Appunti di Biochimica Generale - modulo 1

Strutture secondarie e formazione di elementi funzionali

Già la formazione degli elementi della struttura secondaria porta alla formazione delle catene laterali degli aa in una sorta di elementi minimi che rispondono a una certa funzionalità della nostra proteina (per esempio anfifilifia). La betalattoglobulina è una proteina di trasporto delle sostanze idrofobiche nel latte bovino e un importante allergene alimentare. È una catena di aa avvolta in modo da generare una struttura globulare (162 aa messi in fila). Serve a trasportare i nutrienti dalla vacca al vitellino attraverso le molecole di trasporto contenute in una cavità.

Il primo elemento più evidente di struttura secondaria è la regione ad alfa elica, ma anche elementi quali il foglietto pieghettato che formano il classico “barile beta”. Osservando la regione ad alfa elica, possiamo notare che la tengono insieme dei legami a H tutti con lo stesso orientamento (co destra, nh sinistra). All’interno del “cilindro” non c’è nessun legame. Tutti i residui idrofobici sono disposti al di fuori per proteggere la molecola dall’azione di competizione dell’acqua nei confronti dei legami a H.

Alcuni residui contengono gruppi polari come carbossili, funzioni amminiche come lisine o arginine, oppure amminoacidi con gruppi aromatici. Il resto della proteina sta dalla parte dei residui polari o non polari? Essendo una regione anfifilica, i residui non polari sono rivolti verso la proteina lontani dall’acqua, mentre quelli polari sono sulla superficie della proteina in modo da interagire con il solvente.

Cosa succede nel caso di una proteina beta sheet? (con filamenti antiparalleli) Anche in questo caso abbiamo una regione anfifilica, quindi i residui non polari saranno all’interno, mentre quelli polari all’esterno. Parlando di elementi di struttura secondaria, è importante la posizione di famosi aa destabilizzanti nei confronti degli elementi di struttura secondaria come prolina e glicina.

Le proline sono quasi esclusivamente nelle porzioni dove c’è un turn (no loop perché i beta sheet sono antiparalleli) nelle porzioni in cui la struttura si ripiega. Tutte le molecole di glicina sono al di fuori di elementi di struttura secondaria in regioni che non hanno una loro struttura secondaria.

Come gli elementi di struttura secondaria possono interagire tra di loro per formare una struttura complessa e dotata di funzionalità?

Per compattare gli elementi di struttura secondaria in un qualcosa che può svolgere una funzione, occorre ragionare sulla struttura terziaria.

Struttura terziaria

È stabilizzata dalle interazioni che si possono stabilire tra le catene laterali di amminoacidi. I legami sono segnati in ordine di robustezza, da quelli più difficili a quelli più facili.

• Legami covalenti (disolfuro) uno di questi è formato dalla congiunzione ossidativa delle funzioni tioliche di due residui di cisteina.
• Legami idrofobici tra catene laterali apolari un legame idrofobico è conseguente alla spinta di natura entropica che l’acqua esercita per minimizzare il contatto tra solvente (acqua) e regioni apolari di una qualunque molecola. Nei casi di proteine i residui idrofobici tendono a venire allontanati il più possibile dall’interazione con il solvente e a stare intaccati gli uni vicino agli altri (lontani dal solvente). L’impaccamento di catene laterali di aa apolari noi lo chiamiamo legame idrofobico all’interno della proteina.
• Legami di coordinazione (con specie metalliche es. ferricianuro di potassio) una specie metallica crea questi legami con delle funzioni chimiche opportune. Nel caso delle proteine può essere la funzione midazolica della catena laterale di istidina. Questi legami stabilizzano la struttura perché se più regioni della stessa molecola si collegano a questo ione metallico, noi riusciamo a fare un nodo che avvicina elementi di struttura secondaria.
• Legami ionici interazioni che si stabiliscono tra catene laterali di aa carichi positivamente (esistidina) e catene laterali di aa negativi (aspartato e glutammato). Abbiamo a che fare con legami la cui solidità cambia a seconda del pH, perché se io sposto il pH rischio di non avere più alcune delle cariche coinvolte in questo processo di interazione.
• Legami a idrogeno gruppi coinvolti in questi legami a H sono quelli delle catene laterali.
• Inglobamento all’interno della struttura di elementi che non sono aa (non sono neanche semplici ioni come calcio e ferro) ma sono strutture sia organiche che inorganiche che si infilano nella nostra proteina stabilizzandone la struttura.

