Appunti esaustivi di Metodologie biochimiche e proteomiche

Tamponi biochimici

La ricerca biochimica ha come scopo spiegare le basi chimiche del funzionamento dei sistemi biologici (cellule, tessuti, organismi…). Per effettuare ciò vengono utilizzati due approcci:

• Studi in vivo: questi hanno come oggetto organismi pluricellulari (piante o animali) integri, possono riguardare studi sul metabolismo e la localizzazione nell’organismo di sostanze provenienti dall’esterno (xenobiotici);
• Studi in vitro: vengono effettuati su materiale biologico mantenuto in ambienti controllati sia dal punto di vista fisico che chimico. Questi includono sia studi su cellule o tessuti in coltura, sia studi sulla funzionalità degli organelli isolati sia studi su macromolecole biologiche (anche ricombinanti) isolate e purificate.

Effettuare studi in vitro apporta molti vantaggi tra cui: controllo accurato sulle variabili di sistema [es. variazioni di temperatura o pH], inoltre vi è una facile reperibilità del materiale da utilizzare e i costi per poterli effettuare è minore rispetto agli studi in vivo. Però effettuare studi in vivo ha anche dei limiti in quanto il sistema reale è più complesso ed è difficile estrapolare i risultati che simulino il comportamento di organelli e molecole in vivo.

Controllo del pH

Come detto precedentemente i sistemi in vitro ci permettono di controllare l’acidità del nostro sistema è quindi importante, per ottenere dei buoni risultati, utilizzare delle soluzioni che mantengano il nostro pH costante, tali sistemi vengono detti tampone. Le soluzioni tampone sono soluzioni che si oppongono alla variazione del pH a fronte di piccole aggiunte di acidi o basi forti. Un tampone è costituito da due ingredienti:

• Acido debole di Bronsted
• Base debole di Bronsted

Altre definizioni di tampone sono: una miscela di acido debole e della sua base coniugata; dal suo sale con una base forte oppure di una base debole e il suo sale con un acido forte. Le soluzioni tampone in biochimica sono impiegate quando è utile o necessario stabilizzare il pH su un valore desiderato, quindi è possibile preparare tamponi che funzionino ad un dato valore di pH scegliendo, negli opportuni rapporti molari, un acido debole e un suo sale. Normalmente gli acidi e le basi che devono essere utilizzati per queste miscele tampone sono acidi/basi deboli (guarda disegno).

Calcolo del pH

Per calcolare il pH di soluzioni costituite da un acido debole con la sua base coniugata viene utilizzata l’equazione di Henderson-Hasselbach; in questa formula il pH è determinato da due fattori ovvero il pKa dell’acido debole e dal rapporto fra le concentrazioni molari dei due membri della coppia acido-base coniugata. Per ottenere un buon sistema tampone bisogna far in modo che il rapporto tra l’acido e la base deve essere non troppo lontano da 1; quindi il massimo potere tamponante si ha quando il pH da mantenere coincide con il pKa acido. Se ci allontaniamo troppo da un pH uguale al pKa dell’acido debole il potere tamponante viene meno.

Caratteristiche di un buon tampone

Il concetto di potere tamponante si riferisce alla capacità effettiva di un tampone di resistere alle variazioni di pH; è definito come la quantità di acido o base forte da aggiungere a una soluzione tampone per ottenere una variazione di pH unitaria, quindi questo dipende non solo da pKa, ma anche dalla sua concentrazione totale.

Che caratteristiche deve avere un tampone per funzionare bene in ambito biochimico?

• Deve funzionare bene ad un pH vicino alla neutralità ovvero tra 5 e 10 (poiché il pH presente all’interno delle cellule, nel citoplasma, il pH viene stimato a 7,4);
• Le sostanze contenute nella soluzione tampone devono essere altamente solubili perché ciò consente di raggiungere soluzioni grande e quindi un potere tamponante elevato;
• I tamponi non devono penetrare attraverso le membrane, di solito i tamponi sono molecole cariche e non passano attraverso le membrane;
• Il tampone deve essere stabile sia chimicamente che enzimaticamente vuol dire che non deve rovinarsi con il tempo una volta che viene sciolto nella soluzione;
• Il tampone non dovrebbe assorbire luce nello spettro UV (incolore) visibile;
• Il tampone non dovrebbe essere tossico;
• Il tampone dovrebbe essere economico.

