Appunti di metodologie biochimiche - 6 cfu

Appunti di metodologie biochimiche

Laboratorio obbligatorio

Il laboratorio è obbligatorio nella 2^a settimana di maggio, divisi in 3 turni più una simulazione virtuale di purificazione di proteine. In laboratorio si effettuerà la purificazione su estratto di cristallino di bovino.

Esame

L'esame consiste in una prova orale e nella stesura di una relazione di laboratorio, che deve essere consegnata almeno una settimana prima dell'esame. L'esame inizia con la discussione della relazione, che deve essere scritta a mano e accompagnata da grafici su carta millimetrata.

Tecniche spettrofotometriche

Sono tecniche basate sulla spettrofotometria. La radiazione elettromagnetica è costituita da due onde: un’onda elettrica e un’onda magnetica che si propagano perpendicolarmente l’una all’altra e al piano di propagazione. I due vettori sono in fase tra loro (i massimi e i minimi dei due campi coincidono).

Le onde sono caratterizzate da una frequenza (numero di volte in cui l’onda ritorna nello stesso stato, si misura in Hz) e una lunghezza d’onda (distanza tra due massimi o due minimi, si misura in m, cm, ecc.). Sono grandezze inversamente proporzionali. λν = costante (velocità della luce nel vuoto "c").

Un’onda elettromagnetica possiede una certa energia che è direttamente proporzionale alla sua frequenza: E = hν (h = costante di Planck, 6,62 x 10^-27 erg sec).

Spettro elettromagnetico

Lo spettro elettromagnetico copre un ampio range di lunghezze d’onda:

• VHF e UHF: usate per le trasmissioni televisive
• Alla spettrofotometria interessano le onde nello spettro del visibile (400-700 nm) e dell’ultravioletto.

Interazione delle radiazioni con gli oggetti

Gli oggetti assorbono parte delle radiazioni elettromagnetiche, mentre le restanti vengono riflesse. Il colore di un oggetto dipende dalla parte riflessa. Regola empirica: scriviamo i colori dello spettro e accoppiamo un colore con quello che si trova tre posizioni avanti. Un oggetto è rosso se assorbe il verde, arancio se assorbe il blu e giallo se assorbe il violetto. Se assorbe tutto è nero, se non assorbe nulla è bianco.

Interazione delle radiazioni con le molecole

Ogni molecola è caratterizzata dall’avere un certo livello energetico che dipende dagli orbitali in cui si trovano gli elettroni. Può avere una serie di livelli per gli elettroni, per le vibrazioni e per le rotazioni, ma non può assumere tutti i livelli energetici esistenti: i livelli sono quantizzati. Quando una molecola viene colpita da una radiazione elettromagnetica, se l’energia dell’onda è esattamente uguale alla differenza di energia che c’è tra lo stato fondamentale (lo stato più basso) e quello successivo, la molecola può assorbire la radiazione e passare allo stato eccitato (Assorbimento).

Le transizioni nello stato roto-vibrazionale sono rese possibili anche dalla radiazione infrarossa poiché è necessaria meno energia! Mentre per far compiere un salto agli elettroni serve l’energia delle radiazioni visibili o dell’ultravioletto. Ci sono molecole più e meno eccitabili: le molecole colorate per esempio sono tali poiché per le loro caratteristiche di legame vengono eccitate dal visibile.

Stati della molecola eccitata

Una molecola eccitata tende a tornare allo stato fondamentale, e possono verificarsi tre situazioni:

• Assorbimento puro: la molecola torna allo stato fondamentale e riemette l’energia assorbita sotto forma di calore.
• Fluorescenza: la molecola torna allo stato fondamentale ed emette una radiazione elettromagnetica che ha una lunghezza d'onda maggiore di quella con cui è stata eccitata (λ > λ₀). L'energia è minore perché tra l’assorbimento e la ri-emissione passa un intervallo di tempo in cui parte dell’energia assorbita viene persa modificando lo stato roto-vibrazionale.
• Fosforescenza: la molecola torna allo stato fondamentale ed emette una radiazione elettromagnetica protratta nel tempo. Questo perché nel lasso di tempo tra assorbimento e ri-emissione avviene un’inversione di spin. Per il principio di Pauli due elettroni nello stesso livello energetico non possono avere lo stesso spin, perciò deve essere re-invertito. Questo è un processo sfavorito che avviene in tempi lunghi.

Queste conoscenze vengono utilizzate per stabilire la concentrazione di una miscela di molecole.