Nel caso della betalattoglobulina noi utilizziamo i legami di solfuro per stabilizzare questa struttura a barile. Nella proteina ci sono 5 cisteine, 4 di queste formano dei legami disolfuro. Resta così una cisteina libera, la cisteina 121, importante perché essendo reattiva va incontro a vari fenomeni.

Gli agglomerati di strutture idrofobiche al centro delle proteine sono chiamati “core idrofobico”. C’è anche una tasca idrofobica sulla superficie della proteina che è formata dall’interazione tra le catene laterali di aa in due diverse regioni di struttura secondaria.

L’albumina serica (fatta da 661 aa, è nel nostro plasma sanguigno) è importante perché trasporta gli acidi grassi dal tessuto adiposo ai tessuti che li utilizzeranno. Questa proteina è formata da due lobi e ciascuno di questi lobi è molto rigido. Ci sono 34 residui di cisteina e tutti e 34 partecipano ai legami disolfuro struttura terziaria stabilizzata da 17 legami disolfuro. Questo serve per formare le due metà del “panino hotdog” in cui metteremo il nostro salsicciotto (acidi grassi).

Rubredossina proteina (60 aa) che contiene un atomo di ferro coordinato da 4 cisteine. L’atomo di ferro attira a sé le 4 cisteine rendendo stabile questo tipo di struttura.

Li formiamo tra aa veri e propri ci sono casi in cui catene laterali dello stesso segno si attirano invece di respingersi, perché? Ci mettiamo in mezzo un qualcosa che loro possono condividere come uno ione calcio. C’è una situazione in cui questo giochino di attrazione tra cariche di segno opposto e repulsione tra cariche dello stesso segno può venir meno per la presenza di alte concentrazioni saline se noi mettiamo sale sulla carne, andiamo a generare ioni na+ e ioni cr-. Se io ho un residuo di glutammato che stava reagendo con una molecola di lisina e si trova degli ioni sodio, si concentrerà su questi ultimi.

Domini e strutture supersecondarie

In anni recenti si è riconosciuta la presenza nelle strutture terziarie di unità strutturali che non sono ancora l’intera struttura, ma porzioni (elementi di struttura secondaria) organizzati come unità dipendenti domini strutturali.

Un dominio strutturale è un’unità di struttura terziaria che deve godere di alcune proprietà:

• Deve essere intrinsecamente stabile anche se non c’è il resto della molecola.
• Di solito questi domini sono responsabili di una certa funzione (es. riconoscere una molecola o svolgere catalisi). Il significato di questa operazione è quello di poter ottenere una proteina con più di una funzione scambiando i domini tra una proteina e l’altra.

Questo concetto di intercambiabilità lo vediamo molto spesso in una serie di proteine proteine di “fusione”. Rubredossina + emeritrina = rubreritrina (serve a consentire a batteri che vivrebbero senza ossigeno a vivere anche se c’è ossigeno presente come “inquinante” nel mezzo in cui vivono). Questa situazione la incontriamo anche in proteine che contengono cofattori (componenti non proteiche destinate a svolgere una certa funzione come funzione catalitica o di trasporto). Molte di queste proteine contengono sia una parte che lavora e una che tiene fermo il pezzo dal lavorare che definiamo dominio di legame della molecola da trasformare (dominio di legame del cofattore + dominio di legame del substrato). Proteine di deposito (per fare pane e pasta, proteine con funzione meccanica) contengono domini ripetitivi, cioè elementi di struttura terziaria ripetuta più di una volta.

Struttura quaternaria

Ogni volta che una certa specie proteica è presente come associazione permanente di polipeptidi distinti tra di loro, possiamo parlare di struttura quaternaria. Nel caso in cui tutti i polipeptidi sono uguali tra di loro noi parliamo di omopolimeri. Nel caso in cui i polipeptidi siano diversi tra di loro allora parliamo di eteropolimeri. I legami che tengono insieme queste associazioni di catene polipeptidiche sono le stesse interazioni tra catene laterali di aa che tengono insieme la struttura terziaria. Lo scopo di avere queste strutture così complicate in cui associo più proteine:

• Creare nuovi siti funzionali
• Associazione tra funzioni diverse
• Regolazione dell’attività
• Trasmissione di segnali frequente in proteine meta fuori la cellula e metà fuori la prima (quella di fuori deve far sapere a quella interna cosa sta succedendo)
• Formazione di macrostrutture complesse finalizzate a trasporto di materiali tra comparti, cellule, tessuti, interconversione dell’energia chimica, elettrica, meccanica, luminosa e informazionale.

