Appunti per esame Microscopia

MICROSCOPIA

Insieme delle tecniche legate all'osservazione di organismi e molecole microscopiche

Ottica

Impiego della luce come sorgente di illuminazione. Limite di risoluzione: 0,2 µm

Elettronica

Impiego di elettroni come sorgente di illuminazione. Limite di risoluzione: 0,2 nm

Limite di risoluzione: R

R = λ / (2n * senα)

λ = lunghezza d'onda della luce

n = indice di rifrazione del mezzo tra oggetto (campione) e lente

α = semi angolo di apertura della lente obiettivo

senα = apertura numerica (NA)

Microscopia ottica:

Microscopio semplice:

Costituito da una sola lente:

• Retina
• Lente semplice (oculare)
• Campione
• Immagine virtuale

Microscopio composto:

Costituito da due lenti:

• 2a lente (oculare)
• Immagine intermedia
• 1a lente (obiettivo)
• Campione
• Immagine virtuale

L'obiettivo è a corta distanza focale e l'oggetto è poco oltre al fuoco. Tra le due lenti si forma un'immagine reale.

ingrandita e capovolta, chiamata immagineintermedia (IR). Se l'IR cade all'interno della distanza focale dell'oculare, ottengo un'immagine secondaria, ingrandita e capovolta, detta virtuale.

1. Microscopio a contrasto di fase

Si basa sull'utilizzo di diaframmi per deviare la luce e creare un anello di fase. Consente di ottenere un'accentuazione dal basso contrasto offerto dal materiale biologico idratato convertendo le differenze di fase in differenze di intensità luminosa. Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa per non usare coloranti che potrebbero modificare la morfologia del campione. Con questo microscopio si studiano cellule/tessuti viventi di spessore minore di 5 micron.

2. Microscopio interferenziale di Nomarsky

Si basa sul principio del microscopio a contrasto di fase e usa la luce polarizzata (luce che vibra su 1 piano). La luce viene scissa attraverso il prisma di Wollastron in 2 raggi di poco divergenti. Un raggio

colpisce un punto dell'oggetto, l'altro colpisce il punto subito vicino, compreso nella risoluzione dell'obiettivo creando una sfasatura. Vengono fatti interferire in un altro prisma ottenendo l'immagine del contrasto di fase tridimensionale. Permette lo studio di oggetti trasparenti e non colorati.

• Microscopio confocale (Minsky, 1955)

Permette di visualizzare un solo piano alla volta bloccando il più possibile le informazioni provenienti dai piani sopra e sottostanti. Ha la stessa struttura del microscopio tradizionale, ma la sorgente di luce è un laser e ha 2 pinholes, uno a livello della sorgente e uno a livello dell'obiettivo. Il laser viene concentrato in questo foro confocale ed è un fascio di luce coerente e monocromatico. I pinholes sono piccole aperture in grado di illuminare solo una zona molto limitata di campione e di raccogliere luce proveniente solo da essa per poi fare una scansione. Lo specchio è uno specchio.

dicroico. Permette la visione di campioni in vivo utilizzando la GFP, molecola fluorescente vitale. Posso anche studiare la mobilità e le interazioni tra molecole tramite due tecniche:

1. FRAP (fluorescence recovery after photobleching): misura la mobilità molecolare avvalendosi del photobleching tramite un'intensa illuminazione. Il recupero di fluorescenza è registrato nel tempo.
2. FRET (fluorescence resonance Energy transfer): studia le interazioni tra molecole con il quenching (= smorzamento). C'è un trasferimento di energia da una molecola fluorescente (donatrice) ad un'altra fluorescente (ricevente) vicino alla donatrice.

Microscopio a luce polarizzata (in disuso): Utilizza la luce polarizzata. L'oggetto viene attraversato dalla luce che può essere unisotropo (trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni e ha indice di rifrazione uguale in tutte le direzioni) o anisotropo/bifrangente (non trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni e ha indice di rifrazione diverso in diverse direzioni).

luce con lastessa velocità in tutte le direzioni). 2• StereomicroscopioDifferente dal tradizionale microscopio.Dotati di coppie di obiettivi e oculari che lavorano simultaneamente per dare una visionerealistica del campione.Adatti ad osservare foglie, insetti, pietre, e fibre o per dissezioni e microchirurgie.Elimina l’effetto di appiattimento.• Microscopio in campo chiaroLa luce passa dal condensatore (classico) al vetrino.Non consente un buono studio di materiale materiale biologico “a fresco” perché forniscepoco contrasto.• Microscopio in campo scuroIl condensatore paraboloide deflette il fascio di luce che attraversa l’oggetto con forteobliquità proseguendo fuori dal sistema ottico in massima parte.Il campione riceve una luce soffusa difratta.La luce, non attraversando i campioni, permette di studiare i contorni del campione e non lastruttura interna. R= 0,02 µm• Microscopio a fluorescenza (Lehmann e Heimstadt,

1. Il preparato viene illuminato con luce ultravioletta ad una certa lunghezza d'onda e il preparato emette una fluorescenza, si autoillumina.
2. L'elettrone periferico di un atomo si eccita e quando torna al suo livello energetico l'energia che ha perso si trasforma in fluorescenza.
3. La fluorescenza è una proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazioni ultraviolette ed emettere radiazioni visibili.
4. Può essere naturale (GFP, RFP, BFP, YFP, CFP) o secondaria (indotta da una colorazione chiamata fluorocromizzazione con coloranti fluorescenti detti fluorocromi).
5. Il microscopio è ad epifluorescenza, cioè il preparato viene eccitato dall'alto mentre prima veniva eccitato dal basso (ipofluorescenza) e c'era un filtro di sbarramento per evitare che i raggi UV arrivassero all'occhio.
6. L'obiettivo è a fluorite (FL).
7. Vantaggi: semplice da usare e poco costoso.
8. Svantaggi: photobleaching, il campione viene danneggiato.

co-localizzazione e immagini poco nitide.

