Patologia Clinica - Appunti Completi

Patologia clinica

L'esame emocromocitometrico

Fra le cellule circolanti nel sangue troviamo eritrociti e leucociti (granulociti, linfociti e piastrine).

Eritrociti

Gli eritrociti sono senza nucleo perché lo hanno espulso nei processi maturativi; questi spendono tutta la vita in circolo, per circa 120 giorni. È importante conoscere la vita degli eritrociti, al fine di capire quanto queste cellule dureranno in circolo, dopo una trasfusione. Di eritrociti ne troviamo circa 4,4-5,5 x 10⁹/mm³ negli uomini e 4,2-5 x 10⁹/mm³ nelle donne.

Granulociti

I granulociti presentano il nucleo, non si dividono e quindi non si moltiplicano, trascorrono 10-12 ore in circolo, poi passano ai tessuti, dove vivono fino ad alcuni giorni, svolgendo funzione antibatterica, senza più tornare nel circolo ematico. I granulociti si dividono in neutrofili, eosinofili e basofili. CERCA SU INTERNET CHE COSA FA OGNUNO. I neutrofili aumentano per infezione batterica.

Linfociti

Linfociti hanno il nucleo e si moltiplicano intensamente, vivono da pochi giorni a molti anni, viaggiano continuamente per il sangue, la linfa e gli organi linfoidi. Sono i responsabili della competenza immunitaria. I linfociti aumentano per infezione virale.

Piastrine

Le piastrine non sono cellule, ma frammenti citoplasmatici. Trascorrono tutta la vita in circolo per 8-10 giorni circa. Queste sono 150-450 x 10⁹/mm³.

Tecniche citometriche

Fra le metodiche citometriche, troviamo tecniche manuali e tecniche automatizzate. Le tecniche manuali o visuali si basano sulla misurazione visiva diretta al microscopio degli elementi corpuscolati presenti in una sospensione cellulare. Queste tecniche, oggi, sono state affiancate da tecniche automatizzate. Queste, tuttavia, non hanno sostituito completamente le tecniche manuali; queste ultime, infatti, vengono per esempio usate in condizioni di emergenza, possono essere utilizzate con quei campioni particolari che gli strumenti automatici non sono in grado di analizzare, costituiscono un metodo di confronto per le misurazioni automatiche, possono essere le uniche disponibili in piccoli laboratori decentrati e, infine, vengono tutt'oggi utilizzate estesamente per le conte cellulari su liquidi biologici.

Striscio di sangue periferico

Con una pipetta, si pone una striscia di sangue su un vetrino e poi lo si spande su tutta l'ampiezza del vetrino. Importante è eseguire una strisciata omogenea; se ho un vetrino con piccole accavallature, al microscopio troveremmo cellule addensate e non uniformemente distribuite.

L'esecuzione di carichi quotidiani di lavoro molto spinti ha richiesto lo sviluppo di alcune caratteristiche operative volte a migliorare la velocità e la precisione dei conteggi e la riduzione dei costi. Gli analizzatori ematologici automatici sono citometri dedicati chiusi. Le misurazioni vengono effettuate su sospensioni diluite di cellule, che vengono trasportate attraverso un dispositivo sensibile (laser), che ne rileva la presenza, il numero, le dimensioni, che ci permettono di distinguere un tipo di cellula da un'altra.

Cause di errore nelle letture

• Prelievo di sangue non corretto; (per esempio durante un prelievo fatto per uno studio per evitare l'emolisi e quindi coagulazione. In questi casi si preferisce aghi più grandi, valutare in maniera assolutamente normale la cascata coagulativa.)
• Insufficiente mescolanza dei campioni
• Inconvenienti tecnici, come un tampone alterato, un kit invecchiato, un kit mantenuto a temperatura errata, ecc.
• Mancanza di controlli di qualità
• Conteggio leucociti; a volte, il conteggio di queste cellule può essere alterato, per esempio in soluzioni sporche
• Conteggio eritrociti, in caso di soluzioni sporche, ma anche di agglutinine a freddo (le cellule si agglutinano da sole); abbiamo errore di lettura di cellule anche in caso di piastrine giganti: queste, infatti, vengono viste dalla macchina come leucociti.

Ma, quindi, perché sono stati scelti gli analizzatori automatici? Per migliorare la qualità dei risultati, per avere meno errori di misura e di preparazione dei campioni, ma anche per risparmiare sui costi.

