Batteriologia

Storia della batteriologia

Il primo ad osservare i batteri fu Anton von Leeuwenhoek nel 1683. Nel 1876 Pasteur e Koch propongono la teoria dei "germi batterici" per malattie degli animali e descrivono la procedura nota come postulati di Koch. I postulati di Koch non sempre possono essere applicati, infatti uno dei prerequisiti è portare in coltura il microrganismo, cioè isolarlo, e quindi non è applicabile per microrganismi che non possono essere coltivati su substrati artificiali. In questo caso, le tecniche utilizzate sono di geostatistica, cioè attraverso statistiche relative alla presenza di un patogeno e un sintomo in un determinato territorio.

Contributi alla fitopatologia

T.J. Burrill può essere considerato uno dei padri della fitopatologia. È il primo a dimostrare che il colpo di fuoco del melo e del pero è causato da cellule (inizialmente pensavano che fossero cellule libere vegetali) successivamente classificate come cellule batteriche da E. Smith come Erwinia amylovora. Negli anni avvenire, altre ricerche portarono alla descrizione della malattia di Pierce della vite e phony peach disease su pesco.

Erwin Smith, padre della fitobatteriologia, dimostra definitivamente che i batteri sono agenti causali di malattie (avvizzimento batterico di cucurbitacee e tumori batterici). Ancora si scoprì che Agrobacterium causa una modificazione genetica permanente che fa diventare le cellule vegetali, cellule tumorali, introducendovi il materiale genetico. Mettendo a contatto un A. Tumefaciens con funghi si possono modificare anche quest'ultimi. A. Radiobacter è un antagonista del tumefaciens occupando la stessa nicchia ecologica.

Scoperte e sviluppi

Viene coniato il termine plasmide, cioè un tratto di genoma, spesso circolare, che contiene informazioni importantissime che vengono scambiate tra batteri. Waksman vince il premio Nobel per la scoperta della streptomicina. I fitoplasmi vivono solo nel floema, più precisamente nelle cellule compagne del floema, e non hanno parete cellulare.

Il batterio isolato della malattia di Pierce prende il nome di Xylella fastidiosa. Più che un batterio, è un fitoplasma. Ad oggi nessuno è riuscito a portare in coltura artificiale un fitoplasma. Da quando è stato caratterizzato si sono aggiunte molte cose sul batterio, per esempio la gamma di vettori (cicaline, ecc.) all'interno dei quali sviluppa relazioni molto interessanti.

Batteri associati alle piante

I batteri associati alle piante possono essere dannosi o benefici.

• Epifiti presenti sulla superficie delle piante
• Endofiti vivono nelle piante
• Fitopatogeni causano malattie infettive

Quelli epifiti possono presentare variazioni delle popolazioni in base al decorso climatico; ovviamente, se è una caducifoglia, ne restano solo alcuni su tronco e branche e riprendono a crescere con la ripresa vegetativa. Di solito il picco precede giugno quando le temperature cominciano a diventare proibitive. Ciò non significa che non possano essere patogenetici: per esempio, la rogna dell'olivo è presente in abbondanza ma se si verifica una piccola ferita si sviluppa la sintomatologia.

Non sempre una malattia è causata da un solo agente eziologico: possono essere anche due, di cui uno crea le condizioni (batteri helper) e l'altro svolge l'attività fitopatologica, oppure un mix che potenzia la patogenicità. La presenza degli epifiti è fondamentale per la protezione biologica delle colture. Gli epifiti colonizzano il filloplano, superficie verde della pianta all'interno della fillosfera, volume all'interno della quale si sviluppano anche sostanze volatili (interazione tridimensionale). Il rizoplano e la rizosfera riguardano invece la radice. Vedremo che i batteri agiscono sia nella fillosfera che nella rizosfera.

Un endofita invece è un organismo che vive all'interno dei tessuti vegetali ma non causa alcuna modificazione. Consiste in una cellula o in un gruppo di cellule (max 10), ma non crea una colonia altrimenti interagirebbe con la pianta esplicando fitopatogenicità. Probabilmente la presenza di batteri endofiti aumenta la resistenza a fattori avversi di tipo biotico e abiotico.

Finché endofiti o epifiti restano in poche cellule, non esplicano patogenicità, ma se invece sviluppano una colonia superiore a 10 ufc/ml probabilmente causeranno attività fitopatologia. Queste condizioni sono necessarie ad un isolato batterico per funzionare come agente di malattia o come agente di biocontrollo.