Legge di Lambert-Beer

Mette in relazione l’assorbanza di una molecola con la sua concentrazione. Dalla cuvetta esce un raggio di luce meno intenso, poiché parte dei fotoni viene assorbito. È stato dimostrato che:

ε cd → I = I₀ x 10^-εcd anche definita assorbanza (A).

Le cuvette utilizzate in laboratorio hanno un cammino ottico (d) di 1 cm perciò viene solitamente trascurato. Un’assorbanza = 1 si ottiene quando I = 10I₀. Se invece A=2 vuol dire che I = 100I₀ e questo corrisponde allo 0,1 e che quindi è stata assorbita il 99% della luce.

Coefficiente di estinzione

Il coefficiente di estinzione (M^-1 cm^-1) è una costante che dipende dalla natura del soluto, e rappresenta l’assorbanza di una certa molecola in soluzione con concentrazione unitaria (1M se ε è molare) e un cammino ottico unitario.

Validità della legge di Lambert-Beer

La legge di Lambert-Beer è valida solo a condizione che le molecole si comportino da centri assorbenti indipendenti, ovvero quando la soluzione è sufficientemente diluita. In questo modo non si hanno effetti di mascheramento e le molecole assorbono in modo indipendente l’una dalle altre.

Il grafico di assorbanza in funzione della concentrazione di soluzione è una retta che però, all’aumentare della concentrazione, tende a curvare (misuriamo un’assorbanza minore rispetto alla reale a causa dell’effetto di mascheramento). In queste condizioni vale il principio di additività: in una soluzione contenente due specie A e B, sufficientemente diluite, l’assorbanza totale che andiamo a misurare è uguale alla somma delle assorbanze singole delle due specie.

A_Tot = c_Aε_Ad + c_Bε_Bd

I primi spettrofotometri non misuravano l’assorbanza ma la trasmittanza (T = I/I₀). Su un grafico si ottiene una curva in cui T diminuisce all’aumentare della concentrazione. Possiamo trasformare la curva in una retta passando su un grafico semilogaritmico. Utilizzare l’assorbanza ci dà immediatamente una retta!

Componenti dello spettrofotometro

• Lampada: è la sorgente delle radiazioni. Si utilizzano due lampade per coprire sia il visibile che l’ultravioletto. Una a incandescenza, che contiene un filo di tungsteno, ed emette radiazioni da 1000 a 350 nm (visibile). L’altra è una lampada a fluorescenza: funziona tramite tubi pieni di gas, solitamente deuterio, che eccitato dalla corrente emette radiazioni da 190 a 400 nm (UV). Per evitare l’evaporazione vengono inseriti vapori di iodio che prolungano il tempo di utilizzo delle lampadine. Devono essere di quarzo, poiché il vetro non lascia passare gli UV.
• Monocromatore: seleziona, tra tutte le lunghezze d’onda emesse dalla lampada, quella che ci è necessaria per la misura. La luce viene scomposta tramite prismi o reticoli di diffrazione, e diventa monocromatica.
• Cuvette: possono essere di vario materiale, dipende da cosa dobbiamo misurare. Le migliori sono quelle in quarzo, ma si utilizzano anche quelle di vetro o di plastica. Nel visibile possiamo usare anche quelle di plastica.
• Fototubo: converte i fotoni che riceve in un segnale elettrico, si parla di effetto fotoelettrico. “Meter” (voltometro?): misura la corrente elettrica e quindi l’intensità della radiazione che va a colpire il fototubo.
• Spettrofotometro a doppio raggio: contiene due cuvette, una del campione e una del riferimento (o bianco). Lo strumento sottrae automaticamente il valore del bianco al campione. Il raggio colpisce entrambe le cuvette grazie al chopper, uno specchietto che ruota molto velocemente mandando per un istante il raggio sul riferimento e per un istante il raggio sul campione.

Tutti gli spettrofotometri hanno un intervallo di assorbanze utili limitato, definito campo dinamico dello strumento, che corrisponde all’intervallo di valori di assorbanza per cui la misura è affetta da un errore inferiore al 1%. L’errore dipende dalla natura dello strumento stesso.

Errore = (A_Misurata - A_Teorico)/A_Teorico x 100

L’assorbanza teorica è data dalla legge di Lambert-Beer. Quando effettuiamo misure di assorbanza dobbiamo assicurarci che rientrino nel campo dinamico del nostro strumento. Il campo dinamico dipende dall’errore che noi scegliamo come limite.

