Appunti Patologia Clinica

Esame emocromocitometrico

L’esame emocromocitometrico è un esame completo del sangue che prevede il conteggio delle cellule circolanti ed il dosaggio dell’emoglobina e dell’ematocrito. Per effettuare l’esame sono necessari pochi millilitri di sangue che vengono prelevati attraverso un ago inserito in una vena superficiale di un braccio e devono essere conservati a temperatura ambiente in una provetta contenente un anticoagulante (ad esempio EDTA o citrato; successivamente, il campione viene trasportato al laboratorio di analisi e, dopo due ore di sedimentazione, viene analizzato con un macchinario elettronico chiamato contaglobuli (sia manuale che automatico) in cui, tramite un sistema di vuoto, viene aspirato.

Ematocrito e parametri correlati

L’ematocrito indica il rapporto percentuale del volume sanguigno occupato dalla parte corpuscolata (principalmente eritrociti) rispetto al volume totale del campione di sangue. Il suo valore normale si aggira intorno al 42-54% nell’uomo e intorno al 37-44% nella donna (nei neonati risulta essere molto elevato e si riduce in caso di età avanzata e gravidanza, quindi esistono delle variazioni fisiologiche dovute al sesso e all’età). Il valore dell’ematocrito tende a diminuire in uno stato anemico, mentre tende ad aumentare in caso di una massiva produzione di globuli rossi e di emoconcentrazione con conseguente diminuzione della frazione plasmatica (questa condizione causa un aumento della viscosità del sangue e una diminuzione della sua velocità).

[Durante la gravidanza è possibile instaurare un’anemia fisiologica dovuta all’aumento della componente plasmatica che diluisce la componente corpuscolare]

Il volume corpuscolare medio (MCV) indica il volume medio degli eritrociti ed è dato dal rapporto fra il valore ematocrito e la conta dei globuli rossi; il suo valore normale è circa 80-100 femtolitri (fl).

L’emoglobina corpuscolare media (MCH) indica la massa media di emoglobina presente in un globulo rosso ed è data dal rapporto della quantità di emoglobina e la conta dei globuli rossi; il suo valore normale è di 27-31 pg/cellula.

La concentrazione emoglobinica corpuscolare media (MCHC) è la quantità di emoglobina presente in un singolo eritrocita in funzione delle sue dimensioni ed è data dal rapporto della quantità percentuale di emoglobina del valore ematocrito; il suo valore normale è 32-36 g/dl (che corrispondono ad una concentrazione di 4,9-5,5 mM).

L’ampiezza della distribuzione eritrocitaria (RDW) è il coefficiente di variazione dell’ampiezza della distribuzione del volume corpuscolare medio; il suo valore normale è 12-16% (viene espressa con un istogramma in cui i valori superiori alla norma indicano una disomogeneità di volume della popolazione eritrocitaria).

Definizioni di anemia

Anemia= riduzione dei livelli di emoglobina (il suo valore normale è 13-17,5 g/dl per l’uomo e 12-15 g/dl per la donna; se scende sotto i 7 g/dl è necessaria una trasfusione).

Eritrocitosi o policitemia= aumento del numero dei globuli rossi.

Poliglobulia= aumento del numero di globuli rossi, dell’emoglobina e dell’ematocrito.

Caratteristiche dei globuli rossi e bianchi

I globuli rossi sono delle cellule anucleate biconcave dalle dimensioni di 7,5 µm, con un’emivita in circolo di 120 giorni che contengono l’emoglobina adibita al trasporto dell’ossigeno nel sangue; la loro concentrazione normale è 5,2 x 10⁶/mm³ nell’uomo e 4,60 x 10⁶/mm³ nella donna.

I globuli bianchi sono le cellule adibite alla difesa dell’organismo con una concentrazione normale di 4-10 x 10³/mm³ e sono suddivisi in:

• Granulociti neutrofili rappresentano il 60-70% dei globuli bianchi, presentano più nuclei polilobati, trascorrono circa 10-12 ore in circolo per passare nei tessuti dove operano la loro funzione antibatterica e dove rimangono per un tempo variabile da alcune ore a giorni senza dividersi (sono cellule della difesa aspecifiche che aumentano in caso di infezione batterica).
• Granulociti eosinofili rappresentano il 1-3% dei globuli bianchi (aumentano in caso di allergie ed infezioni parassitarie).
• Granulociti basofili rappresentano il 0,5-2% dei globuli bianchi (aumentano in caso di intossicazione da metalli pesanti).
• Linfociti rappresentano il 20-35% dei globuli bianchi, presentano un tasso di moltiplicazione intenso con un’emivita variabile da pochi giorni ad anni a seconda della funzione (sono responsabili della competenza immunitaria in quanto sono le cellule della difesa specializzata che aumentano in caso di infezione virale).
• Monociti rappresentano il 3-6% dei globuli bianchi e giocano un ruolo fondamentale nella risoluzione del processo infiammatorio.

