Appunti Metodologie biomolecolari

Metodologie biomolecolari

Introduzione

Il DNA è il materiale fondamentale per la conservazione e il trasferimento dell’informazione genetica da una generazione alla successiva. Il DNA ha la funzione di conservare l’informazione genetica trasferendola da una cellula all’altra tramite la riproduzione, ed anche la funzione di trasferire l’informazione genetica alla generazione successiva tramite riproduzione sessuata o asessuata.

Un'altra funzione del DNA è quella di manifestare il suo effetto e per questo richiede la “copiatura” in una molecola di RNA e la traduzione in una proteina. Questo rappresenta il dogma centrale della biologia molecolare, ovvero l’informazione genetica è trascritta in una molecola di RNA e poi tradotta in proteina.

Fondamentale è una netta differenza che vi è tra il flusso dell’informazione genetica nei procarioti e negli eucarioti. Nei procarioti il flusso è legato spazio-temporalmente ovvero non essendoci il nucleo la trascrizione e la traduzione avvengono nel citosol (citoplasma) nello stesso momento. Negli eucarioti, invece, il flusso è separato spazio-temporalmente poiché vi è la presenza del nucleo e il DNA non fuoriesce da esso.

Le analisi che vengono eseguite ultimamente sono delle analisi globali quindi si ritroveranno a studiare il genoma, successivamente il trascrittoma (analisi di tutto l’RNA trascritto), il proteoma (analisi di tutte le proteine) ed infine il metaboloma ovvero il pool [insieme] di metaboliti che costituiscono la cellula.

Com’è fatto il DNA?

Il DNA o acido desossiribonucleico è un polimero di nucleotidi, in particolar modo di deossiribonucleotidi costituiti a loro volta da 3 componenti:

• Zucchero pentoso nella forma beta-furanosica (ad anello); tale zucchero è il 2’ deossiribosio (nella posizione 2 vi è l’idrogeno).
• Acido orto-fosforico, legato al carbonio 5’ tramite un legame anidridico. Grazie a questo gruppo che porta cariche negative il DNA è acido.
• Base azotata che sono legate con legami beta glicosidico al carbonio 1’. Si dividono in purine (adenina, guanina) le quali sono bicicliche e si legano allo zucchero con l’azoto in posizione 9; e pirimidine (citosina, timina, uracile [RNA]) le quali sono monocicli e si legano allo zucchero con l’azoto 1.

I nucleotidi sono legati attraverso un legame fosfodiestere che lega il gruppo 3’ OH con il gruppo 5’ del nucleotide successivo. Tale legame dal punto di vista chimico è un attacco nucleofilo del gruppo 5’ al gruppo 3’ con la perdita di una molecola di H₂O e con la formazione di un legame estere. Questo legame, però, è diestere poiché uno è quello di vecchia formazione, mentre l’altro è quello appena formato.

La catena di DNA inizia con una molecola 5’ fosfato libero e termina con l’estremità 3’ OH libera che rappresentano la testa e coda del DNA. Lo scheletro è dato dallo zucchero e dal gruppo fosfato, mentre la biodiversità è data dalle basi azotate.

Struttura secondaria del DNA

Il DNA è costituito da un doppio filamento a doppia elica. I due filamenti sono antiparalleli, ovvero che mentre uno scorre in posizione 5’-3’, l’altro scorre in posizione 3’-5’, e complementari ovvero che ad ogni A corrisponde una T con un doppio legame H, e ad ogni C corrisponde una G con un triplo legame H. Il legame idrogeno si forma quando due molecole condividono un atomo di idrogeno. L’andamento della doppia elica è destrogiro.

I palindromi sono delle sequenze che si ripetono sul DNA seguendo un doppio asse di simmetria, ovvero la sequenza subisce due rotazioni da sinistra a destra, e dall’alto verso il basso.

T T A G C A C G T G C T A A
A A T C G T G C A C G A T T

Queste sequenze sono auto complementari, cioè se il singolo filamento si rompe si lega e si chiude su se stesso. Questa struttura è detta HAIRPIN (forcina). Se sul DNA esistono delle sequenze che possono essere sovrapposte secondo un asse di simmetria si parla di ripetuto speculare.

T T A G C A C C A C G A T T
A A T C G T G G T G C T A A

Nelle cellule il DNA è impacchettato grazie a proteine istoniche e non-istoniche.

