Appunti di Citologia per esame

PREPARAZIONE DI UN CAMPIONE BIOLOGICO PER LA MICROSCOPIA OTTICA

3-Acquisizione del campione (tessuto) tagliandolo in pezzi di 1 cm.

-Fissazione (fisica o chimica) per immobilizzare e preservare i tessuti che sono molli e fragili; la fissazione deve essere fatta rapidamente per evitare che gli enzimi presenti degradino il tessuto. La fissazione chimica avviene per mezzo dialdeidi reattive (formaldeide) e conservazione in etanolo al 75%. Il campione viene incluso in paraffina o resina calda, la paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione. La fissazione fisica avviene per congelamento tramite il criotomo (5-20µm). Il vibratomo è un macchinario che ha una lama vibrante che permette di tagliare un campione fresco senza fissazione o congelamento (20-50 µm).

-Taglio in sezioni sottili per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 µm. Le sezioni vengono montate su vetrini per microscopia e in base a come il campione viene

posizionato nel blocchetto di paraffina si avranno diversi tipi di sezioni: piano trasverso, piano frontale (o coronale) e piano sagittale. - Colorazioni (istologiche) permettono di colorare i vari compartimenti cellulari per facilitare lo studio morfologico. C'è un basso contrasto ottico dovuto anche all'esiguo spessore delle sezioni ma se colorate permettono di ottenere moltissimi risultati. I coloranti per eccellenza sono l'ematossilina e l'eosina: l'ematossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine e colorerà i nuclei delle molecole); l'eosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol e colorerà il citoplasma). ESEMPI Effetto di un'alimentazione a base di sogliola nei pesci carnivori: sezioni trasverse di tipo circolare di un intestino. Dall'alto verso il basso i villi intestinali si accorciano, questo è dovuto all'effetto.che le diete a base di soia hanno un impatto negativo sui salmonidi (trote, salmoni). Una dieta a base di sogliola provoca infiammazione dell'intestino dei salmonidi, che porta all'accorciamento dei villi intestinali e alla riduzione della superficie assorbente dell'intestino. L'epitelio intestinale è costituito da enterociti, o cellule assorbenti intestinali, che sono semplici cellule epiteliali colonnari che rivestono la superficie interna dell'intestino tenue e crasso. Un rivestimento superficiale di glicocalice contiene enzimi digestivi. I microvilli sulla superficie apicale aumentano la sua superficie. Ciò facilita il trasporto di numerose piccole molecole nell'enterocita dal lume intestinale. Queste includono proteine, grassi e zuccheri scomposti, nonché acqua, elettroliti, vitamine e sali biliari. Le cellule caliciformi (Goblet cells) sono semplici calici colonnari a forma di cellule epiteliali che sintetizzano mucine gelificanti che, idratandosi, diventeranno.

muco e lubrificheranno l'intestino. Sotto lo strato epiteliale si trova la lamina propria che contiene buona parte degli elementi figurati del sistema immunitario.

Microscopia a fluorescenza: il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi o fluorofori e viene colpito da un fascio di luce. Queste sono sostanze che si legano in maniera specifica a un anticorpo e che, se eccitate a una certa lunghezza d'onda emettono un certo colore. I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde.

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM): ha permesso di ottenere una serie di dettagli in più su quello che c'è dentro le cellule perché il potere di risoluzione è altissimo (il limite di risoluzione è di 0,2 nm). In questo caso non si utilizza un fascio di luce ma un fascio di elettroni, che hanno una lunghezza d'onda corta. Per preparare questi campioni bisogna fare un prelievo, fissare il campione in

glutaraldeide o tetrossido di osmio (composto elettrondenso) e bisogna disidratare il campione includendolo in resine epossiliche. I campioni devono essere molto più sottili di quelli per il microscopio ottico, queste sezioni ultrasottili vengono realizzate attraverso l'ultramicrotomo (50-100 nm). Non vengono usati coloranti classici ma coloranti elettronici: sostanze dense agli elettroni (sali di piombo) che si legano in maniera selettiva (disomogenea) ad alcune componenti cellulari. Serve per dare contrasto o anche per marcare anticorpi (immunogold).

Microscopia elettronica a scansione (SEM): si parla di un microscopio elettronico perché viene utilizzato un fascio di elettroni e si studia la superficie del campione. La superficie del campione, in precedenza fissato in glutaraldeide o tetrossido di osmio, è in genere rivestita, mediante l'impiego di specifici apparecchi, di un sottile strato di metallo pesante (oro). In seguito, il campione viene sistemato sulla

macchina dove riceve un fascio di elettroni primario. Il campione, essendo fatto d'oro fa rimbalzare gli elettroni, generando elettroni secondari, che vengono captati da un detector e grazie alla presenza di un computer si ricostruisce l'immagine 3D del campione.

Microscopia a infrarosso (IR): permette di ottenere una composizione macromolecolare del campione impattando la sezione fresca del campione con i raggi a infrarosso. Un'immagine morfologica viene associata a un'immagine macromolecolare: non solo si vedrà in che modo la cellula è organizzata ma anche da che sostanza ogni parte di cellula è composta (proteine, lipidi). Queste due informazioni si accoppiano e viene generata una mappa chimica che rappresenta il campione. Non c'è più solo l'informazione morfologica dovuta ad esempio alla microscopia ottica, ma questa microscopia associa anche un'informazione macromolecolare. Si riesce a fare questo perché

ogni singolo pixel dell'immagine è uno spettro di assorbanza, ogni pixel avrà un certo picco. Analizzando l'intero spettro ottenuto si troveranno le proteine, i lipidi, fosfolipidi, carboidrati e acidi nucleici. Se si analizza una cellula uovo tramite la spettroscopia IR si può impostare lo strumento per vedere le varie componenti della cellula; più è rosso un punto più saranno presenti le componenti analizzate.