Valori di assorbanza

- A bassi valori di assorbanza il campo dinamico è influenzato dal rumore di fondo dello strumento che dipende dalle fluttuazioni dell’intensità di luce emessa. Se una lampada che emette sempre 1000 fotoni ad un certo punto ne emette 1001 avremo uno 0.0004 di incertezza nel valore dello zero! Questo causa un errore nella misurazione, perciò solitamente i valori si leggono fino alla 3^a cifra decimale.

- Ad alti valori di assorbanza il campo dinamico è influenzato dalla luce diffusa: la luce che arriva al fotorivelatore non passando attraverso l’asse ottico principale. Viene misurata un’assorbanza maggiore di quella reale. Se la lampada di prima emette 1000 ma al fotorivelatore arriva un fotone di luce diffusa, si avrà:

• A_T = 2 log(1000/10+1) = 3 Errore: (3-2,699)/3 x 100 = 10%
• A_M = log(1000/1+1) = 2,699
• A₁ = log(1000/100+1) = 1,959 Errore: (2-1,959)/2 x 100 = 2% (> 1%)
• Errore: (1-0.996)/1 x 100 = 0.4% (< 1%)

Spettro di assorbimento

Con uno spettrofotometro si può costruire uno spettro di assorbimento, un grafico che riporta il variare dell’assorbanza in funzione della lunghezza d’onda. All’interno dello spettro si possono identificare punti interessanti, come i picchi (punti con il massimo assorbimento) che corrispondono a valori di λ_MAX.

Questi però valori corrispondono ad una certa concentrazione della sostanza! Per svicolarci da questo limite possiamo misurare ε in funzione di λ.

Esempi di spettro

Sia il NAD che il NADH presentano un picco di assorbimenti intorno a 260 nm, ma solo il NADH presenta un secondo picco a 340 nm. Il primo picco è dovuto alla presenza dell’adenina (le basi azotate assorbono intorno a 260-270 nm). Il secondo picco dipende dalla struttura aromatica della nicotinammide: con la riduzione si perde l’aromaticità. Una struttura in cui si alternano legami doppi e singoli è più facilmente eccitabile, perciò basta un’energia minore (340 nm).

Quando vogliamo farci un’idea della concentrazione delle proteine dobbiamo misurare l’assorbimento a 280 nm: le proteine presentano un assorbimento nella regione degli UV, dovuto prevalentemente al contributo del triptofano (gli altri amminoacidi assorbono a energie leggermente più alte, quindi a λ minori).

Applicazione della spettrofotometria in laboratorio

Da uno spettro noi possiamo andare a definire una certa concentrazione di un composto in soluzione. Immaginiamo di voler preparare una soluzione di NADH 1 mM: facciamo una pesata di NADH e lo inseriamo nella nostra soluzione. Però sappiamo che le pesate sono soggette ad errori, perciò misuriamo la sua assorbanza a 340 nm per ricavarne la concentrazione. Ottenuto il valore di assorbanza la ricaviamo dalla legge di Lambert-Beer. (Dobbiamo sottrarre all’assorbanza misurata il valore del bianco).

Per molti composti non abbiamo spettri disponibili da cui ricavare λ a cui fare le misurazioni. Possiamo utilizzare uno standard di riferimento: se voglio conoscere la concentrazione di un campione incognito X mi creerò una soluzione a concentrazione nota dello stesso composto X.

ε_C = c_Cd (campione) → A_C = c_Cd

ε_ST = c_STd (riferimento) → A_ST = c_STd

Se faccio il rapporto ottengo: A_C/A_ST = c_C/c_ST di conseguenza c_C = (A_C/A_ST)c_ST.

Solitamente non si fa un’unica misura, ma si costruisce una curva di calibrazione: misuriamo diverse concentrazioni della nostra soluzione, diluendola. Costruiamo un grafico A(c) e otteniamo una retta. Poi misuriamo l’assorbanza del nostro campione incognito e troviamo la concentrazione corrispondente alla nostra cuvetta. Moltiplichiamo il valore per il fattore di diluizione e otterremo la concentrazione.

Se vogliamo lavorare con molecole che non assorbono possiamo farle reagire con un colorante o con un’altra molecola che assorbe, e misurare l’assorbanza del complesso che si forma.

