interno della cellula. Oppure producono enzimi che inattivano

direttamente l’antibiotico = la betalattamasi per esempio. Oppure modificano la struttura del

bersaglio, per esempio possono modificare le PBP, oppure la DNA girasi, o possono modificare la

via metabolica sulla quale agisce l’antibiotico, oppure cercare una via metabolica diversa.

Modificazione della permeabilità della cellula.

Come fa l’antibiotico ad entrare nella cellula?

Attraverso le porine per esempio. Il battere può modificare queste proteine che formano i pori, in

modo che le dimensioni o le cariche elettriche siano tali che l’antibiotico non può più entrare

all’interno della cellula (*) in alto. E’ il caso della resistenza della Pseudomonas Aeruginosa a

imipenem. Oppure altri (*) in basso, entrano nella cellula con un meccanismo di trasporto mediato

da proteine. Una modificazione di queste proteine che non hanno più la stessa affinità per

l’antibiotico, e fa sì che l’antibiotico non entri più all’interno della cellula. (*) in basso.

Attivazione delle pompe a efflusso. Meccanismo di resistenza di tipo cromosomico. Queste pompe

sono dei sistemi che fanno si che una volta che l’antibiotico è entrato all’interno del battere, viene

pompato fuori, in modo che all’interno del battere non si raggiunge mai una concentrazione di

antibiotico attiva. Questi meccanismi di resistenza si trovano soprattutto contro eritromicina,

tetraciclina, e diversi microrganismi come lo Staphylococcus Aureus tra i Gram+, la Pseudomonas

Aeruginosa tra i Gram-. Le pompe ad efflusso a volte sono specifici per un solo antibiotico, ma il

più delle volte sono aspecifiche, per cui forniscono una resistenza a diversi antibiotici. La

produzione di enzimi, che possono essere extracellulari, come nella maggior parte dei batteri

Gram+, oppure riversati nello spazio periplasmatico, come succede nella maggior parte dei Gram-.

Enzimi di vario tipo, come le betalattamasi, oppure enzimi che provocano la fosforilazione,

l’acetilazione di aminoglicosidi o del cloramfenicolo. Queste molecole di antibiotico con inseriti

questi gruppi chimici non sono più funzionanti. Invece nei confronti dei macrolidi possono essere

prodotti degli enzimi che rompono l’anello macrolattonico dei macrolidi, e li rendono inefficaci,

come l’eritromicina esterasi.

L’altro metodo è la modificazione del bersaglio, per esempio la resistenza alla vancomicina la

vancomicina agisce legandosi al dimero D-Alanina D-Alanina, e lo rende indisponibile per le

transpeptidasi. Alcuni batteri hanno una mutazione cromosomica, che fa sì che invece del dimero

D-Alanina D-alanina ci sia come ultima molecola un dilattato, e questo fa sì che la vancomicina

non si possa legare, e quindi non esplica la sua azione.

Sono gli stafilococchi resistenti alla vancomicina, VRS o VSA, vancomicina resistente

Staphylococcus Aureus, e rappresentano un notevole problema nel trattamento delle infezioni da

stafilococco, perché la vancomicina finchè non sono comparsi questi microrganismi resistenti,

rappresentava il farmaco al quale attingere dopo che il trattamento con gli antibiotici betalattamci

era fallito. Attualmente stanno cominciando a comparire questi ceppi resistenti alla vancomicina.

Ci sono altri antibiotici che possono essere inattivati dalla modificazione del bersaglio, come

l’eritromicina per modificazione del ribosoma, o la penicillina per modificazione delle PBP, o anche

i sulfamidici perché viene modificato l’enzima diidropteroato sintetasi, viene modificato in modo

che acquisti una maggiore affinità per il substrato (non) naturale, l’acido paraminobenzoico,

rispetto al sulfamidico, per cui la sintesi biosintetica dell’acido tetraidrofolico non viene più

interrotta. I meccanismi di resistenza possono essere anche multipli all’interno della cellula

batterica, come per esempio negli antibiotici betalattamici. Nei Gram+ l’antibiotico betalattamico

entra bene all’interno della cellula, una volta dentro possono essere modificate le PBP, oppure il

