Appunti primo modulo di Biochimica e Analisi Biochimica degli Alimenti

Appunti di biochimica generale (mod.1) AA 2017-2018

Gli enzimi

Proteine con scopo di velocizzare le reazioni chimiche. Da sottolineare che non sono reagenti (non si modificano) ma solo catalizzatori. Essendo catalizzatore, non può avere capacità di rendere spontanea una reazione, ma intervengono abbassando il gap di energia di attivazione, abbassando il livello energetico dello stato di attivazione. Non modifica il ΔG della reazione, ma solo quello dell'energia di attivazione.

Le reazioni catalizzate dall'enzima avvengono fra substrati, in una reazione enzimatica, il substrato si lega in modo reversibile all'enzima formando un complesso enzima-substrato. (Ricordiamo che essendo reversibile è una reazione in equilibrio con una costante k che la governa). I substrati si posizionano sul sito attivo, che è fisicamente la parte dell'enzima in grado di legare e catalizzare. Ha due proprietà: oltre a catalizzare la reazione, è in grado di riconoscere il substrato da legare, perché gli enzimi sono specifici, quindi possono catalizzare solo su un preciso substrato.

Esistono due modelli per descrivere il sito attivo:

• Chiave-serratura: prevede un sito attivo con la forma esatta che permette il legame del substrato. È un modello superato, perché se fosse così non spiegherebbe la catalizzazione ma solo il legame.
• Adattamento indotto: tiene conto del fatto che le proteine sono flessibili, quando il substrato si lega provoca un cambio conformazionale (es. ossigeno emoglobina). Solo la proteina con la nuova conformazione catalizza, e poi a trasformazione avvenuta ritorna alla vecchia conformazione.

Gli amminoacidi che chimicamente catalizzano la reazione non si trovano vicini nella catena primaria, ma si avvicinano nella terziaria quando il substrato modifica la conformazione del sito attivo.

Misura della velocità di reazione

Si guarda la velocità in cui aumenta la concentrazione di prodotto in moli/minuto. Questa velocità è uguale in senso opposto a quella di consumo del substrato. Invece è direttamente proporzionale alla concentrazione del complesso attivo enzima-substrato. La velocità è determinata da una costante cinetica kcat per la concentrazione del complesso. La kcat è una proprietà specifica di ogni enzima.

Quindi aumentando la quantità di substrato, aumenterà direttamente anche la velocità di reazione ma l'enzima non è infinito, il totale di E è dato dagli enzimi in forma libera più i complessi enzima-substrato. Aumentando la concentrazione di enzima-substrato diminuisce la quantità di enzimi liberi. Quindi la quantità di enzimi totali è la velocità massima ottenibile nella catalisi.

Gli enzimi che presentano struttura quaternaria, sono enzimi cooperativi e presentano un andamento di velocità di reazione sempre tendente alla velocità massima, ma in modo sigmoide. In un grafico in cui rappresentiamo la quantità di prodotto e il tempo, la curva è simile agli enzimi non cooperativi, e la velocità di reazione è pari alla tangente di un determinato punto. All'inizio è molto alta (massima concentrazione di substrato), alla fine la tangente è quasi orizzontale, velocità bassa (substrato finito). Si può incrociare la quantità di substrato.

Enzimi non cooperativi

Andamento iperbolico tendente alla velocità massima. L'Equazione di Michaelis-Menten descrive la velocità in funzione della concentrazione di substrato degli enzimi non cooperativi. Oltre alla velocità, fa intuire l'affinità dell'enzima per il substrato.

La Km rappresenta la precisa concentrazione di substrato in cui la velocità di reazione è esattamente la metà della velocità massima. Ogni enzima avrà la sua Km in cui la sua velocità è la metà della massima. Più la Km è minore, più l'enzima è affine al suo substrato. Oltre alla quantità di substrato è importante anche la quantità di enzima totale che rientra nella reazione.

Quindi la velocità di una reazione ad una data concentrazione di substrato, è direttamente proporzionale alla quantità di enzima. Dall'equazione sembrerebbe che la reazione sia irreversibile, ma è solo una semplificazione per lo studio dei modelli: gli enzimi non influiscono sulla spontaneità o meno del processo, quindi alcuni enzimi potrebbero catalizzare anche la reazione contraria.

Inibitori

Molecole che, appunto, inibiscono l'attività dell'enzima rallentandola o fermandola. Si dividono in inibitori irreversibili (si legano covalentemente all'enzima e non si staccano) o reversibili (possono staccarsi ripetendo n volte l'operazione), più importanti biologicamente e chimicamente: reversibili competitivi e reversibili non competitivi.

• Reversibili competitivi: è una molecola chimicamente simile al substrato che quindi si lega al sito attivo dell'enzima, impedendo il suo legame e impedendo la catalisi. Essendo due equilibri (enzima-substrato e enzima-inibitore), competono fra di loro e il "funzionamento" dipende dalla concentrazione di uno o dell'altro. La velocità massima della soluzione non cambia, perché è data solo dalla quantità di enzima totale: aumentando la concentrazione di substrato, questo prevarrà sull'inibitore e si legherà su tutto l'enzima disponibile raggiungendo la velocità massima, semplicemente in presenza di inibitore, l'enzima è meno affine al substrato.
• Reversibili non competitivi: si lega all'enzima ma non nel sito attivo, in un sito apposito, quindi il substrato è libero di legarsi comunque al sito attivo. Il suo effetto è quello di ridurre l'efficienza catalitica dell'enzima. Ovvero rende più piccola la velocità massima. In questo caso viene influenzata la velocità massima, perché agisce direttamente sulla capacità dell'enzima. La curva nel grafico rimane uguale ma con più basso. La Km non varierà ma varia il suo valore effettivo perché diminuisce la velocità massima. In altre parole cambiano le y ma non le x nel grafico.

