Che cosa sono le metodologie biochimiche

Si fa fare inizialmente una pre corsa con gli anfoliti in modo che

possano raggiungere il loro PI e tamponare e stabilizzare il PH ,

successivamente si fanno correre le proteine che si andranno a

porre nel tubo dove incontreranno il loro PI tamponando e

stabilizzando il ph. Ovviamente se nei nostri campioni ci saranno un

mix di proteine tutte a ph diversi noi andremmo a selezionare solo

quelle a pI desiderato .

Ciò vuol dire che se le proteine hanno un Punto Isoelettrico

superiore al Ph più alto del gradiente non entrano nel gel, se invece

hanno un punto isoelettrico più basso escono al di sotto del gel.

Successivamente a questa analisi si può fare una elettroforesi

bidimensionale, cosi da poter selezionare tra quelle proteine a

stesso pI quelle a peso molecolare differente e fare cosi un analisi

completa.

Western blot : STAGE.

-Spettroscopia di massa –

Le tecniche spettroscopiche misurano l’assorbimento o l’emissione

di energia da parte di molecole che transitano da stati energetici

differenti. Uno spettro è rappresentato da un grafico che riporta

energia emessa o assorbita in funzione della lunghezza d’onda.

Per ogni lunghezza d’onda ci saranno visaulizzazioni differenti,

nell’infrarosso nel visibile nell’ultra violetto e nelle microonde.

A seconda delle molecole useremo lunghezze d’onda adatte ad

interagire fornendo informazioni specifiche .

Per quanto riguarda gli spettri elettronici , si vanno a sollecitare gli

stati energetici grazie all’ausilio di radiazioni elettromagnetiche, che

permettono alla molecola di passare da una fase HOMO ( highest

occupied molecular orbital ) ad una fase LUMO (louvest onoccupied

molecular orbital ) . Quindi di far transitare gli elettroni dagli orbitali

più esterni (fase di stabilità) a quelli più interni cosi da creare

possibilità di nuovi legami avendo resa reattiva la molecola. Tutta

questa energia è racchiusa in fotoni che hanno proprio il compito di

far transitare le molecole da uno stato all’altro. Questo tipo di

spettri è rilevabile nell’UV E nel VISIBILE.

Ci sono però anche spettri ROTAZIONALI O VIBRAZIONALI che

invece sono la sollecitaizone di transizioni da stati rotazionali o

vibrazinali differenti, e questi sono rilevabili nell’INFRAROSSO.

Quindi abbiamo detto che queste tecniche potranno essere sia nel

misurare l’energia emessa o assorbita.

- Per l’energia emessa avremo SPETTROSCOPIA IN EMISSIONE

(FLUORESCENZA )

- Per l’energia assorbita avramo la SPETTROSCOPIA DI

ASSORBIMENTO ( assorbimento uv –visibile DICROISMO CIRCOLARE)

La legge che regola l’assorbimento della luce sarà la legge :

A= epspilon c d

dove A è il logaritmo di 1/T dove T è TRASMITTANZA e A è

l’assorbanza d è il cammino ottico , epsilon è il coefficiente di

estinzione molare, c è la concentrazione.

L’assorbanza è definita come proporzionale alla concentrazione del

campione e alla lughezza d’onda del cammino ottico d secondo la

costante di proporzionalità epsilon . E’ anche definita come il

logaritmo della luce incidente e luce rimasta dopo

l’attraversamento del campione .

Spettrofotometro : sarà una tecnica ad assorbimento . Avremo

una fonte di luce al tungsteno per il visibile e H2 E D2 per gli uv ,

successivamente un monocromatore che seleziona di volta in volta

la lunghezza d’onda desiderata, successimante metteremo la

cuvetta con il campione di interesse (di plastica per il visibile di

quarzo per uv e visibile). Successivamente si sarà un detector che

rileva ciò che resta del raggio che ha oltrepassato il nostro

campione per calcolare concretamente quanto ne è stato assorbito.

Questi dati poi verranno rielaborati in base ad una retta di taratura

nota e potremmo avere un grafico con luce assorbita in funzione

della lunghezza d’onda .

Assorbimento proteine 190 – 220 nm (lontano all’UV)

Assorbimento catene laterali e aromatiche 260 -280 ( vicino all’UV)

.

Quando si va ad allestire un grafico bisognerà sempre settare lo

spettrofotometro mettendo un “bianco” che sarà tutto ciò che

abbiamo aggiunto al campione tranne il campione.

Per ogni aa è nota una lunghezza d’onda specifica ad esempio :

fenialanina 257, tirosina 274 e triptofano 280, questi valori sono

fondamentali perché da questi posso trarre il coefficiente di

estinzione di ognuna e da queste dell’intera proteina. Il punto

isoelettrico si raggiunge quando due specie in equilibri chimico ad

una determinata lunghezza d’onda hanno stesso coefficiente di

estinzione molare , il valore dell’assorbimento o dell’estinzione

molare non dipendono dalla concentrazione della singola specie ma

dalla somma di queste.

La proteina avrà coefficineti di estinzione differenti se è in forma

denaturata o nativa, quindi dovremmo sempre usare il coefficiente

di estinzione specifico per la forma specifica .

Normalmente quindi le proteine non assorbono nel visibile ma

possiamo associarle a gruppi prostetici tipo eme o flavoproteine che

conferiscono bande nel visibile(flavoproteine 450 nm) .