Formula leucocitaria o leucogramma

La formula leucocitaria non è altro che la percentuale dei vari tipi di globuli bianchi. Questi, in totale, sono circa 6-10 x 10⁹/mm³. La formula così presenta le varie percentuali:

• Neutrofili 60-70%
• Linfociti 20-35%
• Monociti 3-6%
• Eosinofili 1-3%
• Basofili 0,5-1%

Ematocrito (Hct) ed esame emocromocitometrico

L'ematocrito esprime la percentuale di volume degli elementi corpuscolati, rispetto al volume totale di un campione di sangue. Ma come si fa a dividere le varie cellule? O attraverso una centrifugazione a bassa velocità oppure lasciamo la provetta a temperatura ambiente per 2 ore. C'è da tenere presente, però, una cosa importante: quando le cellule sedimentano, gli eritrociti si andranno a depositare tutti quanti sul fondo, dividendo la provetta in due parti: sul fondo gli eritrociti e in alto i leucociti e le piastrine. Quindi, se vogliamo lavorare con più precisione su questi ultimi due, dovremo aspirare gli eritrociti e centrifugare nuovamente i soli leucociti e piastrine.

Come possiamo vedere dalla figura, i valori normali sono calcolati in percentuale e presentano delle differenze fra uomo e donna, ma anche tra neonato alla nascita, neonato a 3 mesi e bambini di 10 anni. Il valore dell'ematocrito, tuttavia, non solo varia con l'età e col sesso, ma anche con l'altitudine, la posizione e lo stato d'idratazione.

Quindi, l'esame emocromocitometrico comprende il conteggio degli eritrociti circolanti (GR), la misura dell'emoglobina (Hb), l'ematocrito (Hct) ed i parametri corpuscolari derivati, che sono:

• Volume corpuscolare medio, che rappresenta il volume medio del globulo rosso (MCV),
• Emoglobina corpuscolare media, ossia quanta emoglobina è presente in ogni singolo globulo rosso (MCH),
• Concentrazione emoglobinica corpuscolare media, che rappresenta la media delle emoglobine presenti nei vari eritrociti (MCHC).

La valutazione combinata di questi parametri permette di definire le principali variazioni quantitative, come la:

• Riduzione dei livelli di Hb = anemia (RICORDA: l'anemia, quindi, non corrisponde ad una diminuzione dei globuli rossi, ma ad una diminuzione dell'Hb)
• Aumento di Hb ed Hct (un aumento dell'ematocrito significa "aumento delle cellule totali del sangue", soprattutto dei globuli rossi) = eritrocitosi

Ovviamente, per analizzare poi la morfologia dei globuli rossi, dovremmo andare ad osservarli al microscopio ottico.

Adesso, se abbiamo trovato una riduzione di Hb (siamo, dunque, di fronte ad un'anemia), qual è il prossimo passo per capire di fronte a quale anemia ci troviamo? Andiamo ad analizzare le dimensioni degli eritrociti. Gli eritrociti normali (normociti) sono di grandezza omogenea, con diametro (Ø) di circa 7-8 µ. Ma come si trova questo diametro? Attraverso l'MCV, precedentemente incontrato, ossia proprio il volume corpuscolare medio, espresso dal rapporto tra massa e numero degli eritrociti: si misura in femtolitri (un MCV normale è circa 83-99 fl).

Nel caso di un'anemia, però, abbiamo più possibilità. Se l'MCV diminuisce e, di conseguenza, diminuisce il numero delle cellule (al di sotto di 83), si ha la formazione di una cellula più piccola, che prende il nome di microcita. Esistono, tuttavia, anche alcune anemie in cui i valori di MCV restano normali (fra 83 e 99) e qui troviamo i normociti, ed esistono, infine, alcune anemie in cui l'MCV supera i 99. Se l'MCV supera i 99, ma resta sotto i 115, le cellule verranno chiamate macrociti; se, invece, supera i 115, le cellule prenderanno il nome di megaloblasti.

Dunque, ripetendo, i microciti sono dovuti ad un difetto di sintesi dell'Hb. Questi corrispondono principalmente a 3 anemie:

• Anemie sideropeniche, con carenza di ferro (la più frequente)
• Anemie talassemiche
• Anemie saturnine, relative al piombo

Nel caso, invece, che ci si trovi di fronte a valori di MCV normali (fra 83 e 99), è possibile, come già detto, che si sia di fronte ad alcune tipologie particolari di anemie, derivanti da malattie infiammatorie croniche.

Quando siamo, invece, di fronte ad un MCV aumentato, siamo a contatto con anemie macrocitiche, che dipendono in genere da difetti di moltiplicazione cellulare (per esempio, in casi di epatopatia, reticolocitosi o di mielodisplasia).

Infine, quando l'MCV supera i 115, siamo di fronte ad un'anemia megaloblasta, derivante normalmente da una carenza di vitamina B12, che porta ad un difetto di moltiplicazione cellulare (anemia perniciosa).