Gram+ può produrre delle betalattamasi che inattivano l’antibiotico betalattamico. Nei Gram-

l’ingresso all’interno della cellula attraverso la membrana parietale esterna può essere ostacolato,

ma una volta che l’antibiotico betalattamico è penetrato all’interno della cellula, i batteri possono

produrre delle betalattamasi e delle PBP modificate che fanno sì che l’antibiotico betalattamico non

sia più attivo. Lo stesso anche la resistenza degli stafilococchi nei confronti di antibiotici macrolidi è

di tipo multifattoriale. La resistenza sembra esser determinata da tre diversi meccanismi:

l’antibiotico entra all’interno della cellula ma vengono affidate delle pompe ad efflusso per cui non

si raggiunge mai la quantità necessaria di antibiotico per svolgere la sua funzione all’interno della

cellula. Oppure viene modificata la permeabilità della membrana, oppure viene modificato il

bersaglio, viene modificato il sito del ribosoma al quale si attacca l’antibiotico, l’eritromicina.

Oppure il battere produce un enzima, una eritromicina esterasi, che apre l’anello macrolattonico,

così che l’antibiotico non possa più funzionare.

Quindi questi erano gli stafilococchi. Il problema delle resistenze dello Staphylococcus Aureus è un

problema che ha origini lontane. La penicillina si è cominciato ad utilizzarla in modo esteso negli

anni ’40, dopo la prima guerra mondiale, e già nel ’50 sono comparse le resistenze alla penicillina.

Negli anni ’60 è stata introdotta in terapia la meticillina, e nel ’70 sono comparsi i ceppi ad essa

resistenti. MRSA = meticillina resistente Staphylococcus aureus. Negli anni ’70 fu introdotta la

vancomicina, e verso la fine degli anni ’90 comparvero i ceppi VRSA, vancomicina resistente

Staphylococcus aureus.

Anche VISA = sensibilità ridotta, intermedia. Le resistenze continuano a comparire, non solo per lo

S.Aureus, ma anche per molti Gram-. Sono comprasi enterococchi resistenti ad essa,

enterobatteriacee Gram-, resistenti ai carbapenemici. I carbapenemici fino a non molto tempo fa

erano quegli antibiotici utilizzati per curare le infezioni gravi non rispondenti al trattamento con gli

antibiotici betalattamici. Attualmente bisogna valutare se questi ceppi responsabili dell’infezione

siano o no produttori di carbapenemasi, quindi resistenti ai carbapenemici. Sono stati individuati

dei geni che portano l’informazione per la resistenza alle betalattamasi in molti Gram-. Il primo è

stato individuato in Inghilterra, e questo gene NDM1, ND sta per Nuova Delhi Metallo Lattamasi, è

un gene che codifica per una betalattamasi, e si chiama così perché fu individuato in un paziente

di origine svedese che era andato a fare un intervento di chirurgia plastica a Nuova Delhi. In

questi paesi le condizioni igieniche degli ospedali non sono ottimali, per cui vengono usate

quantità spropositate di antibiotici, e si è visto che la comparsa delle resistenze è direttamente

proporzionale alla quantità di antibiotici che vengono utilizzati in quel determinato ambiente, per

cui in India, in questo ospedale, probabilmente era stato selezionato questo microrganismo

resistente agli antibiotici betalattamici, a causa della pressione degli antibiotici che venivano usati

in ambito ospedaliero. Fu individuato la prima volta nel battere, la Klebsiella pneumoniae, un

enterobatteriaceo, in Inghilterra nel 2009. Dopo pochi anni questo gene ben caratterizzato, fu

trovato in altri ceppi di Gram- come E.Coli e P.Aeruginosa in diverse parti del mondo, quindi si era

espanso notevolmente.

Questo gene MCR1 è riportato in un lavoro recente, ed è un gene per la resistenza alla colistina,

un’altra classe di antibiotici che fa parte delle polimixine, attivi sui Gram- con un meccanismo di

azione completamente diverso rispetto ai betalattamici, e si conoscevano delle resistenze, però di

tipo cromosomico, dovute a mutazioni, quindi meno importanti. Questa qui è proprio una

resistenza mediata da un plasmide, e quindi a questo punto si teme che faccia come il gene