Enzimi cooperativi o allosterici

Il loro andamento ha forma sigmoidale dovuto alla struttura quaternaria: il substrato deve modificare la struttura tridimensionale, quindi inizialmente fa più fatica e poi si lega più facilmente. La struttura quaternaria ha due conformazioni, di cui una lega più facilmente il substrato. Vengono chiamati anche allosterici perché a tutti gli effetti sono proteine con proprietà allosteriche: e oltre ai siti attivi, hanno dei siti specifici per degli effettori allosterici: delle molecole esterne in grado di modulare l'attività di questi enzimi, stabilizzando una delle due conformazioni quaternarie.

Effettori allosterici

Delle molecole estranee ai prodotti dell'enzima, e soprattutto con caratteristiche chimiche diverse dai substrati (quindi non possono entrare in competizione nel sito attivo), possono influenzare l'attività dell'enzima legandosi e modificando la struttura quaternaria. Gli effettori allosterici possono attivare o inibire l'enzima, con effetto di inibizione a feedback o attivazione a feedback.

Sistema a feedback

L'ultimo prodotto di una via metabolica inibisce o attiva il primo enzima della stessa via quando aumenta o diminuisce la sua concentrazione (o di un terzo: aumenta la concentrazione di ATP per far partire la via metabolica di CTP). Viene attuato per ottimizzare le vie metaboliche. Esempio: ATCasi, aspartato-trans-carbamilasi.

Parametri che influenzano la velocità in vitro e in vivo

• Concentrazione del substrato
• Concentrazione di enzima
• Temperatura, pH, forza ionica (in vitro)
• Presenza di inibitori (applicabili ai non cooperativi) o effettori (applicabili ai cooperativi)

In vivo la temperatura e il pH sono costanti, quindi non si possono usare per modificare la velocità. La concentrazione di enzima si può modificare tramite il metabolismo (ad esempio alcol deidrogenasi aumenta con il consumo di alcool: enzimi inducibili), d'altra parte gli enzimi vengono anche degradati. Un altro fattore regolabile è la quantità di prodotto/substrato: i prodotti e i substrati, nelle catalizzazioni reversibili (quindi con equilibria inferiori a 1) e quindi non controllate, devono rimanere in equilibrio, in caso di presenza di tanti substrati interviene l'enzima a ristabilire l'equilibrio.

Gli inibitori e effettori regolano le reazioni con K superiore a 1 e ΔG negativo, perché sono reazioni che normalmente in vivo sarebbero irreversibili, di conseguenza non regolabili dall'equilibrio dei prodotti e reagenti. Un altro sistema per regolare gli enzimi è la reazione di fosforilazione, classica del metabolismo. La fosforilazione unisce un gruppo fosfato (proveniente da ATP) tramite un legame covalente ad un amminoacido (es. fosfoserina nelle modificazioni post-traduzionali). La proteina, da neutra, acquisisce carica negativa del fosfato, che porterà a modificazioni strutturali e di conseguenza influenzerà l'attività dell'enzima.

È una reazione reversibile: l'enzima può essere fosforilato o defosforilato tramite l'azione di altri enzimi (meccanismo a cascata) coordinati dagli ormoni. Esempio: glicogeno fosforilasi, enzima regolato sia da fosforilasi sia da effettori allosterici specifici (quindi cooperativo, struttura quaternaria). Svolge ruolo fondamentale nella regolazione del glucosio nel sangue, prelevando unità di glucosio dal glicogeno. Il processo principale per passare da forma inattiva a attiva avviene tramite fosforilazione, a sua volta attivata da un ormone che spinge un altro enzima a fosforilare la glicogeno fosforilasi (inattiva quella senza gruppi fosfati), liberando 2ADP. Tutto questo processo è relativamente lento per l'organismo, quindi viene affiancato da una regolazione tramite effettori allosterici, specifici per la forma fosforilata e per quella no. Il glucosio stesso è un effettore allosterico che inibisce in modo immediato la forma fosforilata, per bloccare il processo in caso di suo accumulo. ATP e AMP sono indicatori del livello energetico della cellula e agiscono, invece, come effettori per la forma non fosforilata: ad un livello energetico alto, quindi tanto ATP, quest'ultimo inibisce l'enzima, mentre l'accumulo di AMP lo attiva.

Enzimi pancreatici

Vengono prodotti in forma non attiva, tipo chimotripsinogeno, ecc. (tramite proteolisi altrimenti si autodigerirebbe o digerirebbe la cellula) e vengono attivati in modo covalente solo all'interno dell'intestino. La modificazione che permette l'attivazione dell'enzima è un taglio proteolitico all'interno della sua catena amminica, cioè subisce idrolisi di alcuni legami peptidici. Questo meccanismo viene definito autoproteolitico a cascata: ovvero un enzima attivo può digerire le proteine introdotte nell'intestino, ma può "digerire" e effettuare i tagli proteolitici sugli enzimi inattivi.

Definizioni

Gli enzimi sono tantissimi e specifici per substrati numerosissimi, quindi vengono chiamati con nomi sistematici. I nomi sistematici si compongono dai substrati utilizzati e la reazione catalizzata (es: ATP glucosio fosfotransferasi). Altrimenti viene utilizzata una classificazione enzimal commission di 4 cifre (es: Ec 2.7.1.1). La prima cifra indica il tipo di reazione catalizzata. Attività enzimatica: espressa in Unità di Attività UA o UI.