IMPORTANTE: Un parametro che, quando alterato, indica una possibile carenza di vitamina B12 (o di vitamina B6 o di acido folico) è l'omocisteina. Questa è un metabolita intermedio della sintesi della metionina (amminoacido). Nella formazione di questo amminoacido entrano anche, come cofattori, proprio le vitamine. Quando si ha un deficit di queste vitamine, rimane il metabolita intermedio, poiché il procedimento si arresta e non giunge a termine. La carenza, dunque, di queste vitamine implicano necessariamente un aumento di omocisteina che, tuttavia, è una sostanza tossica. Con l'andare del tempo, da una parte può causare danni cardiovascolari, mentre dall'altra partecipa ai difetti del tubo neurale (la spina bifida è stata combattuta grazie a questa scoperta).

RDW e distribuzione del volume eritrocitario

Tornando a noi, l'ultimo parametro da considerare è l'RDW, ossia il coefficiente di variazione della distribuzione del volume eritrocitario (in altre parole, è la varietà del volume delle cellule che andiamo ad analizzare): questo ci serve, quindi, a valutare l'omogeneità del volume dei globuli rossi. L'RDW viene misurato in percentuale: i valori normali si aggirano intorno ai 12-16.

Analisi della forma e della colorabilità degli eritrociti

Adesso che abbiamo analizzato anche le dimensioni degli eritrociti, come ci muoviamo? Il passo successivo è quello di osservare la loro forma. L'eritrocita normale presenta una forma rotondeggiante. Fra le alterazioni della forma, abbiamo:

• Poichilocitosi, ossia una variabilità di forma (a racchetta, a pera, a biscotto, a lacrima), generalmente espressione di eritropoiesi inefficace e fragile. Queste forme derivano dal fatto che c'è poco ossigeno, poca Hb e quindi soffrono, ripiegandosi; a volte, invece, sono proprio difetti di membrana, che non permettono il mantenimento della forma.
• Anisocitosi, ossia una disuguaglianza di dimensioni (alcuni eritrocitosi appaiono piccoli, altri grandi, ecc.).
• Anisopoichilocitosi, che rappresenta un'unione di poichilocitosi e anisocitosi. Tanto maggiore è l'anisocitosi, tanto più frequente è la poichilocitosi. Lievi gradi di anisocitosi e poichilocitosi si riscontrano anche in soggetti sani.

Adesso possiamo andare ad analizzare la colorabilità degli eritrociti. Questa, generalmente, esprime la quantità di emoglobina (Hb) contenuta negli eritrociti. In questo caso, è necessario valutare:

• MCH = contenuto corpuscolare medio di Hb; esprime il rapporto fra emoglobina e numero di globuli rossi (v.n. 27-33 pg)
• MCHC = concentrazione corpuscolare media eritrocitaria di Hb; esprime il rapporto fra emoglobina e massa dei globuli rossi (v.n. 32-34%) (è indipendente da variazioni di numero degli eritrociti)
• HDW = indice di variabilità di emocromia (emoglobinizzazione), (v.n. 1.99-2.88 gr/dl)
• Anisocromia = disomogenea colorabilità della popolazione eritrocitaria per differente contenuto di Hb negli eritrociti
• Ipocromia = diminuita colorabilità per riduzione di sintesi di Hb (anemie sideropeniche anemie talassemiche)
• Ipercromia = si discute se sia possibile, perché la quantità normale di Hb per globulo rosso corrispondente esattamente alla quantità massima di Hb che il globulo rosso può portare
• Policromatofilia = eritrociti con granulazioni basofile (residui di RNA), come se fossero reticolociti.

Eritrociti in anemia

I reticolociti sono giovani globuli rossi in cui la colorazione a fresco con alcuni coloranti basici mette in evidenza una sostanza granulo-filamentosa di materiale basofilo: residui di RNA. Sono in grado di sintetizzare proteine. In soggetti non anemici questi sono circa 30,000 - 90,000 / mm³ in circolo in 1 giorno. Usando fluorocromi che si legano all'RNA ribosomiale si riconoscono:

• LFR = reticolociti a bassa fluorescenza, relativamente più maturi
• MFR = reticolociti a media fluorescenza e maturazione
• HFR = reticolociti ad elevata fluorescenza, più immaturi

L'eritropoietina, in condizioni di anemia, favorisce l'immissione in circolo di reticolociti ad uno stadio di maturazione più precoce (rimangono in circolo 2-3 gg).

In base a questi indici possiamo riconoscere:

• Anemie con risposta midollare adeguata (emorragia acuta, anemia emolitica) in cui la conta dei reticolociti è alta.
• Anemie con compromissione della capacità del midollo di aumentare la produzione cellulare (anemie sideropeniche, anemie da insufficienza midollare primitiva) con reticolociti non molto alti.