Caratteri generali dei batteri fitopatogeni

I batteri presentano una elevata variazione di forma e dimensione. Eulopiscium fishelsonii arriva a 0,5/0,6 mm quindi molto grande rispetto ai nanobatteri che hanno un decimo delle dimensioni di un batterio medio. La maggior parte dei batteri fitopatogeni sono gram negativi, ciò significa che non formano endospore di resistenza sviluppate invece dai gram positivi. Sono fitopatogeni anche gruppi di batteri come i Bacillus che sono gram positivi, i quali comprendono alcuni agenti di biocontrollo. Per far sopravvivere i gram negativi nel tempo e nello spazio si creano formulati che vanno riattivati a differenza dei gram positivi che hanno forme di resistenza.

La massa dei batteri è importante per il concetto della biomassa. È possibile stimare l'inoculo in base ai propaguli presenti (per esempio sclerozi di agrobacterium nel terreno, ma anche conidi captaspore, ecc.). Nel caso dei batteri gram negativi invece è difficile fare ciò, non essendoci strutture di resistenza, però possiamo stimare la biomassa in base al contenuto di acido nucleico. Nel caso dei funghi, invece, la biomassa è difficile da stimare seguendo questo metodo perché non c'è relazione tra acido nucleico e ife, infatti possiamo avere condizioni di aploidia, diploidia, ecc. Quindi, la stima dell'acido nucleico dei funghi non ci dà indicazioni sulla quantità di inoculo.

Nel caso delle cellule batteriche invece abbiamo per ogni cellula una certa quantità di DNA, di conseguenza si può stimare in modo preciso il numero di cellule batteriche presenti in un determinato volume sulla base dell'acido nucleico attraverso la PCR. Come si misura l'acido nucleico? In peso su un certo volume (nanogrammi o microgrammi/microlitri). In genere il peso secco di un cellula batterica corrisponde circa al 20% del peso umido quindi circa 0,2 picogrammi.

Prendiamo una sospensione di cellule la quale viene esaminata su un substrato per avere un'idea della concentrazione. Quindi per esempio nel volume di 100 ml determiniamo quante sono le cellule totali. Poi queste vengono disidratate, si estrae l'acido nucleico e lo quantifico. Così avremo una quantità di acido nucleico su un certo volume di partenza. La parte importante sta nel definire la procedura di estrazione. Quindi attraverso la PCR e la quantificazione dell'acido nucleico avremo una stima abbastanza precisa per quantità dell'ordine di 10¹⁵ grammi. Questo ci interessa perché i batteri devono raggiungere una certa concentrazione per avere attività patogenetica.

Pre nucleo e procarioti

Pre nucleo: tendenza ad ammassarsi del materiale genetico nei procarioti. Tra i procarioti abbiamo gli Archea e i Bacteria. Il peptidoglicano è specifico dei batteri (non è presente negli Archea). Lipidi sono ramificati in Archea e dritti nei batteri. Il citoscheletro degli eucarioti è formato da actina e beta-tubulina. Il citoscheletro è sempre stato prerogativa dei procarioti, infatti il loro citoscheletro ha come componenti delle molecole ancestrali di quelle presenti negli eucarioti. Il flagello è presente di piccole dimensioni, formato da diverse proteine, in alcuni eucarioti; nei procarioti il flagello è formato da diverse subunità proteiche. I batteri non si muovono solo attraverso il flagello ma anche attraverso altre strategie. Esso non ha una penetrazione attiva ma con soluzione di continuità delle superfici può entrare nell'ospite.

Anatomia della cellula batterica

Forma delle cellule procariotiche

• Bacillo (bastoncino)
• Cocci (sfera)
• Elicoidali
• Pleomorfismo: forma diversa in funzione delle condizioni circostanti la cellula batterica.
• Atrica: cellula senza flagello
• Peritrichi: pili distribuiti su tutta la superficie cellulare
• Lofotrichi: ciuffo di flagelli situati in un punto

Xylella Fastidiosa non ha flagello ma ha pili: elemento fondamentale per garantire una strategia di coniugazione batterica, i pili consentono di far comunicare tra loro le cellule che aiutano il movimento del gruppo di cellule.