Lavorare con le proteine

• Metodo del biureto: Si basa sulla formazione di un complesso colorato (colore blu-violetto) quando al campione proteico si aggiunge una soluzione alcalina di solfato di rame. Gli amminoacidi e i dipeptidi non danno questo risultato. È un metodo molto specifico perché il rame si va a legare specificamente ai legami peptidici, ma non molto sensibile (richiede concentrazioni di almeno 1 mg/ml).
• Metodo di Lowry: Abbiamo un complesso fosfotungstomolibdico che reagisce con i fenoli dando un colore blu intenso: reagisce con le tirosine. È un metodo molto più sensibile, perciò possiamo usare concentrazioni più piccole, ma è meno specifico perché dipende dal numero di tirosine presente nella catena polipeptidica.

Lavorare con gli enzimi

Grazie all’equazione di Michaelis e Menten possiamo misurare la concentrazione dell’enzima tramite la misura della velocità (in condizioni saturanti).

Se [S] >> Km; v₀ ≈ k₊₂ [E_T] in altre parole in condizioni saturanti la velocità misurata dipende dalla concentrazione dell’enzima.

• Unità enzimatica: quantità di enzima necessaria a convertire 1µmol di substrato al minuto nelle condizioni standard di saggio. Ma quali sono le condizioni standard?
• Concentrazioni saturanti di substrato
• pH ottimale per l’enzima
• Eventuali cofattori o molecole metalliche in concentrazioni saturanti
• Temperatura standard 30° (convenzione)

Non si può stabilire una temperatura “ottimale”, ma piuttosto una di “stabilità”. Questo perché, in linea empirica, aumentare di 10° la temperatura raddoppia la velocità (e si può aumentare finché l’enzima non raggiunge il suo limite di stabilità e si denatura). Se devo lavorare con un enzima che utilizza un cofattore come il NADH devo fare attenzione perché è un cofattore che assorbe, perciò spesso non possiamo inserirlo in concentrazioni saturanti ma ne inseriamo una quantità minima necessaria a far funzionare l’enzima.

Nel sistema internazionale non si utilizzano le µmoli, ma le moli, perciò l’unità enzimatica da utilizzare sarebbe il katal: quantità di enzima necessaria a convertire una mole di substrato al secondo. 1 katal = 6x10⁷ IU.

Misurazione della concentrazione di un enzima

Abbiamo detto che possiamo misurare la concentrazione di un enzima tramite la velocità della reazione che catalizza. La velocità corrisponde alla variazione di concentrazione dei reagenti nel tempo, e noi le possiamo misurare tramite i valori di assorbanza. Ad esempio, per la Lattato deidrogenasi (LDH): Piruvato + NADH → L-Lattato + NAD

Poiché NADH e NAD hanno spettri differenti possiamo seguire le loro variazioni di concentrazioni. Ci mettiamo a λ = 340 nm perché abbiamo una differenza di assorbanza molto maggiore (differenza tra i due spettri massima): a 260 abbiamo una differenza di ε di solo 3000, mentre a 340 la differenza è il doppio! Dobbiamo sempre metterci nel punto a maggiore differenza.

Inoltre in un estratto di cellule abbiamo anche i nucleotidi che a 260 nm possono interferire con la misurazione, quindi è meglio evitare a meno che non si abbia un estratto di enzima puro. Mi aspetto di vedere dei valori di assorbanza che diminuiscono, perché il prodotto che si sta formando (NAD) assorbe meno del substrato che sta scomparendo (NADH).

Dosaggio enzimatico

Come si esegue un saggio spettrofotometrico:

1. Si mescolano nella cuvetta tampone e reagenti della reazione e si aggiunge il campione nel quale si intende misurare l’attività enzimatica di interesse.
2. Si misura il decremento (incremento) di assorbanza associato alla conversione dei reagenti della reazione.

Mettendo in una cuvetta i reagenti della reazione:

• Piruvato
• NADH
• Tampone
• Campione di cui vogliamo misurare l’enzima

Misuro l’assorbanza a 340 nm. Prima non metto l’enzima, e rileverò una certa assorbanza. Metto poi l’enzima e vedo che ho un calo dell’assorbanza perché il NADH viene convertito a NAD, il quale assorbe meno a 340 nm. La variazione dell’assorbanza dipende da come sono messi i due spettri: non dipende dal fatto che uno dei composti aumenta e l’altro cala, se ad esempio mi mettevo a 260 nm avrei visto un aumento dell’assorbanza. Ricordiamoci che stiamo lavorando con un enzima che segue la cinetica di Michaelis e Menten.

Guardando la mia curva di cinetica temporale, via via che il mio substrato diminuisce mi aspetto che la pendenza inizi a diminuire, andando ancora avanti la mia velocità diventerà 0 (tangente alla curva) e l’assorbanza.