Appunti per esame Microscopia

Microscopia

Insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi e molecole microscopiche.

Ottica

Impiego della luce come sorgente di illuminazione. Limite di risoluzione: 0,2 ^μm

Elettronica

Impiego di elettroni come sorgente di illuminazione. Limite di risoluzione: 0,2 nm

Limite di risoluzione: R

R = λ / (2n sen α)

λ = lunghezza d’onda della luce
n = indice di rifrazione del mezzo tra oggetto (campione) e lente
α = semi angolo di apertura della lente obiettivo
n sen α = apertura numerica (NA)

Microscopia ottica

• Microscopio semplice
  Costituito da una sola lente:
  • Retina
  • Lente semplice (oculare)
  • Campione
  • Immagine virtuale
• Microscopio composto
  Costituito da due lenti:
  • a₂ lente (oculare)
  • Immagine intermedia
  • a₁ lente (obiettivo)
  • Campione
  • Immagine virtuale
  L'obiettivo è a corta distanza focale e l’oggetto è poco oltre al fuoco. Tra le due lenti si forma un’immagine reale ingrandita e capovolta, chiamata immagine intermedia (IR). Se l’IR cade all’interno della distanza focale dell’oculare, ottengo un’immagine secondaria, ingrandita e capovolta, detta virtuale.
• Microscopio a contrasto di fase
  Si basa sull’utilizzo di diaframmi per deviare la luce e creare un anello di fase. Consente di ottenere un’accentuazione dal basso contrasto offerto dal materiale biologico idratato convertendo le differenze di fase in differenze di intensità luminosa. Si basa sul fenomeno dell’interferenza luminosa per non usare coloranti che potrebbero modificare la morfologia del campione. Con questo microscopio si studiano cellule/tessuti viventi di spessore minore di 5 micron.
• Microscopio interferenziale di Nomarski
  Si basa sul principio del microscopio a contrasto di fase e usa la luce polarizzata (luce che vibra su un piano). La luce viene scissa attraverso il prisma di Wollaston in due raggi di poco divergenti. Un raggio colpisce un punto dell’oggetto, l’altro colpisce il punto subito vicino, compreso nella risoluzione dell’obiettivo creando una sfasatura. Vengono fatti interferire in un altro prisma ottenendo l’immagine del contrasto di fase tridimensionale. Permette lo studio di oggetti trasparenti e non colorati.
• Microscopio confocale (Minsky, 1955)
  Permette di visualizzare un solo piano alla volta bloccando il più possibile le informazioni provenienti dai piani sopra e sottostanti. Stessa struttura del microscopio tradizionale ma la sorgente di luce è un laser e ha due pinholes, uno a livello della sorgente e uno a livello dell’obiettivo. Il laser viene concentrato in questo foro confocale ed è un fascio di luce coerente e monocromatico. I pinholes sono piccole aperture in grado di illuminare solo una zona molto limitata di campione e di raccogliere luce proveniente solo da essa per poi fare una scansione. Lo specchio è uno specchio dicroico. Permette la visione di campioni in vivo utilizzando la GFP, molecola fluorescente vitale. Posso anche studiare la mobilità e le interazioni tra molecole tramite due tecniche:
  • FRAP (fluorescence recovery after photobleaching): misura la mobilità molecolare avvalendosi del photobleaching tramite un'intensa illuminazione. Il recupero di fluorescenza è registrato nel tempo.
  • FRET (fluorescence resonance energy transfer): studia le interazioni tra molecole con il quenching (= smorzamento). C'è un trasferimento di energia da una molecola fluorescente (donatrice) ad un'altra fluorescente (ricevente) vicino alla donatrice.
• Microscopio a luce polarizzata (in disuso)
  Utilizza la luce polarizzata. L'oggetto viene attraversato dalla luce che può essere un isotropo (trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni e ha indice di rifrazione uguale in tutte).