Appunti metodologie biochimiche

Metodologie biochimiche

Radiazioni e tecniche spettrofotometriche

Le tecniche spettrofotometriche hanno a che fare con le capacità delle molecole di interagire con le radiazioni elettromagnetiche. Una radiazione elettromagnetica è formata da un’onda elettrica e una magnetica che sono perpendicolari l’una all’altra e in fase tra di loro (ad un massimo dell’una corrisponde un massimo dell’altra).

Un’onda elettromagnetica è caratterizzata da una lunghezza d’onda λ e una frequenza ν. ν=c/λ. Un’onda elettromagnetica possiede anche un’energia, che si può immaginare come E=h∗ν, divisa in pacchetti, o quanti, detti fotoni. Questi sono particelle di massa nulla che possono essere assorbite o emesse durante l'interazione della radiazione con la materia. Dalla formula precedente dell'energia si evince che maggiore è la frequenza maggiore è l’energia posseduta dall’onda.

Si definisce monocromatica quella radiazione formata da un'unica lunghezza d'onda o frequenza in cui tutti i fotoni hanno la stessa energia.

Stato fondamentale è il livello energetico più basso assunto dalla sostanza senza che ad essa venga fornita dell'energia.

Spettro elettromagnetico è formato da tutte le lunghezze d’onda esistenti. Quando gli atomi passano da uno stato eccitato a quello fondamentale possono dissipare tale energia sotto forma di calore, oppure possono emettere un’energia minore di quella assorbita. Questo perché un po' di energia viene persa sotto forma di calore. L’energia emessa ha anche lunghezza d’onda maggiore. Nel caso di sostanze che assorbono nell’ultravioletto esse riemettono con energia minore e lunghezza d’onda maggiore e quindi emettono nel violetto del visibile.

Le transizioni tra livelli energetici possono interessare il nucleo o, più comunemente, gli elettroni di un atomo o di una molecola. Nelle molecole per ogni livello energetico elettronico sono presenti anche diversi sottolivelli vibrazionali e rotazionali e ciò fa sì che gli atomi presentino spettri di assorbimento o di emissioni a righe, che corrispondono alle singole transizioni, mentre le molecole presentano spettri a bande che sono il risultato della sovrapposizione di più righe di assorbimento corrispondenti ai diversi livelli e sottolivelli energetici.

Spettroscopia

Osserva l'assorbimento di radiazione dovuto alle transizioni di energia compresa tra la regione visibile e l'ultravioletta a carico degli elettroni degli strati esterni degli atomi/molecole. Quando la luce colpisce una sostanza essa viene in parte riflessa, trasmessa e assorbita. Se la sostanza è in soluzione la quantità di luce riflessa è minima ed esiste una relazione tra la luce incidente e quella trasmessa dopo il passaggio nella sostanza. Tale relazione può essere descritta quantitativamente con la legge di Lambert Beer.

La luce assorbita è proporzionale al numero di molecole che la radiazione incontra nel suo cammino. Perciò: dI/IdI = k∗c∗dx = k∗c∗I∗dx che integrata diventa ln(I₀) = -k∗l∗c(I_t). Si definisce trasmittanza T il rapporto I_t/I₀. Il suo valore varia tra 0 (0%), quando tutta la luce viene assorbita, e 1 (100 %) quando non si ha assorbimento e quindi la luce trasmessa è uguale a quella incidente.

È stato poi introdotto un parametro diverso per poter lavorare meglio con queste grandezze poiché la trasmittanza è correlata alla concentrazione in maniera non lineare. Tale parametro è l'assorbanza A (o densità ottica OD), il cui valore varia in maniera lineare con la concentrazione. Essa è il logaritmo dell'inverso della trasmittanza e per questo bisogna tener presente che, ad esempio, un valore di A=2 indica che la luce trasmessa è 100 volte meno intensa di quella incidente.

Inoltre viene definito coefficiente di estinzione molare ε la densità ottica di una soluzione a concentrazione unitaria e misurata in un cammino ottico di 1 cm. La sua unità di misura è M^-1cm^-1. Le misure di assorbanza tendono a deviare dalla linearità per soluzioni con concentrazioni elevate in quanto servono strumenti molto sensibili, in grado di rilevare la poca radiazione emessa. Per questi motivi sappiamo che oggi si rilevano con precisione e linearità valori di assorbanza fino a 1,5/2. A=log(I_t/I₀) = ε∗c∗l/poiché si passa da ln a log si deve tenere conto che la relazione tra ε e k è data da .ε=k/2,3.