SPERIMENTAZIONE ANIMALE

La sperimentazione animale risale a moltissimi anni fa; uno dei primi ad introdurla fu Aristotele. I veri e propri esperimenti sugli animali si sono sviluppati nel XVIII e XIX secolo. Sappiamo che le cellule derivano da un progenitore comune e che le conoscenze acquisite studiando un certo organismo contribuiscono a comprendere gli altri. Se ad esempio si studia una patologia sul topo, le informazioni ottenute possono essere utili per l'uomo che avrà la stessa patologia. Non tutti gli organismi si

proteine. Un altro organismo modello molto utilizzato è il lievito Saccharomyces cerevisiae, che viene studiato per comprendere i meccanismi di regolazione genetica e il ciclo cellulare. Tra gli organismi modello eucarioti, il verme Caenorhabditis elegans è ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo embrionale e la neurobiologia. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è un altro organismo modello molto importante, utilizzato per studiare la genetica dello sviluppo e il comportamento. Infine, il topo Mus musculus è uno dei principali organismi modello utilizzati negli studi biomedici, grazie alla sua somiglianza genetica con gli esseri umani. Questi organismi modello sono fondamentali per comprendere i meccanismi biologici di base e per sviluppare nuove terapie e trattamenti per le malattie umane.

proteine (studio diantibiotici). Se si mettono queste cellule in glicerolo (un alcol), si possono addirittura conservare a -80°C. Tra glieucarioti troviamo il lievito di birra (Saccaromyces cerevisiae) che ha chiarito i meccanismi che regolano la divisionecellulare, ovvero la catena di eventi che porta il nucleo e le altre componenti a duplicarsi e a distribuirsi in due cellulefiglie. Tra i vegetali troviamo l'erbetta selvatica (Sarabidopsis thaliana) che si sviluppa bene al chiuso e nel giro di 8-10 settimane produce migliaia di discendenti. È utilizzata per lo studio dello sviluppo e della fisiologia delle pianteagricole e l'evoluzione delle piante a fiore. Tra gli animali pluricellulari, gli insetti (Drosophila melanogaster) sono laspecie più numerosa e conosciuta. Gli insetti sono fondamentali per studi di genetica classica: il loro studio hapermesso di chiarire e dimostrare definitivamente la trasmissibilità dei geni attraverso i cromosomi, i

gli ematodi, uno dei più studiati è il Caenorhabditis elegans. Questo piccolo verme del suolo è composto da 959 cellule ed è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per lo studio dello sviluppo embrionale e larvale. Grazie alla sua semplicità e alla conoscenza dettagliata del suo sviluppo, sono stati identificati numerosi mutanti di C. elegans e sono state studiate le modalità di divisione, migrazione e specializzazione delle sue cellule durante lo sviluppo. In particolare, C. elegans è stato utilizzato per studiare l'apoptosi, un processo di morte cellulare programmata che differisce dalla necrosi o dall'infiammazione. L'apoptosi svolge un ruolo importante nella rimodellazione del corpo durante la metamorfosi, ad esempio nel passaggio da girino a rana. In questo processo, gli ormoni tiroidei regolano l'apoptosi e controllano la crescita delle zampe e la regressione della coda. Prima che la coda venga distrutta, il girino deve sviluppare le zampe. Gli ormoni tiroidei promuovono la proliferazione delle cellule delle zampe a basse concentrazioni e la regressione della coda ad alte concentrazioni. Questo meccanismo controllato dagli ormoni tiroidei assicura che il girino abbia le zampe sufficientemente sviluppate prima di eliminare la coda.imammiferi il modello per eccellenza è il topo (Mus muscolo) che è tra gli organismi più utilizzati come modello (quasitutti i geni umani hanno un corrispondente nei topi). Anche l'uomo viene utilizzato per esperimenti; le cellule crescono in condizioni controllate che permettono di mantenere alle cellule le loro proprietà (i fibroblasti secernono collagene, fibre muscolari si contraggono, cellule nervose creano sinapsi). Ad esempio, ci sono delle cellule cardiache che vengono coltivate e mantenute in cultura e mantengono la loro funzione contrattile. I modelli sperimentali acquatici sono rappresentati all'80% da un pesce (Danio rerio o pesce zebra) che da adulto misura intorno ai 3-4 cm; è un pesce originario del sudest asiatico ed è un modello di eccellenza per studi di biologia dello sviluppo, nutrizione e tossicologia. È un pesce che raggiunge l'età adulta in circa 90 giorni (fecondazione, fase larvale, fase giovanile).

giovanile e fase adulta) ed è un grossissimo vantaggio perché svolgono le fasi in un tempo brevissimo. C'è un grandissimo numero di mutanti che sviluppano il tumore al colon retto, alcuni sviluppano i melanomi, alcuni non producono melanina e sono completamente trasparenti. Un altro