RNA

Gli RNA sono costituiti da un unico filamento elicoidale quindi non hanno una struttura secondaria a differenza del DNA, e alle volte si possono ripiegare su se stessi grazie alle leggi dell’auto complementarietà. Si differenzia dal DNA per la presenza dell’U al posto della T e del ribosio (posizione 2’ OH) al posto del deossiribosio e del 2' H. Gli RNA sono importanti nella trascrizione in cui entrano in gioco 3 classi:

• RNA messaggero (mRNA): contiene l’informazione genetica che specifica, decide la sequenza amminoacidica delle proteine;
• RNA ribosomiale (rRNA): molecole di RNA che associate alle proteine formano i ribosomi, che è la sede della biodiversità proteica;
• RNA transfer (tRNA): leggono l’informazione dall’mRNA e portano l’amminoacido corrispondente alla catena proteica nascente.

Proprietà chimiche degli acidi nucleici (DNA e RNA)

Gli acidi nucleici sono acidi a pH neutro e carichi negativamente. Le basi azotate sono delle molecole basiche, altamente coniugate, hanno una struttura planare, assorbono luce UV grazie alla presenza di una nuvola elettronica perfettamente distribuita, sono idrofobe ossia poco solubili in acqua. Per effetto della risonanza tutte le basi azotate assorbono la luce UV, maggiormente intorno ai 260 nm. L’assorbimento della luce a 260 nm è maggiore nei nucleotidi liberi rispetto ai singoli filamenti, i quali hanno un tasso di assorbimento maggiore rispetto alle doppie eliche.

N.L > singolo filamento > doppie eliche

La quantità di luce assorbita è più bassa quando le basi azotate sono impilate, legate in un filamento singolo o doppio e tale effetto è chiamato effetto ipocromico, mentre se le basi azotate sono libere la luce assorbita è maggiore e tale effetto è chiamato effetto ipercromico. Grazie all’assorbimento della luce possiamo seguire in laboratorio la denaturazione del DNA.

Un importante parametro è dato dalla temperatura di fusione o melting (Tm) che indica la temperatura dove il processo di denaturazione è intorno al 50%. Confrontando due diversi DNA la Tm può variare per due fattori che sono:

• Il contenuto in basi azotate ovvero maggiore è il contenuto di C e G che hanno un triplo legame, più energia serve per rompere i legami ed aprire l’elica;
• Il contenuto in sali del mezzo in cui si esegue l’esperimento. Se si agisce su un substrato senza sali le cariche negative del gruppo fosfato tendono ad allontanare i due filamenti quindi servirebbe più energia per romperli; mentre se nel substrato è presente un sale (NaCl), esso si scinde ed il Na⁺ si lega alle cariche negative che stabilizzano e avvicinano le due eliche quindi ci vorrà meno energia per rompere i legami.

Prende il nome di denaturazione quel processo che allontana i due filamenti (catene) che compongono la doppia elica del DNA. Questo processo può avvenire o tramite mezzi fisici come le alte temperature o tramite mezzi chimici alterando il pH, in tal modo lo stato di ionizzazione dei gruppi si altera rompendo i ponti idrogeno. Il processo inverso alla denaturazione prende il nome di rinaturazione, il quale è un processo molto lento.

Gene

Un gene è una sequenza di DNA che codifica per un prodotto finito, sia esso una proteina o un RNA. I geni eucariotici sono molto complessi, infatti l’informazione genetica è distinta in zone codificanti o esoni e zone non codificanti o introni. Affinché il prodotto finito, sia esso una proteina o un RNA, possa manifestare il suo effetto, gli introni vengono eliminati. Nei geni procariotici non esistono gli introni. La molecola di DNA nei procarioti è unica, circolare e chiusa, ed essa contiene i geni in maniera continua.

Come è composto il genoma umano?

Negli eucorati il genoma umano (DNA) è composto dal 45% dal DNA trasposonico o trasposoni che si divide in:

• Elementi interdispersi lunghi (21%) circa 800 bp (basi);
• Elementi interdispersi corti (13%) circa 200 bp (basi).

Questi elementi si spostano da un punto all’altro del DNA, e la loro funzione è importante ai fini evolutivi. Il 30% (del DNA) è chiamato DNA genico costituito solamente da:

• 1,5% da esoni (DNA informativo);
• 28,5% da introni (DNA non informativo);
• Zone non codificanti.

Il 25% è costituito da sequenze miste di cui:

• 17% è DNA a funzione ignota;
• 3% da single sequence repeat (SSR) ovvero sequenze di basi che si ripetono molte volte (es: AT, AT, AT);
• 5% da sequence distance (SD) con funzioni non ancora sconosciute.