Le piastrine sono frammenti cellulari anucleati dalle dimensioni di 2-3 µm che si producono dalla frammentazione citoplasmatica dei precursori megacariocitari, presentano un’emivita di 8-11 giorni e permettono la funzione del sistema emostatico coagulativo; il loro valore normale è 150-450 x 10³/mm³.

I reticolociti sono dei giovani globuli rossi ancora in grado di sintetizzare proteine (vengono messi in evidenza con una colorazione sopravitale in quanto contengono residui RNA basofilo nel citoplasma); essi sono alti in circolo quando vi è un’anemia con una risposta midollare adeguata, mentre risultano bassi in caso di anemia con compromissione della capacità midollare. Normalmente, rappresentano circa lo 0,5-2% degli eritrociti.

Metodiche emocromocitometriche

Le metodiche emocromocitometriche si basano sulla misurazione visiva diretta al microscopio degli elementi corpuscolati presenti in una sospensione cellulare e, anche se negli ultimi tempi sono state introdotte delle tecniche di misurazione automatica (minori costi ed errori, maggiore riproducibilità), esse sono sempre utili in situazioni di emergenza e come metodo di confronto.

N.B. Effettuando uno striscio di sangue ed una colorazione al microscopio, i neutrofili appaiono di colore lilla, gli eosinofili di colore quasi arancione, i basofili appaiono come puntini neri, i leucociti sono caratterizzati da un nucleo scuro con poco citoplasma ed i monociti presentano un nucleo abbastanza chiaro con una buona quantità di citoplasma.

Alterazioni e disturbi emocromocitometrici

Le alterazioni dei valori dell’emocromo non legati ad alcun disturbo patologico sono dovute a fattori di disturbo come la sporcizia della soluzione, la presenza di forme immature della serie rossa, di piastrine di grandi dimensioni oppure di agglutinine a freddo, la contaminazione batterica e l’inadeguatezza del prelievo ematico.

La poichilocitosi è la variabilità di forma degli eritrociti (che possono discostarsi dalla morfologia rotondeggiante fisiologica per assumere forme a racchetta, a pera, a biscotto, a lacrima, ecc) e, solitamente, è dovuta ad un evento di eritropoiesi inefficace. L’anisopoichilocitosi è la variabilità della forma e del volume degli eritrociti. N.B. È possibile riscontrare un lieve grado di anisopoichilocitosi anche nei soggetti sani.

Classificazione degli eritrociti

In base alle dimensioni, gli eritrociti possono essere classificati in:

• Microciti quando il volume corpuscolare medio è inferiore a 80 fl e il diametro è inferiore 7 µm.
• Normociti quando il volume corpuscolare medio è inferiore a 80-95 fl e il diametro è pari a 7-8 µm.
• Macrociti quando il volume corpuscolare medio è superiore a 95 fl e il diametro è superiore a 8,5 µm.
• Megaloblasti quando il volume corpuscolare medio è superiore a 115 fl e il diametro è superiore a 8,5 µm.

Emoglobina e tipi di emoglobina

Gli eritrociti sono ricchi di una proteina tetramerica detta emoglobina, formata da quattro catene peptidiche (due per tipologia) a cui è legato un gruppo eme (anello porfirinico) contenente ferro in una tasca idrofobica interna per ciascuna che garantisce lo scambio di gas, il mantenimento del pH ematico e della temperatura. L’emoglobina può esistere in uno stato teso T a bassa affinità per l’ossigeno ed in un stato rilassato R ad alta affinità per l’ossigeno (nella transizione da uno stato all’altro si ha lo spostamento rotazionale del dimero α₁β₁ rispetto al dimero α₂β₂).

In natura esistono varie tipologie di emoglobina:

• A, tipica dell’adulto (96-98%), formata da 2 catene α e da due catene β.
• A₂, poco presente nell’individuo adulto (2-4%), formata da 2 catene α e da due catene δ.
• F, tipica del feto, formata da 2 catene α e da 2 catene γ.
• Emoglobine embrionali, quali la Gower 1 (ζ₂ε₂), la Portland (ζ₂γ₂) e la Gower 2 (α₂ε₂).

