Che cosa sono le metodologie biochimiche

Metodologie biochimiche di Grandori: cromatografie

La tecnica cromatografica si basa sulle interazioni tra una fase stazionaria ed una fase mobile costituita proprio dal campione da analizzare. La prima classificazione che si può fare è in base alla fase stazionaria e avremo:

Tipi di cromatografia

Su carta

La fase stazionaria è costituita da fibre di cellulosa e la fase mobile sarà la soluzione da andare ad analizzare. L'interazione tra le due avverrà per capillarità.

Su TLC

La fase stazionaria è costituita da silicie su strato di vetro, plastica o metallo, mentre la fase mobile è costituita dalla soluzione da analizzare che anche in questo caso interagirà per capillarità.

Su colonna

Questa è la tecnica maggiormente utilizzata poiché è versatile in quanto possiamo usare nella fase stazionaria differenti supporti che vanno ad interagire con le molecole di interesse in diversi modi. Le componenti minime della cromatografia su colonna sono un serbatoio per la fase mobile, la colonna per la fase stazionaria, un filtro finale, un tubo di uscita ed un detector ad UV che rileva l'assorbanza di ciò che sta eluendo per poter rilevare il tempo morto, il tempo di ritenzione ed i vari eluati.

Il tempo morto consiste nel tempo in cui la sostanza non interagisce con la fase stazionaria; il tempo di ritenzione invece consiste nel momento in cui eluisce un analita; i picchi successivi a questi rappresenteranno proprio le nostre molecole di interesse. Ogni picco cromatografico è caratterizzato da tempo di ritenzione e dall'ampiezza. La risoluzione dei picchi è molto importante per la differenziazione delle varie molecole, questa è calcolabile con una legge che è R = (t2 - t1) / ((W1 + W2) / 2). t1 è il tempo uno legato al primo picco, t2 è legato al secondo, w rappresenta l'ampiezza a metà altezza dei picchi.

Oltre al tempo di ritenzione e all'ampiezza bisognerà considerare anche l'intensità. Quindi, per poter diminuire i picchi e renderli più risoluti, bisognerà aumentare i piatti teorici. I piatti teorici sono delle zone adiacenti nella colonna in cui l'analita è in equilibrio tra fase mobile e fase stazionaria; aumentando i piatti teorici avremo una risoluzione maggiore dei picchi. N = 16(L/W)² è la relazione tra numero di piatti teorici e ampiezza. L è lunghezza della colonna sapendo che W = 4σ (deviazione standard della gaussiana del picco).

Tipi di cromatografie su colonna

• Con adsorbimento: uno o più analiti si legano alla colonna.
• Senza assorbimento: gli analiti eluiscono a velocità diverse ma nessuno si lega alla colonna.

Fasi delle cromatografie su colonna

• Equilibriamento: si farà passare un tampone di volume almeno 5 volte superiore che vada ad equilibrare il pH.
• Caricamento: viene fatto eluire il campione sciolto in un tampone che abbia una quantità di proteine compatibile con la capacità della colonna.
• Lavaggio: tipica delle cromatografie con adsorbimento, poiché allontana materiale interagente con la resina.
• Eluizione: è la fase di recupero dell'analita che può essere isocratica se la fase mobile avrà una composizione costante, sarà invece in gradiente se la composizione della fase mobile varia per permettere una separazione più efficace.

Cromatografia a gel filtrazione

Questa, anche detta ad esclusione molecolare, consiste in una cromatografia nella quale la fase stazionaria è costituita da granuli di gel contenenti pori di differente grandezza che permettono di separare molecole a peso molecolare differente e a forma differente. Le molecole più grandi e quelle a forma non tondeggiante, infatti, non riuscendo ad entrare nei pori, eluiranno subito, mentre le più piccole e a forma più compatta si incaglieranno nei granuli eluendo più tardi. Questa cromatografia tende a separare molecole con peso molecolare da 100 Da a 600,000 Da. In questo caso il TM è calcolato con il blu destrano che è un polimero di glucosio ad alto peso molecolare di 2,000 Da. La tecnica è usata per la separazione tra diverse proteine a peso molecolare differente, determinazione della struttura quaternaria e separazione tra dimeri e monomeri. Ovviamente per il calcolo del peso molecolare specifico sarà più precisa l’SDS PAGE.