Nei limiti di validità di tale legge vale il principio di additività delle assorbanze per cui: A=A₁+A₂+A₃…

Strumentazione

Il campo dinamico di uno strumento di misura è quell'intervallo di valori per cui io sono certo di fare una misura con un errore su di essa che è inferiore ad un valore prestabilito, ovvero, si intende l’intervallo dei valori di misura compreso tra il valore minimo e massimo misurabili con una determinata accuratezza e precisione.

Nel caso dello spettrofotometro, il campo dinamico è l’intervallo tra l’assorbanza minima e quella massima misurabile con un errore percentuale dell’1%. È un errore che dipende dallo strumento stesso.

Il campo dinamico si definisce così: preparo delle soluzioni di cui so l'assorbanza teorica e calcolo l'errore come:

• ΔA = (A_misurata - A_teorica)
• Rapporto dell'errore sull'asse delle ordinate e l'assorbanza misurata sull'asse delle ascisse.

Gli errori possono essere dati da rumori di fondo quando misura lo zero, A=0. Lo strumento misura I in un certo istante e quella nell'istante successivo e fa il rapporto. Poi dà lo zero. Se ci sono piccole fluttuazioni nell'emissione della lampada avrò un errore.

• Luce diffusa (o stray light) determina l'errore per alti valori di assorbanza. Sono fotoni che arrivano al fototubo senza passare attraverso il cammino ottico normale, arrivano da altre parti (luce dell'ambiente). Il fototubo non è in grado di discriminare quelli “buoni” dagli altri. Meno luce diffusa c'è più lo strumento è buono e può prendere valori di A più alti.

Log I_o/I=1 Io/I=1000/(100+1) A=0,996 ΔA/A=0,4%

Log I_o/I=2 Io/I=1000/(10+1) A=1,959 ΔA/A=2,05%

Log I_o/I=3 Io/I=1000/(1+1) A=2,699 ΔA/A=10%

Sorgenti di luce

Sono diverse a seconda della regione spettrofotometrica analizzata: nella regione del visibile vengono usate lampade a incandescenza, nella regione ultravioletta (λ<350 nm) si usano le lampade a scarica. Queste ultime sono formate da un'ampolla di vetro o quarzo in cui si ha idrogeno o deuterio gassoso nella quale viene prodotta una scarica elettrica.

Monocromatori

Servono per rendere la radiazione formata da una sola fonte monocromatica o almeno caratterizzata da un intervallo di lunghezze d'onda limitato. Per esempio negli spettrofotometri vengono usati prismi o reticoli. Nel primo caso si parla di un oggetto formato da vetro ottico, utile nella regione visibile della radiazione, oppure da quarzo puro, utile per separare nel campo dell'ultravioletto. Esso si basa sul principio della rifrazione ovvero su quel fenomeno per il quale un raggio di luce che incide su di un mezzo trasparente a densità maggiore subisce una deviazione che è proporzionale al raggio di incidenza e all'indice di rifrazione del mezzo.

Dato che l'indice di rifrazione è poi una funzione della lunghezza d'onda, quando un raggio policromatico incide su di un prisma, le radiazioni con diversa lunghezza d'onda verranno deviate con un angolo diverso ottenendo una scomposizione della luce incidente. Il potere risolutivo di un prisma, ovvero la capacità di separare radiazioni con lunghezze d'onda molto vicine, non è costante con il variare della lunghezza d'onda dato che l'entità della deviazione aumenta al diminuire della lunghezza d'onda stessa.

I reticoli di diffrazione, invece, permettono di avere una risoluzione maggiore. Essi sono basati su fenomeni di diffrazione e possono essere: a trasmissione, formati da fenditure sottilissime equidistanti tra loro su di un materiale opaco, oppure a riflessione, se sono formati da righe molto fini, equidistanti, incise su di un materiale riflettente. L'ampiezza delle fenditure/righe deve essere confrontabile o dello stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda della radiazione incidente. La risoluzione, a differenza di quella di un prisma, è lineare in funzione della lunghezza d'onda.