Gli acidi nucleici quindi formeranno una banda di assorbimento a

260 nm per via delle basi azotate

PUREZZA del campione di DNA dalle proteine = A260/A280

PUREZZA delle proteine quindi dipenderà dalla composizione aa

Applicazioni : quindi possiamo determinare la concentrazione

proteica conoscendo il coefficiente di estinzione , verificare

l’associazione a cofattori , determinarne eventuali affinità , seguire

la denaturazione proteica attraverso il rilascio del cofattore

Fluorescenza : la fluorescenza è una modalità di decadimento

di una molecola eccitata nella quale l’energia elettronica è emessa

sotto forma di luce.

Anche in questo caso come nella spettroscopia , ci sarà un modo

attraverso il quale questa energia verrà emessa per la transizione

tra stato di latenza e stato eccitato; sono i fotoni .

I fotoni sono emessi da fluorofori , i quali sono in grado di far

passare una molecola dallo stato quiescente allo stato eccitato ma

anche non emettere fotoni, subendo il QUECHING che consiste

proprio nella situazione in cui le molecole in stato eccitato

interagiscono con altre molecole che ne assorbono parte

dell’energia.

SPETTRI DI ECCITAZIONE = posso misurare la fluorescenza ad una

lunghezza d’onda fissa della radiazione emessa variando la

lunghezza d’onda incidente, rappresentato da un grafico con

intensità della lunghezza d’onda emessa fissa in funzione della

lunghezza d’onda incidente

SPETTRI DI EMISSIONE = posso misurare la lunghezza d’onda

incidente ad una lunghezza d’onda fissa della radiazione

eccitazione variando la lunghezza d’onda della radiazione emessa,

rappresentato quindi da un grafico con l’intensità della lunghezza

d’onda eccitata fissa in funzione della lunghezza d’onda emessa.

Fluorimetro : è uno strumento simile allo spettrofotometro, che

però avrà ben due monocromatori uno di eccitazione ed uno di

emissione l’ultimo dei quali posto a 90 gradi rispetto al primo per

non rilevare anche la luce incidente non assorbita.

Soregente  monocromatore eccitazione  rilevatore emissione a 90

gradi per evitare interferenza della luce nn assorbita dal campione 

monocromatore emissione  rilevatore (tubo fotomoltiplicatore)  pc

Nello spettro di eccitazione il massimo è vicino al visibile , mentre

nello spettro di emissione ne sarà lontano , questo accade perché la

resa non potrà alla fine essere del 100 per cento in quanto non tutta

l’energia assorbita verrà riemessa una parte infatti viene dissipata

durante lo stato eccitato .

Per esempio prendiamo tre aminoacidi :

- triptofano avrà come lunghezza d’onda di eccitazione 280 nm ma

con uno spettro di emissione di ben 348 nm

- tirosina avrà come = 274 e come = 303

-fenilalanina = 257 e come = 282

In più in presenza di aa aromatici dobbiamo tener conto che essi

sono molto sensibili alla polarità dell’intorno in cui si trova l’aa

stesso ; ciò ha permesso studi conformazionali che ci possono

anche dare informazioni sullo stato proteico.

Riusciremo a captare la struttura nativa laddove gli aa sono

schermati dal solvente (ambiente apolare ) trovandosi nel core della

proteina in questo caso si troveranno nella blu shift a lunghezze

d’onda minori , laddove invece la struttura è denaturata gli aa sono

esposti c’è uno spostamento della lunghezza d’onda dello spettro di

emissione cambiando la posizione del massimo che assumerà

lunghezze d’onda maggiori in questo caso si troveranno nella red

shift.

Ad esempio il triptofano in acqua emette a 350 nm mentre

schermato nel core idrofobico emette a 330 nm.

Intensità. La resa quantica (ovvero il rapporto fra fotoni emessi e

assorbiti, ovvero l’intensità della fluorescenza) di un fluoroforo in

genere aumenta con l’idrofobicità dell’ambiente (intensità

fluorescenza triptofano in proteina nativa in genere maggiore che in

proteina denaturata).

Quindi l’intensità potrà aumentare o diminuire con la denaturazione

proteica, alcune aumenterenno l’intensità una volta denaturate

altre invece anno resa quantica maggiore in forma nativa.

Fluorescenza estrinseca : è sempre per lo studio

conformazionale di proteine in stato nativo o denaturato, ma viene

fatto con SONDE FLUORESCENTI come ad esempio ANS che sono

piccole molecole la cui fluorescenza è data proprio dalla polarità

dell’ambiente . Si possono legare sia per interazioni elettrostatiche

sia per interazioni idrofobiche , ma solo queste ultime danno una

fluorescenza maggiore.

Infatti le proteine con ans in concentrazioni differenti di etanolo

hanno una fluorescenza rilevata di eccitazione di cieca 375 .

Quindi con 374nm avremo per la proteina uno picco più alto che

rappresenta la proteina completamente denaturata con ph vicino a

2.4, avremo poi un picco leggermente più basso che rappresenta la

proteina nativa in conformaizone aperta a ph 8 , a ph neutro

avremo la proteina nativa . l’assorbanza è tutta s 375 ms ls

percentuale di fluorescena è al 100 % solo a conformaizone

denaturata.

Applicazioni : fluorescenza sia estrinseca che intrinseca rileva le

variazioni nella struttura terziaria delle proteine , alterazioni del

core idrofobico e dei contatti tra catene laterali.

Dicroismo circolare : è una tecnica spettroscopica c