Fenomeno del desalting

Usando una resina a basso cut off si ritardano solo le molecole del sale in soluzione, così da far eluire prima tutte le proteine a V₀. Questa tecnica è usata per cambiare il solvente della proteina. Infatti, equilibrando, avremo in colonna un determinato tampone; successivamente, facendo eluire il campione con un altro tampone, accadrà che le molecole più grandi eluiranno nel tampone 1 della colonna, mentre le più piccole eluiranno nel loro tampone 2. Successivamente bisognerà aggiungerne un terzo che attiverà proprio l’eluizione.

Cromatografia a scambio ionico

È stata sviluppata a metà degli anni '70 ed è un tipo di cromatografia che va a sfruttare le cariche. Infatti, avrà una fase stazionaria caratterizzata da resine cariche o positivamente o negativamente a seconda della carica delle molecole di interesse. Le resine quindi potranno essere:

• Scambiatori anionici: scambiano anioni e quindi sono cariche positivamente per legare gli anioni negativi.
• Scambiatori cationici: per scambiare cationi e quindi saranno cariche positivamente per legare i cationi positivi.

La decisione sull’uso di una o dell’altra sta proprio nel fatto che laddove il pH è più basico del punto isoelettrico (punto al quale la molecola è in fase neutra di carica o zwitterionica) tenderà ad assumere carica negativa, quindi useremo una resina con scambiatore anionico; al contrario, laddove avessimo una proteina con pH più acido rispetto al punto isoelettrico tenderà ad assumere carica positiva, quindi useremo una resina con scambiatore cationico. L’uso di questa tecnica è di purificare il campione e aumentare la concentrazione dello stesso. Usando dei sali dovremo ovviamente, per eliminarli dai campioni, fare dialisi sul nostro eluato. I passaggi sono gli stessi tranne che essendo ad adsorbimento ci sarà il lavaggio e la riequilibratura del tampone alla fine (che viene fatta con un tampone a volume cinque volte maggiore rispetto al campione).

Cromatografia a fase inversa e per affinità

Si basa sull’interazione idrofobica tra proteina e resina apolare, che è in grado di associarsi con altri gruppi apolari in presenza di H₂O. Le proteine hanno i residui idrofobici nel core, ma anche in piccole zone della superficie (alanina, metionina, leucina). Questa tecnica si divide in fase di caricamento e fasi di eluizione.

Nella fase di caricamento si instaurano le interazioni idrofobiche con la resina aumentando la loro solfobicità con un processo termodinamicamente favorito. Nella fase di eluizione invece bisognerà rompere questo legame così da fare in modo che anche le proteine eluiscano; ciò viene fatto con solventi organici apolari a concentrazioni crescenti anche se l’uso di questi può comportare denaturazione e perdita di molti cofattori. Le proteine più complesse eluiranno per ultime. In alternativa ai solventi organici apolari possiamo aumentare l’effetto solvofobico, ad esempio aggiungendo all’H₂O l’ammonio fosfato a basse concentrazioni (non ad alte perché altrimenti la proteina subirebbe precipitazione in colonna). Quindi l’eluizione si baserà su una riduzione sempre maggiore dell’ammonio solfato senza usare solventi organici, così si preserverà la struttura nativa. Ovviamente a seconda dell’idrofobicità della proteina l’eluizione sarà diversa; infatti, laddove sia poco idrofobica eluirà prima, laddove sia molto idrofobica eluirà molto dopo.

Un’altra alternativa di eluizione è l’uso delle ZIP TIPS, che sono dei puntali per pipette che portano all’estremità già impaccata una resina; le proteine si legano a essa (resina carica negativamente, legherà le proteine cariche positivamente) e poi vengono eluite grazie all’acetonitrile in condizioni quindi denaturanti.

Cromatografia per affinità

Questa tipologia di cromatografia è molto selettiva, in quanto si basa su interazioni proteina-ligando specifiche. La fase stazionaria sarà costituita da una colonna con immobilizzato un ligando, in modo tale da selezionare solo le proteine con il giusto recettore per il ligando. Inizialmente, per equilibrare la colonna, aggiungeremo un tampone compatibile con la formazione di proteina-ligando. Tutte le proteine che non riescono ad interagire con la resina eluiranno durante il tempo morto, mentre le altre, avendo interagito con il ligando, resteranno adese finché non andremo ad aggiungere un tampone adatto che spezzi questi legami.

L’eluizione in questo caso potrà essere di due tipi: specifica = cioè aggiungendo un eccesso...