Proteine del citoscheletro

Nei procarioti ci sono proteine simili a quelle che troviamo negli eucarioti, cioè actina e tubulina, ma nei procarioti non hanno un nome specifico, bensì facciamo riferimento al gene che codifica queste proteine ritenute ancestrali di quelle eucariotiche. La tubulina è formata da due unità monomeriche, alfa e beta tubulina. Senza queste proteine non ci sarebbe la guida dei siti nucleici ai due poli durante la divisione cellulare. Nei procarioti abbiamo:

• Proteina FtsZ (ancestrale della tubulina)
• Proteine MreB e ParM (ancestrali della actina)

La FtsZ, soprattutto nelle cellule cocciche, aiuta a mantenere la forma sferica grazie alla formazione di un anello. Gli omologhi dell’actina, invece, consentono di mantenere la forma a bastoncino grazie al loro scioglimento ad elica che conferisce un rafforzamento della struttura dall'interno. La crescentina invece è associata agli spiroplasma.

Parete cellulare

Il batterio interagisce con l'esterno producendo materiale ed emettendolo all'esterno quindi cambiando la parete cellulare cambia anche la virulenza e le interazioni. Un batterio G+ ha lo strato di glicano più spesso, il quale poggia quasi direttamente sullo strato lipidico della membrana citoplasmatica, quindi non c'è continuità, o è trascurabile, tra membrana cellulare e peptidoglicani. All'interno della membrana ci sono le proteine transmembrana che fanno da collegamento con l'esterno attraverso lo strato di glicano.

Nei G- c’è il periplasma cioè uno spazio vuoto, intercorso di gel acquoso all'interno della quale sono inviati e mantenuti i diversi componenti utilizzati dalla cellula batterica per la comunicazione con l'esterno. Hanno uno strato di peptidoglicano più sottile, meno compatto e rigido rispetto ai gram positivi, e soprattutto ci sono alcune componenti lipoproteiche che saltano questo strato; c’è una membrana esterna che mostra verso l'esterno una sfilza di lipopolisaccaridi che costituiscono un involucro gelatinoso intorno alla cellula batterica. Nella membrana esterna ci sono le acquaporine, proteine per il trasporto di acqua, che attraversano la membrana esterna e arrivano allo strato di glicano.

I sistemi di comunicazione sono necessari per far entrare materia necessaria alla cellula per sopravvivere, ma anche per esplicare la sua patogenicità (per esempio gli enzimi litici del marciume molle). In tutti i gram negativi, le comunicazioni sono numerose e complesse, e in genere fanno riferimento a sistemi di trasporto di molecole che possono richiedere o meno l’apporto di energia sottoforma di ATP. Esistono almeno 6 modalità di comunicazione: prendono il nome di sistemi di secrezione. Questo è l’aspetto fondamentale dei gram negativi, i quali devono riconoscere l'ospite (riconoscere delle componenti, molecole). Per esempio, A. tumefaciens mette in collegamento il citoplasma della sua cellula con il citoplasma della cellula ospite costruendo una proteina che attraversa tutta la parete e che faccia passare il plasmide nella cellula ospite. Molto spesso queste proteine non sono fisse, vengono costruite quando c'è necessità; infatti, diversi componenti proteiche vengono portate nel periplasma, dove subiscono la modificazione, anche conformazionale, che le rende efficaci. I meccanismi di secrezione sono importanti per capire i meccanismi di patogenesi dei batteri.

Flagello

I flagelli sono strumenti di movimento in risposta a segnali chemiotattici. La presenza di un flagello polare dà origine ad una forma di movimento che prende il nome di corsa e capriola, la quale consente di cambiare direzione. Il movimento lineare serve per spostarsi quando percepisce una differenza di gradiente relativa a nutrienti. Quando viene percepita la presenza di un gradiente, diminuiscono le capriole e aumenta il movimento lineare. Il movimento planare invece è tipico di batteri peritrichi. I batteri non dotati di flagello si muovono grazie all'interazione con le cellule adiacenti attraverso i pili, consentendo una forma di movimento più complesso (come in X. fastidiosa). Anche i pili percepiscono la presenza di nutrienti.