Un'altra parte importante del monocromatore è la fessura di uscita, o slit, che è la fessura attraverso la quale viene fatta passare la radiazione che deve incontrare il campione. Essa può essere fatta variare manualmente e di conseguenza la luce sarà tanto più monocromatica quanto più la fessura sarà stretta.

Celle e materiali ottici

I contenitori dei campioni devono essere trasparenti alle radiazioni che li devono attraversare: vetro ottico per le radiazioni nel visibile e quarzo per le radiazioni nell'UV. Essi vengono chiamati cuvette.

Rivelatori

Per misurare la quantità di luce trasmessa vengono usati dei sistemi che convertono l'energia luminosa in energia elettrica. Tali apparecchi sono costituiti da fototubi e fotomoltiplicatori ed entrambi si basano sull'effetto fotoelettrico. Nel fototubo si hanno due placche metalliche alle quali è applicata una differenza di potenziale, se una delle due viene colpita, si genererà una corrente tra di esse che sarà proporzionale all'intensità della luce incidente. Nel fotomoltiplicatore le placche sono molte di più ed orientate in modo che se un elettrone incide su di una di esse poi viene indirizzato verso le altre. Sull'ultima placca arriva quindi un numero amplificato di elettroni.

Fotometro è rappresentato da una sorgente di luce, un sistema monocromatore ed un sistema rivelatore. Spettrofotometro è molto simile ma permette in più di mi rilevare l'intensità luminosa trasmessa da una sostanza in funzione della lunghezza d'onda della radiazione luminosa e quindi di ottenere uno spettro di assorbimento. È in grado di misurare gli spettri di assorbimento ed è dotato di due sorgenti luminose che gli consentono di coprire l'intero ambito spettrale UV e del visibile.

La variazione della lunghezza d'onda viene ottenuta spostando la finestra che seleziona la luce in uscita dal monocromatore, prelevando così delle radiazioni a diversa frequenza. Un'evoluzione di tali apparecchiature è data da spettrofotometri a doppio raggio in cui la luce viene fatta passare separatamente attraverso un campione e una cuvetta senza campione. In questo modo si possono sottrarre assorbimenti dovuti ad altre sostanze presenti. Ne esistono di due tipi:

• A doppio raggio nello spazio. La radiazione viene divisa nello spazio da uno splitter (specchio triangolare) subito dopo essere uscita dal monocromatore. Sono presenti quindi due rivelatori che devono essere identici o molto simili per ottenere misure attendibili.
• A doppio raggio nel tempo. La luce che esce dal monocromatore viene alternativamente indirizzata grazie ad uno specchio mobile o un disco rotante con una fenditura e una zona riflettente sfalsate (chopper) verso il campione o verso il riferimento. Un sistema di specchi indirizza poi la radiazione verso un unico rivelatore.

Esistono poi anche degli strumenti UV VIS a serie di diodi che non presentano parti in movimento ed il monocromatore si trova dopo la cella di misura. La luce trasmessa, separata dal monocromatore, raggiunge direttamente il rivelatore formato da centinaia di fotodiodi allineati, ognuno dei quali rileva una banda di radiazione. Non sono strumenti con elevata risoluzione ma registrano in poco tempo tutto lo spettro di assorbimento e ciò li rende ideali per essere collegati all'uscita di strumenti di separazione come i cromatografi.

In pratica: quando si vuole misurare l'assorbanza di un campione per prima cosa si deve azzerare lo spettrofotometro con un bianco, in modo da sottrarre poi eventuali assorbimenti dovuti ai componenti del tampone e non alla proteina stessa. Inoltre è necessario che la soluzione sia limpida perché altrimenti si verificherebbero fenomeni di scattering (diffusione). Se la soluzione ha una concentrazione troppo elevata si otterranno valori di assorbanza superiori a 1,5 o 2 e di conseguenza sarà necessario diluirla per ottenere risultati attendibili.

Lo spettro di assorbimento può essere registrato in due modi: impostando i limiti superiore ed inferiore di lunghezza d'onda ed effettuando una scansione di lunghezza d'onda o altrimenti a lunghezze d'onda fisse e seguendo le variazioni di assorbanza nel tempo (ad esempio nei saggi di unità enzimatica).

Inoltre la determinazione della concentrazione di una sostanza con i metodi spettrofotometrici è semplificata dall’uso delle curve di taratura. Una curva di taratura è costruita riportando in ascissa i valori della concentrazione di soluzioni standard di una determinata sostanza e in ordinata i corrispondenti valori di assorbanza.