I tamponi biochimici effettivamente utilizzati in laboratorio possono essere di due tipi: tamponi basati su acidi deboli (soprattutto acidi inorganici deboli) oppure tamponi basati su delle ammine (il gruppo amminico si può protonare o deprotonare per ottenere la forma dell’ammina deprotonata, base, e il suo acido coniugato ovvero la forma protonata).

Esempi di sistemi tampone basati su acidi deboli inorganici

Un sistema tampone può essere costituito utilizzando degli equilibri che coinvolgono l’acido carbonico (acido inorganico), questo una volta sciolto in acqua si può ionizzare con un pKa di 6,35 dando lo ione bicarbonato questo a sua volta può ionizzare dando lo ione carbonato. Considerando questo composto possiamo vedere che l’equilibrio tra acido carbonico e ione bicarbonato ha un pKa abbastanza vicino alla neutralità, però tuttavia l’acido carbonico dissociato ha la cattiva abitudine di decomporsi dando origine ad acqua e anidride carbonica (gas, che viene rilasciata dalla soluzione). Quindi sfruttare un tampone basato sull’equilibrio dell’acido carbonico debole e la sua base coniugata ovvero lo ione bicarbonato è una cattiva idea perché l’acido carbonico tende piano piano a scomparire dalla soluzione.

L’equilibrio tra lo ione bicarbonato e lo ione carbonato è più costante del precedente esempio perché quando ci troviamo a pH elevati, intorno al 10, lo ione bicarbonato e lo ione carbonato sono presenti in concentrazioni simili il pH può essere mantenuto. Ci troviamo quindi in una soluzione in cui l’acido carbonico indissociato è pochissimo (il pericolo che questo si converta in anidride carbonica e scompaia dalla soluzione è minimo) tuttavia il problema è che l’equilibrio tra lo ione bicarbonato e lo ione carbonato possa essere utilizzato come sistema tampone è possibile solo durante gli studi che prevedono un pH alcalino raramente usato in studi di biochimica.

Molto usato invece è un tampone basato sui sali dell’acido fosforico, questo acido possiede tre gruppi OH che possono dissociare lasciando protoni motivo per cui non presenta solo un pKa, ma ne ha ben 3. Il primo protone dell’acido fosforico viene rilasciato con un pKa molto basso, quindi l’equilibrio tra questo e la sua base coniugata, idrogeno fosfato, è governato da un pKa di 2,15 il che vuol dire che questo sistema tampone potrebbe funzionare bene solo se nello studio si mantiene un pH molto acido. Il discorso cambia se consideriamo l’equilibrio tra la forma mono-dissociata dell’acido fosforico (di-idrogeno fosfato) e la forma bi-dissociata (mono-idrogeno fosfato) poiché questo equilibrio è governato da un pKa poco superiore a 7 quindi un valore ottimale per mantenere i valori fisiologici di pH. In effetti il fosfato è considerato una delle sostanze che riesce a mantenere stabile il pH all’interno delle cellule.

I tamponi basati sul fosfato hanno molti vantaggi tra cui: il basso costo, assoluta bio-compatibilità e il pKa è vicino alla neutralità. Vi sono però anche degli svantaggi legati all’utilizzo di questi tamponi poiché il fosfato può essere un recettore allosterico per molti enzimi quindi in qualche modo se da una parte l’utilizzo garantisce che non si tratti di sistemi tossici dall’altra parte può influenzare il comportamento di certi sistemi cellulari.

Esempi di tamponi basati sui gruppi amminici

Uno dei tamponi più utilizzati è il tris (idrossietil) aminometano (Tris), la sua forma protonata si può deprotonare dando origine all’ammina libera e il pKa tra l’equilibrio tra la forma protonata e quella deprotonata è poco superiore ad 8 (pKa interessante poiché capace di tamponare soluzioni fisiologiche). Il Tris non è una molecola biologia e per questo di solito non interferisce con gli enzimi e non passa attraverso la membrana e costa anche molto poco; uno dei suoi svantaggi riguarda il pKa poiché varia in maniera molto marcata con la temperatura. Nel grafico vediamo come una soluzione di Tris preparata a pH 8 a una temperatura di 22 °C vari il suo pH quando la temperatura aumenta infatti se vediamo a 45°C il pH arriva a 6,5.