I batteri sistemici sono in grado di muoversi contro pressione (contro la direzione delle linfe grezze) gonfiandosi d'acqua ed espellendola, ovvero per contrazione. La presenza del flagello è tipica dei gram negativi (per esempio, Pseudomonas ha flagelli polari, P. syringae, il batterio polifago più diffuso, è biflagellato). I fitoplasmi, non avendo parete cellulare, mancano di strutture ad essa ancorate come i flagelli. La caratteristica fondamentale del flagello è la lunghezza che può arrivare a 5-10 nm. Non può essere osservato al microscopio. Il flagello è cavo all'interno. Il flagello è costituito da:

• Filamento di 20 micron, circa 10 volte il diametro della cellula
• Uncino, pezzo di transizione tra la sorgente di moto e il corpo basale
• Corpo basale che si innesta nei diversi strati della parete cellulare

Il filamento è costituito da una proteina chiamata flagellina che è auto-aggregante, attorcigliata a formare una vera e propria elica. Nei gram negativi c’è un insieme di anelli di natura proteica che si innestano nella membrana cellulare costituito da due porzioni proteiche M e S, circondata all'esterno da un’altra unità proteica, le cosiddette proteine MOT; un asse che consente di superare lo spazio periplasmico; un anello P che salda il flagello alla parete cellulare e un anello L che consente di ancorare la struttura alla membrana esterna e quindi di trapassarla. Ogni anello è costituito da proteine che consentono l'ancoraggio alle pareti mentre gli astoni servono per passare gli spazi vuoti. I filamenti di flagellina prodotti all’interno del lume cellulare attraversano l’astone cavo (ROD) e subiscono una modificazione strutturale (secondaria e terziaria) che porta alla configurazione finale e all’attacco del filamento all’estremità. Nel caso dei gram positivi, la struttura è più semplice: abbiamo solo un anello di tipo MS incastonato all'interno della membrana cellulare e un anello P nella parete.

La forza motrice del filamento viene data da un protomotore che risponde al gradiente protonico. Questo può avere rotazione oraria o antioraria. In genere abbiamo un movimento lineare con la rotazione antioraria, un movimento di tipo capriola nella rotazione oraria. La chemiotassi è la capacità del batterio di percepire zone a differente gradiente di concentrazione dei nutrienti e muoversi di conseguenza per potersi alimentare. In genere, il movimento di un batterio in una soluzione senza gradiente di concentrazione è casuale. Quando, invece, percepisce un diverso grado di concentrazione di glucosio, diminuiscono le capriole e aumenta il movimento rettilineo e quindi cerca di andare verso tale zona. Questo è stato capito attraverso un esperimento utilizzando un tubo capillare in cui viene inserito gradualmente dello zucchero per “attirare” i batteri e studiarne il moto.

Pili e fimbrie

I pili sono tubi cavi formati da pilina, strutture più lunghe rispetto alle fimbrie le quali sono deputate all’adesione alle superfici, e sono presenti in numero minore rispetto a queste. Inoltre, i pili sono presenti quasi esclusivamente sui gram negativi, a differenza delle fimbrie presenti anche sui gram positivi, e infine, i pili presentano un sito di ricezione dei batteriofagi (virus che non sono in grado di infettare batteri). I pili crescono dall'interno della cellula verso l'esterno e in genere sono individuati con un numero romano (da I a V) in base alle funzioni. È possibile la presenza contemporanea di diversi tipi di pili. Le cellule delle fimbrie, invece, non sono così specializzate. Il pilo più lungo è quello coinvolto nella coniugazione batterica. Le appendici presenti, chiamate pili, hanno la funzione di trasportare il fattore F.

Le funzioni svolte dai pili sono:

• Aggregazione delle cellule batteriche. Un fatto importante per esempio per X. Fastidiosa, la quale non richiede grandi volumi di substrato in quanto tendono ad aggregarsi e a scambiare una qualche informazione ancora sconosciuta; questo batterio riesce a moltiplicarsi anche nell'apparato boccale del vettore dove mettono in atto una crescita molto veloce quanto più sono vicine. In alcuni casi quindi l'aggregazione è essenziale per la crescita della colonia. Il fatto che un pilo consenta di stabilire contatto fisico tra matrici, consente di entrare a contatto con altre cellule e scambiare materiale genetico conferendo a tale batterio grande variabilità che spiega l’estrema polifagia; ci sono cellule più o meno propense a cedere o ricevere materiale.
• Sessuale
• Adesione, che funzionano come un sistema di