ATPasi mitocondriale subunità diverse sono usate per formare una struttura a “trottola”, in grado di ruotare sull’asse formato dalla lunga struttura ad alfa-eliche parallele.

Come fanno a formarsi queste strutture se le proteine nascono tutte come dei fili e vanno avvolti a creare strutture complesse?

Il processo che porta da polipeptide a proteina correttamente ripiegata, si chiama processo di “folding”. La catenella viene ripiegata fino ad ottenere la struttura terziaria che le consente di svolgere funzioni. Folding può avvenire in due modi:

• Processo spontaneo: la formazione degli elementi di struttura secondaria, degli eventuali domini e di una complessiva struttura terziaria è un processo spontaneo. Esperimento di Anfinsen ha preso proteina RNasi e ne ha distrutto la struttura terziaria utilizzando degli agenti denaturanti o cautropi che rompono i legami idrofobici (urea, nh₂conh₂, ha concentrazioni molto elevate fino a 12 M in acqua). I legami disolfuri vengono rotti attraverso il tiolo generando 8 residui di cisteina. Di conseguenza la mia proteina è un filo anfinsen ha preso questa soluzione e ha eliminato i suoi elementi (urea e tiolo). Da questo, in condizioni rinaturante, la mia proteina spontaneamente riforma la struttura iniziale. Questo perché la struttura terziaria è la struttura che corrisponde alla minima energia possibile.
• Processo assistito: si ha bisogno di macchine che aiutano a dare forma. Senza dispendio di energia sono di due tipi, uno che richiede delle proteine che aiutano il filamento ad acquisire la sua struttura migliore e uno per cui l’assunzione della struttura viene facilitata dall’inserimento di opportuni cofattori organici o inorganici. Proteine aiutanti PDI (proteina disolfuri isomerasi) che nella sua forma ossidata contiene un legame disolfuro, vede un tiolo sulla proteina da ripiegare e fa uno scambio di disolfuri tra il suo disolfuro e questo tiolo. Formatosi questo disolfuro interproteina, libera un tiolo su PDI. Poi ulteriore scambio e la struttura è fatta.

Un’altra funzione di PDI è quella di “mending” aggiusta le proteine in cui i legami disolfuro non sono nel punto giusto sempre attraverso scambi di disolfuro. Con dispendio di energia chimica sotto forma di ATP Chaperoni molecolari sono le macchine che sorvegliano sul processo. Nella cavità in basso c’è cavità idrofobica in cui si adagia la nostra proteina. Alla porzione sopra si attacca una molecola di ATP che fa ruotare le porzioni sottostanti come se fosse una pressa. Questa rotazione costringe la proteina ad associare le sue regioni idrofobiche. Una volta che le regioni idrofobiche della proteine si sono impaccate e hanno formato il “core idrofobico” (nocciolo in cui l’acqua non può penetrare), il resto della struttura viene da se. L’ATP fa fare un altro giro alla struttura e la proteina che ora ha ripiegato all’interno le sue regioni idrofobiche viene rilasciata e il suo posto viene preso da una proteina che riesce ad interagire con la cavità idrofobica.

Struttura proteine: collagene e emoglobina

Il collagene è la principale proteina del tessuto connettivo, che conferisce solidità ai nostri denti, alle nostre arterie, e consente la trasmissione della forza esercitata dai muscoli.

Le proprietà meccaniche del collagene – una associazione permanente di tre catene di tropocollagene (-x-pro-gly-x-hyp-gly-) – dipendono dalla sua sequenza e dalla sua struttura, che sono in reciproca relazione, e da modificazioni post-traduzionali, come quelle che portano alla formazione di idrossiprolina. La stabilizzazione della “tripla elica” da soli legami a idrogeno intercatena rende la struttura “fragile”.