La categoria di tamponi chiamata Good buffers, appartiene sempre al gruppo di tamponi amminici. Il loro nome deriva dal cognome, Good, del ricercatore che li scoprì. I vari tamponi che rientrano in questa categoria hanno la stessa struttura di base costituita da un anello iperazinico a cui sono attaccati, a distanze elevate e diverse, dei gruppi sulforati carichi negativamente. Proprio i gruppi sulforati sono in grado di modulare il pH degli azoti (gruppo amminico terziario) i quali determinano la capacità del potere tamponante. Il pKa di questi gruppi amminici cambia e sua volta consente ad una determinata molecola di tamponare a diversi valori di pH.

Questi tamponi collettivamente hanno diversi vantaggi tra cui: coprono tutto l’intervallo di pH che ci interessa dal punto di vista biologico, sono molecole molto solubili in acqua, non sono molecole biologiche e quindi non interferiscono con gli enzimi, hanno una scarsa interazione con gli ioni metallici. Le controindicazioni invece riguardano il loro costo elevato.

Omogeneizzazione delle cellule

Per gli studi in vitro, di organelli e di macromolecole, il primo passaggio consiste nell’omogeneizzazione ovvero bisogna rompere le cellule/tessuti estraendo il tessuto cellulare senza alterarne le caratteristiche. Il tipo di approccio da utilizzare dipende dalla cellula che si deve rompere quindi bisogna scegliere il materiale di partenza, scegliere del metodo di rottura e l’uso di appropriati tamponi di lisi.

La scelta del materiale di partenza deve basarsi su criteri di buon senso infatti si deve scegliere un materiale:

• In cui l’organello o le macromolecole siano abbondanti;
• Che siano facilmente reperibili;
• Che abbiano costi limitati.

Qualsiasi materiale di partenza venga scelto questo deve essere processato a fresco, per limitare la degradazione dei contenuti cellulari; se questo materiale non viene omogeneizzato subito può essere conservato a temperature vicine a 0°C per qualche ora oppure surgelato e conservato ad una temperatura minore di 30°C per mesi.

Solitamente la rottura delle cellule è effettuata a bassa temperatura (in camera fredda a 4°C, o in soluzioni raffreddate in ghiaccio). Il tessuto o le cellule sono di solito sospese prima dell’omogeneizzazione in 2 o 3 volumi di soluzione tampone apposita (tampone di lisi) che oltre a contenere la sostanza che mantiene stabile il pH contengono anche altri elementi.

Metodi di omogeneizzazione

I metodi di omogeneizzazione impiegati cambiano a seconda del tipo di materiale di partenza (fragilità più o meno accentuata delle cellule) ed a seconda che si intenda studiare organelli intracellulari oppure macromolecole. I metodi si possono suddividere in:

Metodi non meccanici

• Lisi per shock osmotico: all’interno delle cellule sono presenti proteine/ioni che mantengono una certa pressione osmotica, nel momento in cui noi mettiamo queste cellule in una soluzione in cui la pressione osmotica è più elevata le cellule tenderanno a riequilibrare la soluzione esportando ioni, ma se non riescono a compensare la pressione osmotica rischiano di assorbire acqua fino a esplodere. Ad esempio se prendiamo le cellule e le mettiamo in acqua distillata (che ha una bassissima forza osmotica) creiamo un shock osmotico che genera una lisi e un rilascio di materiale cellulare tuttavia questo approccio funziona solo per le cellule isolate (non va bene per tessuti) e fragili e viene utilizzato solo quando non bisogna mantenere intatti gli organelli. Es. si usa lo shock osmotico per estrarre l’emoglobina dai globuli rossi.
• Lisi enzimatica: viene utilizzata per le cellule dotate di parete, questo problema può essere aggirato trattando la parete cellulare dei batteri, dei lieviti e delle cellule vegetali con enzimi (lisozima, zimoliasi, cellulasi). A questo segue poi la lisi osmotica della membrana cellulare. Questa tecnica di digestione enzimatica è utilizzata anche come pre-digestione in metodi meccanici.
• Solubilizzazione chimica: in questo metodo le membrane cellulari vengono danneggiate usando solventi organici (es. 0,5% toluene, etile acetato) o detergenti (es. SDS). Il rilascio di enzimi idrolitici endocellulari completa la degradazione delle membrane e delle pareti (autolisi). Questo metodo è tipicamente utilizzato per i lieviti poiché utilizzandolo si riesce a danneggiare la loro parete. Può danneggiare organelli e macromolecole. Tramite questi detergenti quindi si possono creare dei fori nelle pareti dei lieviti attraverso cui usciranno degli enzimi che ultimano la degradazione della parete attraverso una digestione cellulare.
• Tecniche dei congelamenti/scongelamenti: viene utilizzata spesso in combinazione con la digestione enzimatica delle pareti di batteri o lieviti; questa tecnica si basa sul congelamento e lo scongelamento di cellule a temperature molto basse. Ovvero una volta che la parete cellulare dei batteri viene lisata grazie ad un enzima che ne digerisce le componenti, si possono prendere e surgelare le cellule a temperature molto basse (-190°C vengono immerse nell’azoto liquido) e una volta congelate vengono scongelate per 2-3-4 volte in successione. Questi congelamenti/scongelamenti causano una rottura delle membrane e una fuoriuscita del contenuto cellulare.

