Appunti Metodologie biomolecolari

PLASMIDI

Sono vettori che vengono utilizzati nei laboratori in quanto sono più versatili. Sono molecole di DNA circolare batteriche. Una volta ottenuta la molecola di DNA ricombinante, essa deve essere inserita all'interno delle cellule batteriche per poter essere propagate. Questo processo prende il nome di TRASFORMAZIONE, ossia l'introduzione di DNA nudo (senza alcun rivestimento) all'interno di una cellula batterica.

Come fa ad entrare all'interno delle cellule batteriche? Si è osservato che in presenza di cloruro di calcio (CaCl2) le cellule batteriche acquistano la competenza di incamerare il DNA nudo se sottoposte ad un breve shock-termico. E. coli, cioè le specie di a 4°C vengono miscelate con il plasmide (in cui vi è il DNA target) ed in presenza di CaCl2 se poste a 42°C per 1 minuto, per poi riportare la T a 4°C, acquistano la competenza di incamerare il DNA nudo.

Un'altra metodologia si chiama ELETTROPORAZIONE.

sola replicazione del cromosoma.

A cosa serve il plasmide ad un batterio?

I plasmidi contengono importanti geni che codificano per enzimi di restrizione, produzione di tossine, produzione di composti organici complessi e per la resistenza agli antibiotici.

Quali sono le caratteristiche desiderabili dei plasmidi come vettori di clonaggio?

Le caratteristiche desiderabili dei plasmidi sono:

• Basso peso molecolare che ne agevola la TRASFORMAZIONE;
• La replicazione rilassata;
• La capacità di conferire all'ospite un fenotipo facilmente selezionabile (es: resistenza ad un particolare antibiotico) - l'ospite, in questo caso il batterio, deve avere un fenotipo utile che viene acquisito tramite incameramento del plasmide, ad esempio la resistenza all'ampecillina;
• Devono avere siti unici per un ampio numero di enzimi di restrizione possibilmente posti all'interno che conferisce un fenotipo facilmente identificabile (INATTIVAZIONE INSERZIONALE), tramite:

Wild-type e batteri con plasmidi interessano i batteri con all'interno il plasmide che ricombinanti. A noi possiede la resistenza alle tetracicline, per cui prendo la piastra, ne faccio una copia tramite un filtro e li metto:

- in una piastra contenente TET+ ove soppravvivono tutti i batteri tranne quelli senza plasmide;

- e quest'ultima colonia la metto in una piastra contenente TET+ e AMP+ Wild-type.

Che mi consente di far vivere solo il Wild-type.

Alla fine del lavoro, quello che ci interessa è selezionare i batteri resistenti alle tetracicline e sensibili alle ampicilline, questo lo faccio confrontando le ultime due piastre, e in base ai pezzi mancanti so quali sono i ricombinanti (dato che nelle seconda piastra questi ultimi muoiono) in vivo

2) ALPHA-COMPLEMENTAZIONE -> in generale, il gene lacZ codifica per l'enzima B-galattosidasi che consente di utilizzare il lattosio in assenza di glucosio come fonte energetica.

In vitro l'attività di questo enzima può

essere saggiata tramite la conversione di un substrato incolore in un prodotto interamente in blu. Come si fa a misurare l'attività in vitro della B-galattosidasi? Si fornisce un substrato artificiale, ossia l'X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galattoside). L'enzima B-galattosidasi taglia il legame liberando il galattosio e cifornisce il 5-bromo-4-cloroindossile che è intensamente colorato di blu. Questo metodo è utilizzato nei plasmidi pUC (university California), il quale è un'evoluzione del pBR322. In questo plasmide pUC, i siti unici di restrizione sono stati sistemati in batteria in una zona chiamata siti di policlonaggio o MCS (multiple cloning site). Il gene lacZ è localizzato all'interno del cromosoma batterico, esso può essere mutato, in particolare può essere deleta (cancellata) la porzione che codifica per l'estremità amino-terminale dell'enzima facendo rimanere

Interesse sono invece le colonie bianche quelle in cui la ALPHA-COMPLEMENTAZIONE non è avvenuta. Un caso particolare si ha quando estendiamo la PCR per 10 min a 72°C, poiché la taq-polimerasi inserisce nei prodotti di PCR alle due estremità 3' le adenine. Alcune aziende costituiscono plasmidi che hanno l'estremità 5' con le timine, per cui in base alla complementare inserendo questi prodotti di PCR all'interno di questi plasmidi otterremo il ricombinante. Questo ricombinante prende il nome di TA-CLONING.

FAGO LAMDA è un batteriofago, ossia un virus dei batteri. Presenta un capside proteico con all'interno una molecola di DNA a doppia elica lineare di circa 50 kb, hanno una coda contrattile e fibre per l'adesione alla cellula batterica. Il ciclo biologico del fago lamda aderisce al batterio tramite le fibre. Per infettare la cellula batterica, inserisce solo il materiale ereditario e le porzioni esterne chiamate ombre.

(parti proteiche) rimangono fuori.Il materiale ereditario (DNA) che entra nel batterio è rivestito da una porzione proteica. A questo punto il DNA può seguire due vie:

1. VIA LISOGENICA in cui il DNA rimane nel cromosoma batterico in modo asintomatico fino a quando non c'è una situazione di stress. Per ogni moltiplicazione del cromosoma si replica anche il DNA del virus.
2. VIA LITICA ove tutte l'apparato riproduttivo del batterio si mette a disposizione del fago, per cui l'acido nucleico si replicherà moltissime volte; anche la sintesi proteica del batterio produrrà il capside, la coda e le altre porzioni proteiche del fago. Quando il batterio è esausto il virus si espanderà nel tessuto colturale.

Il DNA del fago lamda ha le estremità appiccicose (stichy-ends), alternando tratti lineari con tratti circolari. Le porzioni con le stichy-ends sono chiamate COS. Durante la replicazione si hanno tratti lineari seguiti da tratti

circolari ossia iCOS.I siti COS sono tagliati dall'endonucleasi A facendo diventare il filamento di DNA lineare.Il DNA del fago lamda presenta una porzione centrale chiamate B2 la quale non è essenziale venendo eliminata.Oltre al tratto B2 è eliminata anche la sequenza integrazione e scissione, ossia vengono eliminate le parti non necessarie quindi quelle che conferiscono via lisogenica.I vettori lamda al posto della regione B2 e dell'altra regione (integrazione e DNA estraneo scissione) inseriscono in modo da farlo diventare ricombinante.Se a questo plasmide ricombinante si fornisce un estratto di ombre, esso si ricostituirà il fago. Se questo nuovo fago lo inseriamo nel batterio esso si replicherà e quando nella piastra avrò la placca otterrò una concentrazione di DNA omogenea.

Definizione di placca: la placca corrisponde ad un'elevata concentrazione di DNA fagico omogeneo derivante da un'unica infezione.

COSMIDII: i cosmidi sono