Misurazione della concentrazione di DNA

Per misurare la concentrazione di una soluzione di DNA si può ricorrere alla spettrofotometria. Si determina l'assorbanza a 260-280 nm, che è il picco di assorbimento della molecola di DNA, e si utilizza la formula empirica per la quale una soluzione di DNA a doppia elica se ha assorbanza uguale a 1 significa che ha una concentrazione di circa 50 μg/mL. Nel caso in cui la soluzione in esame non sia pura, ovvero siano presenti delle proteine, la cifra sarà sovrastimata in quanto anche queste ultime hanno un picco di assorbimento a 280 nm dovuto agli aminoacidi aromatici. Per valutare la purezza del campione si può ricorrere al rapporto dell'assorbanza tra 260 e 280 nm (A_260/280) che è circa di 1,8 se la soluzione è pura, è inferiore a tale valore se sono presenti proteine.

Per una miscela proteica si ha proteine totali(mg/mL)=1,55∗A₂₈₀−0,76∗A₂₆₀.

Spettrofotometria per misurare la concentrazione di enzimi

Enzimi con catalisi di tipo Michaelis e Menten: un enzima è caratterizzato da Vmax e Km che corrisponde alla concentrazione del substrato alla quale la v=Vmax/2. Se ho più specie differenti in soluzione non ha senso parlare di concentrazione molare. Misurando la velocità posso determinare la concentrazione dell'enzima.

Unità enzimatica è definita come la quantità di enzima che trasforma una micromole di substrato al minuto nelle condizioni standard di saggio. Le condizioni sono: concentrazioni di saggio saturande, cofattori in condizioni saturande, pH.

Katal è la quantità di enzima che converte una mole di substrato al secondo. Condizioni di pH ottimali e la temperatura convenzionale (30°C). Questo perché ogni aumento di 10°C fa crescere la velocità. Poi si arriva alla temperatura di denaturazione dell'enzima. Qualcuno dice che l’unità enzimatica non si può usare perché non usa le unità fondamentali. Allora ci pensa il Katal.

Cromofori delle proteine

Cromoforo è un gruppo che assorbe la luce, caratterizzato da specifiche transizioni elettroniche e di conseguenza da differenti lunghezze d'onda d'assorbimento. Nelle proteine i cromofori principali sono il legame peptidico, che assorbe nell'UV, e gli aminoacidi aromatici (fenialanina, tirosina e triptofano).

L'amminoacido che contribuisce principalmente all'assorbimento delle proteine a 280 nm è il triptofano, mentre fenilalanina e tirosina hanno coefficienti di estinzione molare più bassi ma risultano comunque importanti poiché sono molto più rappresentate dell'altro aa. Negli spettri di assorbimento possono essere presenti più picchi dovuti alla presenza di cromofori diversi o anche a più transizioni elettroniche dello stesso cromoforo.

Molte proteine hanno gruppi prostetici che gli conferiscono proprietà spettroscopiche specifiche e che spesso assorbono nel visibile (cosa che li rende colorati). Anche alcuni coenzimi come il FAD, la FMN, il NADH e il PLP hanno bande di assorbimento caratteristiche nel visibile o nel vicino UV, che li rendono utili come sonde spettroscopiche.

Importanti sono anche i metalli di transizione come rame, ferro e cobalto che mostrano transizioni degli orbitali d e transizioni di trasferimento di carica con i ligandi nel visibile, che rendono intensamente colorate le proteine in cui si trovano.

Le proprietà di assorbimento di un cromoforo sono influenzate da vari fattori come la polarità che può alterare la distribuzione elettronica, la costante dielettrica del solvente che può essere alterata dal pH locale, la quale determina lo stato di ionizzazione di cromofori ionizzabili. Interferiscono anche il diverso stato di ossidazione/riduzione e la presenza di interazioni di gruppi funzionali.

Cromofori degli acidi nucleici

Il loro assorbimento dipende da transizioni che coinvolgono le basi puriniche e pirimidiniche. Il massimo di assorbimento è di circa 260 nm sia per il DNA che per l'RNA. Non esiste uno specifico ε a meno che non sia conosciuta la sequenza. In genere si usano relazioni empiriche del tipo: ad una molecola di DNA a doppio filamento con un valore di A=1 corrisponde una concentrazione di... (testo incompleto).