Come abbiamo detto prima il DNA si trova in più molecole di cromosomi. Il cromosoma è costituito da 2 telomeri all’estremità e da un centromero al centro. Le zone telomeriche e centromeriche non hanno geni informativi, i quali si trovano lungo i bracci del cromosoma.

Metabolismo del DNA

La prima funzione del DNA è quella di conservare e trasferire l’informazione genetica alle generazioni successive, e per fare ciò si deve autoreplicare. Il ciclo cellulare prevede una fase M (mitosi), fase G1 (Gap) dove la cellula accresce le sue dimensioni e si prepara alla replicazione, fase S (sintesi) dove la cellula si replica, e la fase G2 dove la cellula matura e si prepara ad un’ulteriore mitosi.

La replicazione (sintesi) del DNA è semiconservativa ovvero viene duplicato solamente un filamento di DNA, chiamato filamento stampo, per cui alla fine la nuova cellula avrà il DNA con un filamento di nuova formazione e l’altro costituito dal vecchio filamento. Tutte le reazioni di sintesi del DNA richiedono un primer ovvero non possono avvenire ex novo. Tale primer o innesco è un piccolo tratto di DNA complementare al DNA che fa da stampo.

Per completare la reazione si devono fornire i nucleotidi trifosfato. Tutti gli enzimi deputati alla sintesi del DNA lavorano sempre in direzione 5’-3’, e la catena è ricopiata secondo le leggi della complementarietà (A-T, C-G). L’enzima che catalizza la reazione di sintesi (polimerizzazione) è la DNA polimerasi.

La reazione di polimerizzazione è la seguente:

(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
dove:
dNMP = deossiribunucleotidemonofosfato n = basi azotate
dNTP = deossiribunucleotidetrifosfato
(dNMP)n+1 = dNMP + il dNTP – i gruppi PPi
PPi = pirofosfato

Tale reazione prevede l’aggiunta del dNTP all’estremità 3’ OH libera, catalizzata dall’enzima DNA polimerasi. Per prima cosa avviene l’appaiamento delle basi e successivamente si forma il legame fosfodiestere tra il gruppo fosfato alpha del dNTP e l’estremità 3’ OH libera della catena che si sta allungando. Infine viene rilasciato il pirofosfato e l’idrolisi (molecola di acqua persa) dei gruppi fosfati liberi.

Gli enzimi deputati alla sintesi del DNA prendono il nome di DNA polimerasi. Questi hanno anche associato un’attività di demolizione che prende il nome di attività nucleasica che si divide in:

• Attività esonucleasica: quando un enzima è in grado di degradare il DNA a partire da un’estremità;
• Attività endonucleasica: quando un enzima è in grado di tagliare il DNA all’interno del DNA stesso, generando dei frammenti. Ogni taglio genera due frammenti.

Le DNA polimerasi provengono da Escherichia coli per la biosintesi del DNA in vitro. Esistono almeno 5 DNA polimerasi, quelle più usate sono la I, II e III con diverse funzioni. La DNA polimerasi II non viene usata in biotecnologie, ma in vivo ha un ruolo di riparazione del DNA. La DNA polimerasi III svolge la maggior parte del lavoro di sintesi poiché è molto veloce, però non è molto usata ed è in grado di aggiungere 10000 basi al secondo.

La DNA polimerasi I è la più usata. La prima caratteristica fondamentale è la sua attività esonucleasica 3’-5’ detta anche proofreading la quale serve a correggere eventuali errori nei legami tra le basi azotate (es: A-C), togliendo la base sbagliata e aggiungendo la base giusta, contemporaneamente sintetizza in direzione 5’-3’. Oltre all’attività esonucleasica 3’-5’ ha anche un’attività esonucleasica 5’-3’, e tale attività in vivo serve alle cellule per allontanare i primer. Questa attività prende il nome di nick (taglio) translation ovvero effettua un taglio, successivamente “ripara la zona tagliata” e sposta il taglio.

[la nick translation è la tecnica grazie al quale la DNA polimerasi I rimuove i nucleotidi in direzione 5’-3’ mentre ne aggiunge di nuovi e successivamente sposta il taglio]. In laboratorio tale attività nella maggior parte dei casi è pericolosa in quanto può degradare i primer e quindi portare ad una polimerizzazione inefficace quindi molte volte dalla DNA polimerasi I viene eliminato il frammento che esplica tale attività. Il frammento rimanente si chiama frammento di Klenow che non presenta più l’attività esonucleasica 5’-3’.