Struttura microscopio ad epifluorescenza:

1. Sorgente luminosa ad alta energia
2. Filtro di eccitazione
3. Specchio dicroico
4. Filtro di sbarramento (sbarra la luce incidente e lascia passare la luce emessa, cioè la fluorescenza)

Co-localizzazione: due fluorocromi sono vicini e uniscono i loro colori. Quando sono su piani diversi si parla di falsa co-localizzazione e consiste nel sovrapporsi di due molecole che si trovano su strati diversi. Fa interferenza con ciò che viene messo a fuoco.

Per questo si usa il microscopio confocale perché permette di capire se le molecole sono o meno sullo stesso piano.

FLUOROCROMI

• Ioduro di Propidio: DNA rosso, si lega alle basi azotate
• DAPI: DNA blu, si lega alle basi azotate
• Arancio di acridina: nucleoproteine e acidi nucleici (se del DNA, colora in verde, se dell'RNA colora in rosso)
• Fluorescina isotiocianato (FITC): anticorpi
• Tetrarodamina isotiocianato (TRITC): anticorpi

Texas red (TR): anticorpi Ficoeritrina (PE): anticorpi ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI PER LA MICROSCOPIA OTTICA Analisi di tessuti viventi: fornisce un'immagine reale e dinamica, difficilmente sfruttabile. Si fa preferibilmente con il microscopio a contrasto di fase. Le cellule sono in condizioni vitali. Analisi di tessuti uccisi: preparati fissati e ridotti in sottili fettine trasparenti e colorate. Colorazioni: vitali (non tossici, colorano selettivamente le cellule viventi. Il colorante viene iniettato nell'animale intero, INTRA VITAM) o sopravitali (si immerge un pezzetto di organo appena prelevato nel liquido colorante dove alcune cellule si colorano, EXTRA VITAM). Studio di tessuti uccisi: 1. Fissazione: impedisce le alterazioni del tessuto rendendolo stabile nel tempo, protegge il campione da danni osmotici e mantiene inalterate le caratteristiche strutturali preservandone la morfologia. Fissativi chimici: alcol etilico, ecc... Fissativi fisici: congelamento, riscaldamento, ecc... 2.

Inclusione e sezionamento: il campione viene incluso in paraffina e tagliato al microtomo con sezioni minori di 10 micrometri, preferibilmente tra 2 e 5.

Permeabilizzazione: completa la fissazione con fissativi blandi. Permeabilizza la membrana permettendo l'ingresso degli anticorpi negli organuli.

Colorazione: dirette (il campione prende colore direttamente dalla soluzione acquosa o alcolica) o indirette (viene utilizzato un mordente, sostanza utilizzata per fissare, per preparare il composto alla colorazione). Possono essere semplici (si usa solo 1 colorante) o combinate (si usano più coloranti). Possono essere naturali (estratte da animali o piante) o artificiali (prodotte in laboratorio).

Le colorazioni combinate si usano per evidenziare meglio la parte interessata. La più comune è l'ematossilina-eosina (E&E). I nuclei si colorano di blu scuro con l'ematossilina, il resto in rosa con l'eosina. Ci si va a colorare il sangue.

Metodi

5. Montaggio con antifading, collante e vetrino

Antifading: reattivo antiossidante che può essere utilizzato per evitare il decadimento della fluorescenza.

Microscopia elettronica:

Il limite di risoluzione è minore rispetto a quello del microscopio ottico perché la lunghezza d'onda (0,5nm) mi è data da un fascio di elettroni ad alta velocità.

L = 0,2nm

- Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

La sorgente luminosa è un filamento di tungsteno che, reso incandescente, libera elettroni che, sottoposti ad un campo elettrico, liberano le lunghezze d'onda. Vengono sottoposti ad una differenza di potenziale e lanciati lungo la colonna elettronottica. Nella colonna ci deve essere il vuoto (no aria) in modo che gli elettroni non

incontrino ostacoli nella distanza tra lalente condensatrice e la lente obiettivo e lo schermo. Gli elettroni attraversano il campione e da esso vengono in parte deviati, assorbiti ed emessi. Quelli trasmessi vengono concentrati dalle lenti a formare l'immagine che poi potrà essere analizzata sul monitor. Le immagini sono in bianco e nero ma possono essere colorate digitalmente.

Costituito da:

• Colonna elettronottica
• Sistema di comando e controllo dei circuiti elettrici ed elettronici
• Sistema di produzione e controllo del vuoto

Colonna elettronottica:

1. Sorgente elettronica: nel mentre di tungsteno e cilindro metallico (catodo +) e disco metallico sotto il catodo con foro centrale carico positivamente (anodo -)
2. Condensatori: lenti elettromagnetiche che fanno convergere i