Appunti esaustivi di Metodologie biochimiche e proteomiche

Separazione delle proteine mediante esclusione di dimensione

Di conseguenza le particelle che non sono entrate dentro le sfere escono subito e vanno a costituire il volume escluso della soluzione che esce durante il tempo morto, mentre le molecole rallentate usciranno molto più tardi. Chiaramente ci possono essere dei casi intermedi, ovvero alcune proteine possono entrare nei pori, ma non in tutti e quindi hanno a disposizione solo una parte della fase stazionaria per cui il loro livello di rallentamento è intermedio.

Questa tecnica è usata tipicamente per le proteine, può essere usata anche per alcuni acidi nucleici, ma è molto scomodo. La tecnica può servire per purificare delle proteine (in questo caso le proteine hanno già subito dei primi passaggi che l'hanno resa abbastanza pura), ma si può anche usare per fini analitici (per cercare di stimare la massa delle proteine, in quanto questa tecnica le separa in base alle loro dimensioni. Ovviamente più la proteina è grande, più

è pesante quindi in qualche modo i tempi di ritenzione delle proteine che passano attraverso la colonna saranno inversamente proporzionali alle dimensioni dellaproteina stessa). Guardando questo esempio di una procedura cromatografica su una miscela d 5 proteine e una proteina complessa che sono state caricate su una colonna cromatografica su gel di filtrazione (colonna HPLC con velocità di flusso molto elevata). Nel cromatogramma vediamo che la proteina 2, Tiroglobulina (proteina molto grande), esce nel tempo morto; mentre tutte le altre molecole escono con dei tempi di ritenzione via via più lunghi in base alle loro masse. Se dovessimo caricare una proteina di cui non si conosce la massa potremmo visualizzarla in questo grafico e captare il range a cui appartiene la sua massa. Questa tecnica separa le proteine in tutta la loro forma nativa (sono cioè dotate della loro struttura terziaria, quaternaria), nel senso che se dovessimo avere una proteina costituita da diverse

subunità non viene misurata la massa delle singole subunità, ma la massa complessiva. Il numero scritto affianco al nome del gel generalmente si riferisce alla dimensione dei pori.

Cromatografia di scambio ionico

Questa tipologia di cromatografia su colonna denominata cromatografia su scambio ionico permette la separazione delle molecole (principalmente proteine) sulla base della loro carica (positiva o negativa). Le proteine sono sempre delle molecole cariche poiché sono ricche di residui ionizzabili (acido aspartico, acido glutammico, lisina, arginina, istidina); la carica complessiva della proteina dipende dalla quantità relativa di cariche positive o negative [es. proteine molto ricche di residui acidi tenderanno ad avere una carica negativa].

La carica non dipende solo dal numero e dal tipo di residui, ma dipende anche dal pH in cui la proteina è immersa, infatti più il pH si abbassa più la proteina tenderà a legare protoni.

quando immersi in una soluzione acquosa si caricano di ioni positivi o negativi a seconda del pH. Inoltre, la fase mobile è costituita da una soluzione tampone che permette di regolare il pH. Durante la cromatografia di scambio ionico, le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica. Le proteine con carica positiva si legano alle sferule cariche negativamente della fase stazionaria, mentre le proteine con carica negativa si legano alle sferule cariche positivamente. Le proteine neutre o con carica opposta alla fase stazionaria passano attraverso la colonna senza legarsi. In questo modo, è possibile ottenere una separazione delle proteine in base alla loro carica elettrica. La cromatografia di scambio ionico è una tecnica molto utilizzata in biochimica e biologia molecolare per purificare e separare le proteine in modo efficace.non funzionare al di fuori di un intervallo di pH ristretto.avereun'utilizzabilità limitata ad un piccolo intervallo di pH. Il fatto che alcuni scambiatori non funzionino a tutti i pH dipende dal fatto che se per esempio abbiamo uno scambiatore cationico che è derivatizzato con dei gruppi acidi e nello specifico con un gruppo carbossilico questo gruppo tenderà a portare una carica negativa, ma se noi abbassassimo troppo il pH tenderà a perdere la propria carica negativa e quindi non sarà più in grado di scambiare cationi; quindi la capacità di scambiare ioni di segno opposto è massima a pH alto e tende a diminuire molto a pH neutro fino a perdere questa capacità a pH (2-3) acido. Allo stesso modo uno scambiatore anionico destabilizzato con gruppi basici (DEAE) riesce a scambiare anioni a pH basso mentre se alziamo molto il pH questa capacità viene meno. Quali sono i gruppi che consentono di mantere la propria carica in un intervallo di pH più ampio e quindi che si

classificano come degli scambiatori forti? Ad esempio se in unoscambiatore cationico anzi che avere un gruppo carbossilico avessimo un gruppo solforico(acido molto più forte rispetto all’acido carbossilico) il gruppo sulfonato tenderà ad avere lasua carica negativa in un intervallo molto ampio di pH; nel caso di uno scambiatore dianioni potremmo avere un’ammina quaternaria (al posto della DEAE che è un’amminaterziaria) per far si che questo scambiatore risulti più forte del precedente.