Sintesi dell'RNA

Ricordandoci l’altra funzione del DNA ovvero che esso manifesta i suoi effetti grazie alla trascrizione in una molecola di RNA e la sua traduzione in proteine, è importante parlare della sintesi dell’RNA. Quando si parla di sintesi dell’RNA si fa riferimento alla trascrizione. Gli enzimi deputati alla sintesi dell’RNA sono in grado di sintetizzare RNA ex novo, ovvero senza l’utilizzo di un primer. La trascrizione è catalizzata dall’enzima RNA polimerasi secondo tale formula:

(NMP)n + NTP → (NMP)n+1 + PPi
NMP = nucleotide monofosfato
NTP = nucleotide trifosfato

La catena di RNA viene ricopiata secondo le leggi della complementarietà, solo che al posto della Timina vi è l’Uracile, e inoltre la catena è allungata in direzione 5’-3’. Durante la trascrizione può succedere che venga incorporata una base sbagliata nell’RNA poiché gli enzimi non hanno attività esonucleasica in direzione 3’-5’, infatti viene commesso un errore ogni 10⁴ / 10⁵ nucleotidi incorporati. Tali errori rimangono a livello cellulare e quindi sono tollerati.

Durante la trascrizione il DNA non si apre totalmente ma solamente in quella zona dove deve essere trascritto. Il tratto che deve essere trascritto, ovvero il gene è individuata dall’RNA polimerasi grazie ad una zona detta zona promotore che si trova a monte del gene che deve essere trascritto. Indichiamo col termine +1 il primo nucleotide che viene trascritto, mentre col segno – i nucleotidi che si trovano a monte del primo nucleotide trascritto.

Nella zona promotore vi sono delle zone importanti chiamate regioni che l’RNA polimerasi riesce a riconoscere. Tali zone sono:

• Il GCA BOX che si trova a -35 (che si trova a -35 nucleotidi dal nucleotidi +1); tale zona è così chiamata poiché ricca di Guanina, Citosina e Adenina.
• Il TATA BOX che si trova a -10; tale zona è così chiamata poiché ricca di Timina e Adenina;
• Gli UPSTREAM o elementi a monte che si trovano anche a migliaia di nucleotidi di distanza.

Come avviene la sintesi dell’RNA? Tale reazione prevede l’aggiunta del NTP all’estremità 3’ OH libera, catalizzata dall’enzima DNA polimerasi. Per prima cosa avviene l’appaiamento delle basi e successivamente si forma il legame fosfodiestere tra il gruppo fosfato alpha del NTP e l’estremità 3’ OH libera della catena che si sta allungando. Infine viene rilasciato il pirofosfato e l’idrolisi (molecola di acqua persa) dei gruppi fosfati liberi.

Vi sono 3 classi di RNA polimerasi:

• L’RNA polimerasi I che sintetizza gli RNA ribosomiali ovvero il 18S, il 28S e il 5,8S tranne il 5S (parte del ribosoma);
• L’RNA polimerasi II che sintetizza gli RNA messaggeri;
• L’RNA polimerasi III che sintetizza gli tRNA transfer e gli RNA ribosomiale 5S.

Modifiche post-trascrizionali

Tutti gli mRNA dopo la sintesi dovuta all’RNA polimerasi II, subiscono un processo di rimaneggiamento. La prima modifica è chiamata splicing dove vengono allontanati dall’RNA gli introni e vengono ricuciti gli esoni. La seconda modifica prevede l’inserimento all’estremità 5’ dell’RNA di un residuo di 7-metil-guanina (CAP) che lo protegge dalla degradazione una volta uscito dal nucleo, poiché l’esonucleasi lo degraderebbero senza il CAP. La terza modifica prevede l’aggiunta all’estremità 3’ di una coda di poliadenina che può arrivare fino a 17 adenine. Essa serve a proteggere l’RNA dagli enzimi nucleasici durante il passaggio all’interno delle membrane nucleari. Le adenine sono aggiunte dall’enzima trasferasi terminale. L’RNA che ha subito queste modificazioni è chiamato RNA maturo.

Splicing alternativo

Il processo di splicing negli eucarioti, a volte, per alcuni geni può essere alternativo perché in alcuni casi alcuni introni possono essere informativi per cui si possono creare più proteine con diverse proprietà prodotte a partire da un solo gene.