NB: nello studio di una diagnosi è importante partire nello studio di quella più frequente, per esempio, se pensiamo che un soggetto presenti anemia e dobbiamo capire di quale tipologia si tratta, iniziamo con gli esami della sideremia e di conseguenza con gli esami sugli elementi che hanno affinità con il ferro. Valuteremo quindi la ferritina e le transferrasi. Se i valori sono ok, si passerà all'analisi della seconda anemia più frequente, la talassemia. Si analizzeranno quindi gli elementi che hanno a che fare con questa anemia. Se ancora ottengo valori positivi, andrò a valutare la saturnia, la terza anemia in una scala di frequenza, e così via.

Nello studio di un'anemia tuttavia, posso pensare che essa sia presente solo se vari fattori inerenti ad un tipo di anemia sono deficitari. Se per esempio, durante un esame, trovo la sola ferritina a livelli bassissimi, essa non sarà indice di una sideremia, bensì di un'altra patologia, che non ha a che fare con l'anemia.

Alterazioni dell'emocromocitometrico

Come è possibile vedere dalla tabella qui sopra, sia i valori di ematocrito che di emoglobina sono differenti fra uomini e donne. Abbiamo detto che, in caso di anemia, i valori di Hb sono alterati (possiamo trovati anche valori di eritrociti alterati) e l'MCV è sicuramente alterato. A questo punto, che cosa possiamo fare per capire meglio che tipo di anemia abbiamo davanti? Prima di tutto andiamo a vedere se siamo di fronte all'anemia più diffusa, ossia quella microcitica: andiamo, pertanto, a dosare i trasportatori per il ferro, come la ferritina e la transferrina. Se troviamo tutto normale, andiamo a vedere se c'è un'altra tipologia di anemia (quella poco meno diffusa della microcitica, ossia l'anemia falciforme). Andiamo, quindi, a vedere l'Hb, che ci permette di capire il tipo di talassemia. Alcune di queste sono anche dovute alla carenza di alcuni enzimi, come la Glucosio-6-Fosfato-Deidrogenasi e la Piruvato-Chinasi (andremo, dunque, a dosare anche questi). Infine, l'acido folico e la vitamina B12 le dosiamo per vedere se ci sono anemie megaloblaste (in queste abbiamo, infatti, una carenza di una di queste due vitamine provocando l'aumento dell'omocisteina).

Se troviamo alterata la sideremia, poi, ci troviamo di fronte ad un'anemia iposideremica. Importante ricordare come, se trovo una carenza di ferritina e transferrina, insieme ad altri parametri alterati, è molto probabile che sia di fronte ad un'anemia. Se, invece, mi trovo di fronte ad una sola carenza di ferritina, non si ha un'anemia, ma si hanno 2 possibilità principali: o siamo di fronte ad una malattia autoimmune o c'è un problema di assorbimento.

Le alterazioni possono essere di tipo quantitativo (aumento o diminuzione delle popolazioni cellulari) o morfologiche (allontanamento dalla morfologia normale). Le alterazioni quantitative vengono sempre classificate attraverso l'inserimento del suffisso "-citosi", se rappresentano un aumento, mentre "-penia" se abbiamo una diminuzione.

Striscio di sangue periferico

Cosa possiamo ottenere di informazioni da uno striscio di sangue periferico? Questo ci dà moltissimo informazioni utili, perché ci permette di osservare subito quali anomalie il sangue presenta; a seconda dell'alterazione, possiamo identificare una particolare patologia.

• Bisogna tenere presente, per esempio, se le cellule tendono ad essere allungate (ellissocitosi, sferocitosi): questo, infatti, corrisponde proprio ad un'anemia precisa. Nel caso delle cellule sferiche, abbiamo la sferocitosi ereditaria, mentre nel caso delle cellule ovali, abbiamo l'ellissocitosi ereditaria.
• Possiamo trovare i basofili con tutta una serie di punteggiature all'interno, che corrispondono all'inglobamento di piombo (o altri metalli pesanti): il soggetto avrà, quindi, un'intossicazione da piombo.
• L'aumento degli eosinofili evidenza la presenza di un'allergia.
• Una diminuzione dei neutrofili, con un aumento dei linfociti sottolinea la presenza di una patologia che prende il nome di agranulocitosi (sottolinea il fatto che sta diminuendo la quantità di granulociti).
• Se incontriamo dei rouleaux, ossia delle macchie rosse costituite da agglomerati di eritrociti, siamo di fronte o ad un mieloma multiplo o ad una macrogobulinemia.
• Se ci troviamo di fronte alla presenza di alcune cellule target (sono cellule a forma di bersaglio, con delle stratificazioni colorate), ciò può dare un'indicazione diagnostica specifica.