La cromatografia su scambio ionico prevede che la matrice sia preparate e impaccataall’interno di una colonna, il campione (miscela di proteine da separare) venga caricataall’apice della colonna per poterla eluire all’interno della colonna stessa grazie al flussodella fase mobile che sarà una soluzione tamponata. Le proteine migrano all’interno dellacolonna e mentre viaggiano hanno la possibilità di interagire, se usiamo

una colonna per scambio anionico e le proteine che stanno viaggiando sono proteine cariche negativamente (si trovano al di sopra del loro punto isoelettrico) queste tenderanno ad interagire con la colonna e non verranno eluite; mentre le proteine cariche negativamente cationiche non verranno attratte, ma saranno respinte dalla matrice e di conseguenza scorreranno molto velocemente tra le sferule uscendo dalla colonna durante il tempo morto. Però a noi non interessa solamente distinguere le proteine anioniche da quelle cationiche, ma ci interessa purificare una specifica proteina all'interno della miscela di proteine anioniche. A questo punto per effettuare un'effettiva purificazione bisogna staccare in maniera graduale le proteine anioniche dalla matrice, staccando prima quelle che interagiscono più debolmente (che hanno una minor carica negativa) e poi via via staccando tutte le altre. L'eluizione nella cromatografia di scambio ionico è molto importante.

poiché l'eluizione/distacco delle proteine che sono rimaste adese alla matrice nella prima fase può avvenire secondo due modalità: 1. Eluizione mediante un gradiente di pH: abbiamo appena detto che la carica delle proteine dipende dal pH, quindi se avessimo fatto aderire alla resina, in una prima cromatografia di scambio ionico, le proteine cariche negativamente è perché queste si trovavano al di sopra del loro punto isoelettrico e potevano quindi legarsi con la resina. Se abbassassimo gradualmente il pH (esempio valido per gli scambiatori di tipo anionico) e quindi rendessimo il pH della soluzione che passa all'interno della colonna/della fase mobile sempre più acido vedremmo che pian piano le proteine cominceranno a protonarsi assumendo una carica via via sempre meno negativa fino a che non raggiungono il loro punto isoelettrico o passano al di sotto di questo (dove avrebbero una carica positiva) e quindi necessariamente 2. Eluizione mediante un gradiente di concentrazione salina: in questo caso, invece di modificare il pH, si modifica la concentrazione di sale nella soluzione che passa attraverso la colonna. Le proteine adese alla resina vengono trattenute grazie alle interazioni ioniche con il sale presente nella soluzione. Aumentando gradualmente la concentrazione salina, si riduce l'interazione tra le proteine e la resina, permettendo così l'eluizione delle proteine. Queste sono solo due delle modalità possibili per l'eluizione delle proteine adese alla matrice, ma esistono anche altre tecniche che possono essere utilizzate a seconda delle caratteristiche delle proteine e degli obiettivi dell'esperimento.sistaccheranno dalla matrice e saranno eluite. Tenderanno a staccarsi prima le proteine che hanno un punto isoelettrico più alto e quindi gradualmente si potrà ottenere una separazione in diverse frazioni delle proteine anioniche stesse che usciranno fuori dalla colonna a partire da quelle che possiedono una carica più piccola o un punto isoelettrico più alto. Questo tipo di tecnica funziona molto bene a parole, ma tende ad essere poco usata perché c'è sempre il rischio che cambiando in maniera abbastanza marcata il pH in cui si trovano le proteine queste perdano la propria stabilità (ad esempio andando incontro a denaturazione e quindi aggregandosi tra loro oppure andando incontro a cambiamenti di tipo chimico che potrebbero essere dannosi); * eluizione con gradiente di forza ionica: la forza ionica rappresenta un parametro che dà un'idea della concentrazione di cariche, di qualunque segno, all'interno di una soluzione;fatto la forza ionica è data da un mezzo della sommatoria di tutte le cariche positive e negative presenti nella soluzione in cui ciascun ione è elevato al valore della sua carica. Nella cromatografia di scambio ionico la forza ionica all'interno della fase mobile viene variata aggiungendo dell'NaCl e di conseguenza questa forza crescerà proporzionalmente all'aggiunta di questo sale che si dissocia completamente in acqua formando ioni Na+ e Cl-. Si può effettuare un'eluizione utilizzando un gradiente discontinuo ovvero si varia a tappe la concentrazione di NaCl che fluisce all'interno della colonna quindi passeremo da 0 a 0,5 fino ad arrivare a 1M (oppure se si ha una macchina che effettua questo lavoro basta impostare un gradiente continuo in cui la concentrazione di NaCl aumenti gradualmente e progressivamente in un arco di tempo). Gli ioni Na+ e Cl- aiutano il distacco delle proteine perché si interpongono tra la matrice (che

Il testo ha una certa carica positiva o negativa), nel caso in cui la matrice rappresenta uno scambiatore anionico