NDM1, che in poco tempo si espanse ovunque. Questo gene è stato ritrovato su ceppi di E.Coli

isolati da maiali dalla Cina. Ciò fa capire perché vengono fuori queste resistenze. In Cina si sta

cominciando ora a fare allevamenti intensivi, e quindi questi animali vengono trattati con grande

quantità di antibiotici, perché vivono vicini in ambiente stretto con pessime condizioni igieniche, per

evitare le infezioni , e questo ha fatto sì che venisse selezionato questo ceppo con un plasmide

che porta il gene di resistenza alle polimixine. Le polimixine erano un altro di quegli antibiotici, e lo

sono ancora, utilizzati a livello ospedaliero come ultima risorsa quando i betalattamici non

funzionano. Quindi dopo tutte queste resistenze, bisogna studiare il perché vengono fuori. La

resistenza è direttamente proporzionale all’utilizzo degli antibiotici, che non riguarda soltanto la

cura degli umani. Nel mondo vengono prodotti circa 200mila tonnellate di antibiotici all’anno. Negli

USA circa 23mila tonnellate, di cui la metà non usata per l’uomo, ma per promuovere la crescita di

animali a scopo preventivo, compresi pesci in coltura, perché le condizioni di allevamento sono

pessime dal punto di vista igienico e si possono trasferire facilmente le infezioni. Un’altra

percentuale su piante da frutto e altre colture vegetali. Da qui questi antibiotici possono tornare

nell’ambiente e l’uomo può venire in contatto con i microrganismi mutati, selezionati, resistenti a

livello dell’animale, perché si ciba di vegetali che sono stati annaffiati con acque contaminati dai

reflui di allevamenti per esempio. E poi c’è il problema dell’utilizzo degli antibiotici nell’uomo,

soprattutto a livello ospedaliero. Non c’è ricovero ospedaliero dove non ci sia una prescrizione di

antibiotici. Anche se uno si rompe un piede. In questi paesi emergenti come India e Brasile, si fa

un uso ancora più massiccio di antibiotici per le condizioni igieniche non ottimali. In agricoltura e

allevamento in Europa, l’uso di antibiotici è diminuito negli ultimi anni, perché è stato

regolamentato. Quindi perché diminuiscano le resistenze bisogna agire sull’utilizzo degli antibiotici,

e per fare ciò devono essere prese in considerazione delle strategie comuni che devono

coinvolgere i medici, i governi, i ricercatori e anche i comuni cittadini che sono i consumatori. I

medici devono prescriverli solo se necessario, non per influenza che è virale. Non prescrivere

antibiotici a largo spettro ma mirati verso un certo microrganismo. Posologie corrette, una dose

troppo alta o troppo bassa può favorire l’insorgenza di resistenze. Prescrivere per il tempo

necessario, se la terapia dura troppo o troppo poco può favorire resistenze. Anche l’utilizzatore

non deve stressare il medico perché lo prescriva, deve attenersi alla posologia e alla durata così

come prescritto, non interrompere quando la sintomatologia è sparita. I governi devono emanare

norme riguardo alla restrizione dell’uso degli antibiotici in agricoltura, allevamento e a livello

ospedaliero.

Ricerca di nuovi antibiotici la maggior parte sono stati scoperti negli anni ’60 e ’70, perché in

quel periodo c’era un programma di ricerca che studiava i microrganismi del suolo, funghi e batteri,

sistematicamente per vedere quali producevano antibiotici, e una volta individuata la molecola da

parte dei ricercatori le case farmaceutiche sviluppavano questi studi fino ad arrivare a fare degli

studi clinici sull’uomo per approvare poi l’antibiotico. L’interesse delle case farmaceutiche è andato

perso, per motivi economici e di legislazione. Economico = antibiotici non costano molto, vengono

usati per poco tempo dal malato, e quindi le case farmaceutiche avevano poco rientro economico.

Invece dal punto di vista della sperimentazione, per arrivare all’approvazione, le norme erano

cambiate, erano molto più rigide. Poteva essere immesso sul mercato un antibiotico solo quando

non solo si dimostrava che era attivo, ma era anche più attivo rispetto agli antibiotici già sul

mercato. Poi la sperimentazione sull’uomo doveva essere molto più ampia, quindi le case

farmaceutiche hanno perso interesse. Costava tanto e avevano rientro minimo. Si sono buttate su

farmaci che curano malattie croniche, come il diabete, perché il paziente le usa per tutta la vita.