Metodi meccanici

La rottura delle cellule è causata da traumi.

• Omogeneizzatori tipo potter: viene utilizzato per omogeneizzare cellule animali e in particolar modo tessuti provenienti da animali; questi omogeneizzatori sono anche detti vetro-vetro/teflon-vetro. Questi omogeneizzatori sono composti da grandi provette, costituite da vetro spesso, all’interno delle qual viene fatto scorrere un pestello (in origine fatto di vetro mentre ad oggi è fatto di teflon). Il tessuto da omogeneizzare viene precedentemente fatto a pezzetti (attraverso un trita carne per spezzettarlo in maniera grossolana) successivamente il campione viene messo all’interno della provetta insieme alla soluzione di lisi e questo composto così formato viene schiacciato dal pestello (ha una testa con un diametro estremamente vicino al diametro della provetta). Schiacciando il pestello verso il fondo del tubo le cellule sono costrette a risalire lungo lo spazio molto sottile che si trova tra il pestello e le pareti della provetta, questo movimento viene aiutato spingendo e rotando il pestello, di conseguenza le cellule sono costrette ad infilarsi in questo spazio e ad essere sottoposte a forze frizionali che le rompono. Questa tecnica viene ampiamente utilizzata quando si vogliano recuperare gli organelli dalle cellule animali perché le forze che portano alla rottura delle cellule non rompe gli organelli.
• Omogeneizzatori a lama: sono sostanzialmente dei frullatori. Prima di utilizzare un frullatore il tessuto viene tagliato a pezzi grossolani e poi viene frullato, in questo caso sia la membrana del tessuto che gli organelli cellulari vengono rotti ad opera dell’impatto delle lame (danneggiano in maniera molto simile cellule e organelli motivo per cui gli organelli non sono preservati). Questa tecnica viene utilizzata sia per i tessuti animali che per i tessuti vegetali.
• Macinazione con mortaio: viene usata particolarmente per le cellule vegetale (poiché essendo dotate di parete cellulare sono più difficili da rompere); in questo caso il tessuto vegetale viene mescolato con una sabbia fine e sterile e successivamente triturate con un pestello a mano. La rottura delle pareti è dovuta quindi all’effetto abrasivo della sabbia, una volta ottenuta la poltiglia possono essere recuperate le cellule filtrando, con una garza, quanto ottenuto. In alternativa i tessuti vegetali possono essere congelati in azoto liquido (a -196°C), ciò rende le pareti particolarmente fragili ed è abbastanza rompere le cellule con un pestello.
• Macinazione con microsfere: viene applicata per le cellule di batteri e di lieviti, questa tecnica si basa su delle piccole sfere di vetro dal diametro inferiore al millimetro. Queste sferette sono mescolate in proporzioni definite con la sospensione di cellule e successivamente questa sospensione viene agitata in maniera vigorosa utilizzando degli strumenti tipo Vortex per diversi minuti; le sferette in agitazione grazie a urti meccanismi frantumano le pareti cellulari causando la fuoriuscita del loro contenuto. L’omogenato sarà poi separato dalle sferette attraverso la centrifugazione in modo che le sfere si depositeranno sul fondo e l’omogenato si sopra-levi.
• Sonicazione: per utilizzare questa tecnica nella sospensione (cellule che galleggiano a metà di una soluzione acquosa) di cellule viene immersa una sonda metallica di un sonicatore, questo vibrando emettere delle onde sonore ad altissima frequenza. Le cellule vengono quindi rotte dalle elevate pressioni locali e dagli effetti di cavitazione (si formano delle bolle di gas all’interno delle cellule che poi le fanno esplodere) indotte da queste onde. Questa tecnica possiede degli aspetti delicati in quanto le onde ad alta frequenza possono danneggiare l’orecchio umano.