Anemie microcitiche

L’anemia sideropenica è dovuta ad una carenza di ferro causata da un inefficiente assorbimento intestinale, ad una mancata soddisfazione del fabbisogno giornaliero (1mg/die nei soggetti sani, 3 mg/die nelle donne con ciclo mestruale e 3-6 mg/die durante la gravidanza e l’allattamento) oppure ad un’eccessiva escrezione a livello epidermico, della mucosa intestinale o in caso di perdite di sangue (mestruazioni, ulcere, neoplasie gastriche, diverticolosi, emorroidi). In caso di sospetto di un’anemia sideropenica devono essere misurate la sideremia e le riserve di ferro, in particolare la ferritina (lega il ferro a livello dei tessuti) e la transferrina (trasporta il ferro nel sangue).

A livello istologico si evidenziano globuli rossi più piccoli ed ipocromatici con presenza di anisopoichilocitosi (= eterogeneità di dimensione e forma). N.B. In caso di anemia sideropenica si registra una diminuzione della sideremia (valore normale 3-5) con un aumento della transferrina e ad una diminuzione della ferritina associati alla diminuzione del valore di MCV e dall’aumento del valore RDW.

L’anemia sideropenica è spesso caratterizzata da sintomi associati alla carenza di ferro quali la fragilità delle unghie e dei capelli, la perdita di memoria e l’alterazione della mucosa orale (oltre ai sintomi specifici dell’anemia quali affaticamento, dispnea da sforzo, tachicardia e pallore).

Le talassemie sono alterazioni quantitative che comportano la comparsa di un’anemia microcitica dovute ad una riduzione della sintesi delle catene dell’emoglobina associate ad una diminuzione sia del valore di MCV che di RDW.; si riscontrano due diverse tipologie di talassemia:

• α-talassemia → dovuta ad una delezione dei geni presenti sul cromosoma 16 (sono presenti due copie del gene); la sua gravità varia con il numero di copie delete, in particolare:
  • Se viene deleto un solo allele sui quattro presenti la malattia è silente.
  • Se vengono deleti due alleli si manifesta il tratto talassemico caratterizzato da una lieve anemia.
  • Se vengono deleti tre alleli la malattia si manifesta un’anemia microcitica moderata associata a splenomegalia.
  • Se sono deleti tutti e quattro gli alleli si avrà un’idrope fetale (=accumulo di fluidi a livello dei compartimenti fetali).
• β-talassemia dovuta a una mutazione a livello del gene della globina β presente sul cromosoma 11; la sua gravità dipende dall’entità della mutazione, in particolare:
  • Se è mutato un solo allele si avrà una talassemia minor.
  • Se sono mutati entrambi gli alleli si avrà una talassemia maior.

I pazienti affetti da talassemia presentano quadri anemici (spesso molto gravi di pazienti con necessità di trasfusioni), aumento del numero di globuli rossi, epatosplenomegalia (aumento delle dimensioni degli organi emocateretici), facilità di rottura dei globuli rossi e eventuale aumento dell’emoglobina F (in quanto, in caso di una mancata produzione della catena β, la catena α per non essere distrutta viene accoppiata alla catena γ), la quale determina una rarefazione del cranio (che viene definito “cranio a spazzola”). A livello istologico si registra una riduzione delle dimensioni dei globuli rossi (microcitosi), una riduzione della colorazione dei globuli rossi (ipocromia) associate ad anisopoichilocitosi e la presenza di precipitati a livello degli eritroblasti.

Emoglobinopatie (difetti qualitativi)

L’anemia falciforme è una patologia causata dalla produzione di emoglobina S a causa di una mutazione a livello delle catene β dell’emoglobina (mutazione di una base che provoca la sostituzione di una valina con acido glutammico) che determina la polimerizzazione dell’emoglobina e la sua precipitazione a livello citoplasmatico che fa assumere al globulo rosso una caratteristica forma a falce. In questa malattia si possono avere delle crisi falcemiche da ischemia e ostruzione, soprattutto localizzate a livello intestinale (non può essere curata ma si tenta di impedire le crisi); viene diagnosticata effettuando un vetrino su cui viene posizionata e lasciata asciugare una goccia (non viene strisciato per evitare modifiche della forma degli eritrociti).