Se il tessuto contiene il collagene deve sopportare sforzi meccanici di una certa intensità, occorre “irribustire” la struttura della proteina formando legami covalenti trasversali (cross-links) tra i singoli filamenti di tropocollagene in un ulteriore evento di modificazione post-traduzionale, distinto da quello che ha portato alla formazione di idrossiprolina.

Questi legami trasversali possono essere presenti:

• All’interno di ciascuno filamento
• Tra diversi tripli filamenti

Per formare legami covalenti trasversali (cross-links) tra i filamenti di tropocollagene è necessario ossidare una parte dei residui di lisina nella sua sequenza, rimuovendo il gruppo amminico e ossidando il carbonio ad aldeide. Questa formazione si chiama allisina, questa funzione aldeidica reagisce con un altro residuo di lisina formando una base di Schiff che viene poi stabilizzata in un passaggio di riduzione. Posso anche ossidare due molecole di lisina e fare tra due aldeidi la condensazione aldolica.

La reazione che ossida la lisina in allisina avviene utilizzando l’ossigeno molecolare e questa reazione non avviene se dentro queste cellule dove il collagene viene modificato, non abbiamo presente un composto di derivazione alimentare (acido ascorbico, vitamina C). Se non abbiamo una sufficiente assunzione di acido ascorbico, andiamo incontro a una patologia nota come scorbuto. I sintomi più comuni sono:

• Facilità alla caduta dei denti: i denti sono alloggiati dentro l’osso tramite il tessuto connettivo. Se quel collagene non è stato irrobustito dalla formazione di legami trasversali, la colla che tiene il dente al suo posto è cedevole e la carenza di vitamina C porta alla facilità della perdita di denti.
• Permanenza delle ecchimosi (ematomi): fragilità dei capillari.
• Facilità con cui si verificano episodi di epistassi (es. sangue dal naso).

Perché? Queste sintomatologie sono legate alla fragilità del collagene. Il processo di formazione di questi legami trasversali all’interno della tripla elica e tra le diverse triple eliche è un evento che noi definiamo “Age Progressive”.

• Il collagene nei bambini è pochissimo cross-linkato. Con il crescere dell’età aumenta. Per questo si dice che i bambini hanno “ossa di gomma”.
• Questo progressivo consolidamento del collagene ci spiega perché gli animali giovani sono più teneri degli animali vecchi (la loro carne). Questo perché il tessuto connettivo deve sostenere una massa più grossa per il manzo.
• Noi usiamo il collagene per fare la comune gelatina.

Abbiamo due tipi di colla derivante dal tessuto connettivo animale (colla di pesce per gelatina e colla d’osso per incollare i mobili). Tra le fibrille di collagene della colla di pesce non ci sono legami covalenti perché deriva dal pesce il quale non ha bisogno di un collagene cross-linkato perché non deve sostenere il peso del suo corpo (in quanto in acqua il suo peso è pari a 0).

Come viene fabbricata questa proteina?

È un processo non spontaneo, che prevede una sequenza di modificazione post-traduzionali che avviene in diversi comparti della cellula. L’assemblaggio delle triple eliche di tropocollagene nella struttura a fibrilla capace di sopportare sollecitazioni meccaniche avviene nello spazio extracellulare, dove vengono formati anche i legami covalenti “trasversali”.

• L’altro passaggio è l’aggiunta di zuccheri glicosilazione.
• Dopo la mezza formazione della proteina, esce dalla cellula che la fa e da qui completa il processo di formazione (taglio proteolitico e formazione dei legami trasversali tra i singoli filamenti a tripla elica).
• Per formare una treccia servono un punto di ancoraggio in cui i singoli fili siano fermi, delle estremità libere che possano avvolgersi tra loro e un sistema di chiusura della struttura quanto essa è formata (come fare una treccia per capelli).

I residui di allisina sono una famiglia di proteina che servono a dare elasticità alle nostre articolazioni. Questa funzione viene svolta creando delle vere e proprie strutture a rete i nodi di questa rete sono il prodotto della condensazione di quattro molecole di allisina (lisina ossidata). Così otteniamo delle strutture tridimensionali elastiche, comprimibili ed estensibili.

I diversi livelli di struttura proteica al lavoro: proteine di trasporto e stoccaggio, emoglobina e mioglobina

Quasi tutti i vertebrati hanno dei polmoni. L’emoglobina si carica di ossigeno, arriva ai tessuti...