Oppure si sono buttate sullo studio degli antivirali che costano tanto. Dal 2010, dopo la comparsa

delle resistenze, i microbiologi hanno fatto un appello, e la società americana di malattie infettive

ha lanciato una sfida: in 10 anni mettere in commercio 10 nuovi antibiotici, nuovi come molecola e

bersaglio, non siano una rivisitazione degli antibiotici degli anni ’60 e ’70.

METODI DI STUDIO DEI BATTERI

I batteri si possono osservare al microscopio, si possono coltivare, e si possono studiare con

metodi di biologia molecolare. Si studiano per sapere come sono fatti, la loro morfologia, la loro

fisiologia, quindi per scopi di ricerca di base, oppure per scopi diagnostici o epidemiologici, cioè

studiare la distribuzione e la frequenza della malattie nella popolazione. Per fare questo i batteri

vanno identificati, cioè bisogna assegnare ad un determinato battere una certa specie, questo vuol

dire identificare.

Per certi scopi non basta identificare, cioè dire di che specie è un determinato battere, ma bisogna

fare anche una tipizzazione intraspecifica, che consiste nell’individuare le differenze che ci sono

tra i batteri appartenenti alla stessa specie.

Lo scopo può essere epidemiologico, ad esempio identificare la fonte di un’infezione, oppure ci

permette di individuare dei determinati tipi che sono associati ad una determinata virulenza per

esempio, oppure particolari tipi che portano i geni per la resistenza agli antibiotici, quelli visti

precedentemente.

Osservazione microscopica. In genere per studiare i batteri si utilizza il microscopio ottico, mentre

per certi scopi più particolari si usa l’elettronico. L’ottico (*) ha una struttura che porta in alto

l’oculare. Quelli usati attualmente sono bioculari. Nell’oculare c’è un sistema di lenti. Poi c’è un

attacco a revolver dove sono posizionati gli obiettivi. In quelli moderni ci sono più obbiettivi che

permettono ingrandimenti differenti, e negli obbiettivi sono situate le lenti. Gli ingrandimenti in

genere vanno da 10 a 100x. Sotto c’è un piano sul quale si appoggia il preparato da osservare. La

base contiene una sorgente luminosa, una lampadina di solito, e c’è un condensatore tra il piano

con il preparato e la sorgente luminosa, che focalizza sul vetrino un fascio di luce. Sulla base ci

sono anche delle manopole che servono per la messa a fuoco, allontanando e avvicinando il piano

su cui si trova il preparato rispetto all’obiettivo. Il potere di risoluzione del microscopio ottico 0,2

micrometri. I batteri hanno una dimensione che può essere anche di 0,5 micrometri o più piccoli. I

micoplasmi sono 0,2 micrometri. I preparati per l’osservazione microbiologica possono essere di

due tipi: si possono fare dei preparati a fresco, oppure fissati e colorati.

I preparati a fresco = utilizzo il vetrino più grande portaoggetto, il più piccolo, formato da un vetro

sottilissimo, serve per coprire l’oggetto. Per fare un preparato a fresco posso mettere direttamente

una coltura microbiologica in terreno liquido sul vetrino portaoggetto, coprirlo con il coprioggetto e

guardarlo al microscopio. Oppure posso mettere un colorante che faccia da sfondo, come

l’inchiostro di china (per vedere la capsula, perché forma uno sfondo scuro, la capsula è di

materiale amorfo polisaccaridico che non prende il colore, per cui risulta come un alone chiaro

intorno al corpo del battere, mentre lo sfondo risulta tutto scuro). Oppure altre sostanze coloranti

che fanno sempre da sfondo come per esempio il blu. Non è molto usata per i batteri

l’osservazione a fresco, ma si usa per cellule più grandi, per i funghi, lieviti, protozoi. Per i batteri si

usa o per mettere in evidenza la capsula, o anche per valutare il movimento dei batteri. Si fa un

preparato un po’ diverso, si chiama goccio-pendente e si osservano proprio i batteri che si

muovono nel liquido. Oppure si può utilizzare con un particolare vetrino per contare i batteri.

Di solito invece preparati per l’osservazione dei batteri sono fissati e colorati.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea specialistica in farmacia
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Letizia26 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia medica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Pini Gabriella.

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