La sferocitosi ereditaria è una forma di anemia dovuta ad un’alterata forma dei globuli rossi che appaiono sferici e ipercromici (ipercromia falsa perché la quantità di emoglobina non varia) a livello ematico a causa del decifit congenito della proteina di membrana anchirina (malattia prevalentemente autosomica dominante); la perdita della proteina determina una perdita di coesione del citoscheletro con lo strato fosfolipidico provocando un inspessimento della membrana cellulare, un impedimento nel passaggio dai sinusoidi e un accumulo a livello splenico che porta a splenomegalia (trattata mediante splenectomia).

Il favismo è una forma di anemia dovuta a una mutazione a carico del gene codificante per l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi che mappa sul cromosoma X che determina una ridotta attività o concentrazione dell’enzima a livello cellulare. In questa malattia si determina una riduzione della disponibilità di NADPH che è indispensabile per la rigenerazione del glutatione ridotto, quindi in caso di aumentato stress ossidativo si determina l’ossidazione dell’emoglobina che precita formando i corpi di Heinz (rendono rigido il globulo rosso) e il distacco del gruppo eme. Questa patologia si manifesta in forma acuta in seguito all’esposizione a farmaci o a fave con dolori lombari, ittero, urine ipercromiche, emoglobinuria e insufficienza renale (durante la crisi emolitica si prescrive idratazione, diuretici e, in caso di anemia molto grave, trasfusioni).

Anemie non microcitiche

L’anemia macrocitica è dovuta a problemi di moltiplicazione cellulare a livello della cellula precursore (in particolare del mieloblasto) con conseguente aumento in circolo dei reticolociti come tentativo di ristabilire le condizioni fisiologiche. L’anemia megaloblastica è dovuta alla carenza di vitamina B12 o di acido folico a causa di carenze alimentari, deficit dell’assorbimento (es. carenza di fattore intrinseco o anticorpi reattivi contro le cellule parietali) o aumento della richiesta (es. gravidanza) che causano un deficit nella sintesi del DNA in quanto le due sostanze sono cofattori essenziali nel processo di sintesi delle purine e delle pirimidine. Si manifesta clinicamente con l’aumento delle dimensioni degli elementi del sangue e con una neuropatia periferica associata ad alterazioni della sensibilità a causa di un meccanismo di demielinizzazione delle terminazioni nervose.

Le anemie normocitiche è dovuta a malattie infiammatorie croniche (es. artrite reumatoide, malattia di Chron, bronchiti autoimmuni) in cui si ha l’inibizione dell’eritropoiesi a causa della produzione di citochine pro-infiammatorie che diminuiscono l’attività proliferativa a livello midollare e favoriscono l’accumulo di ferro nei depositi tissutali che possono portare all’instaurarsi di un quadro di insufficienza renale per una mancata produzione di eritropoietina e di aplasia midollare e di invasione midollare da parte delle cellule neoplastiche, le quali sono in grado di rimpiazzare fisicamente il normale tessuto emopoietico che risulterà insufficiente nella produzione delle cellule del sangue. Questa condizione clinica è caratterizzata dall’aumento della ferritina e dalla diminuzione della sideremia e della transferrina.

N.B. Alcune tipologie di anemie possono essere di natura autoimmune dovuta alla presenza di isoanticorpi responsabili delle reazioni trasfusionali oppure di autoanticorpi (vengono classificati in caldi se reagiscono a 37°C, freddi se reagiscono a temperature inferiori a 37°C e bifasici se si attivano a freddo ma riescono ad attivare il sistema del complemento a 37°C).

Test diagnostici

Il test di Ham viene utilizzato per valutare la misura in vitro della lisi dei globuli rossi sospesi in soluzione a osmolarità decrescente.

Il test di Coombs diretto viene utilizzato per valutare la presenza di anticorpi fissati sulla superficie degli eritrociti, in particolare vengono prelevati gli eritrociti dal paziente e vengono fatti reagire con un siero particolare, detto di Coombs, che contiene anticorpi capace di riconoscere gli anticorpi diretti ai globuli rossi: nel caso in cui avvenga agglutinazione il test si evince che i globuli rossi siano legati ad anticorpi reattivi.

Il test di Coombs indiretto viene utilizzato per valutare la presenza di anticorpi liberi nel siero, in particolare vengono prelevati degli eritrociti normali e fatti reagire con il siero del paziente insieme al siero di Coombs: in caso di agglutinazione si evince la presenza di anticorpi reattivi nel siero.

Esame delle urine

L’esame delle urine prevede una fase preanalitica che si svolge fuori dal laboratorio che consiste nella prenotazione dei test tramite il sistema informatico, nel prelievo dei campioni ed il loro invio al laboratorio (in cui la maggiore criticità è rappresentata dal tempo di attesa).