Appunti di metodologie biochimiche - 6 cfu

ISOELETTROFOCUSING:

Tipo di elettroforesi che separa le molecole in funzione delle cariche.

Ogni proteina è caratterizzata da un PI, il valore di pH per cui la carica netta dell’anfolita è nulla.

Il punto isoelettrico viene sfruttato in questa tecnica di separazione.

È la tecnica elettroforesica con maggiore risoluzione, riuscendo a separare proteine con una

differenza di PI di 0,0,1 unità di pH.

Le proteine vengono fatte correre su un gel che presenta un gradiente di pH.

La separazione avviene applicando una differenza di potenziale alle estremità del gel. Le

proteine tenderanno a focalizzarsi in una zona del gradiente in cui la lor carica netta è nulla.

Per la formazione del gradiente di pH sul gel un acido (generalmente acido fosforico) viene posto

all’anodo, una base (NaOH) al catodo.

Quando si accende l’alimentatore gli ioni H+ tenderanno a migrare verso il catodo, gli ioni OH-

verso l’anodo, creando un gradiente di pH, con i valori più acidi vicino all’anodo ed i valori più

basici vicino al catodo. Tale gradiente di pH risulterebbe estremamente instabile, se non venisse

stabilizzato introducendo nel gel polielettroliti sintetici, polimeri a basso peso molecolare che

coprono un ampio intervallo di punti isoelettrici. La composizione dei polielettroliti è in genere

coperta da brevetto e le case produttrici più importanti sono l’LKB, la Bio-Rad e la Pharmacia.

PROCEDIMENTO

Inanzitutto creo sul gel un gradiente di pH.

Il gel usato contiene una bassa % di poliacrilammide, con maglie langhe per limitare gli effetti

del setaccio molecolare. Questo rende il gel molto fragile, e per questo vengono depositati su

delle lastre di plastica o vetro.

Per creare u gradiente di pH si usano 2 striscioline di carta da filtro imbevute rispettivamente

con una base forte e un acido forte. Quella con acido fosforico la depositi all’anodo, l’altra al

catodo.

Due elettrodi costituiti da carta da filtro imbevuta di acido fosforico (ANODO) e NaOH (CATODO)

vengono posti su due lati opposti del gel. Si applica quindi un differenza di potenziale che crea

un gradiente di pH tra anodo e catodo.

Accedo l’apparecchio, e dissociandosi le mie specie, avrò una migrazione di OH- dal catodo al

anodo, e di H+ verso il catodo, generando un gradiente di pH, più acido all’ anodo e più basico al

catodo

Come faccio a mantenere il mio gradiente stabile? Se fosse un solo pH userei un tampone solo,

ma avendo un range ampio ho bisogno di più tamponi che mi stabilizzino i vari pH. Si usano

sostanze chiamate anfoline, con composizione non nota, che hanno le seguenti caratteristiche

per funzionare bene da tampone:

• Il range di pH si trova tra +1 e -1 dal valore di pKa dei gruppi che si dissociano nella

molecola: ex la glicina funziona bene ntorno a pH 3,4 e 8,9 quindi queste sostanze

→

dovranno avere più gruppi con pKa differenti in modo da poter tamponare l’intervallo di

pH che abbiamo creato nel nostro gel.

Il macchinario è collegato a un sistema di raffreddamento, formato da due tubi collegati a una

pompa che mi fa muovere un liquido che raffredda.

Metto la lastra di gel e metto il supporto che contiene gli elettrodi, faccio andare per 20 minuti,

si crea la mia differenza di potenziale e quindi il mio gradiente.

Dopo aver interrotto l’alimentazione, prendo un quadratino con carta da filtro contenente il mio

campione e , lo appoggio sul gel, do corrente e esse inizieranno a migrare sul gel.

Queste proteine avranno carica positiva se si trovando a un pH più basso del PI e carica negativa

se si trovano a un pH maggiore del PI.

Le proteine solitamente si caricano al centro del gel, perché se creo un gradiente da 3 (all’anodo)

a 10 (al catodo), verso il centro avrò un pH fisiologico, a cui le proteine sono molto più stabili.

Appunti di Metodologie biochimiche

Le proteine si sposteranno, con velocità sempre più lenta fino a fermarsi al pH=PI., a questo

punto le posso fissare e colorare sul mio gel.

Le molecole tendono per loro natura a diffondere anche quando sono al loro PI, ma se

diffondono, riacquistano carica e quindi vengono richiamate nel punto in cu i c’è il loro PI.

Questo permette alla tecnica di avere un elevata risoluzione.

Quindi appena spengo l’alimentatore della corrente, le fisso in modo tale da impedire eventi di

diffusione che le farebbero rimescolare.

Una volta fissate posso andare a costruire il grafico per determinare il loro PI, al solito facendo

uno standard con proteine con PI noto con cui fare una retta di calibrazione.

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE

Mettendo insieme la separazione in base al PI e in base alle dimensioni, ottengo questa tecnica

Comprendo sue fasi:

1. Isoelettrofocusing

2. SDS PAGE

Per prima cosa carico il mio campione su un tubicino di gel in cui ho creato un gradiente di pH,

con un range più limitato, visto che io le carico agli estremi.

Alla fine della corsa elettroforesica avrò le proteine separate in base al PI.

Estraggo il mio cilindro di gel e lo pongo a contatto con una lastra di gel di poliacrilammide in

condizioni denaturante (cioè contenente SDS e beta mercaptoetanolo). Facilito il passaggio delle

proteine, che avviene per semplice contatto, colando un po' di poliacrilammide, e le vado a far

separare in base alle dimensioni.

Quello che ottengo è una lastra con macchie corrispondenti alle proteine.

Nella slide proteine di E.coli,

questa tecnica è usata per analizzare il proteoma,

permettendo di separare un un'unica tecnica tutte le

proteine di un campione.

È una tecnica che si è sviluppata negli ultimi anni,

perché la analizzo mediante un densitometro, ma poi

fare un confronto tra le varie macchie di diverse lastra

è possibile solo grazie a software di bioinformatica

che funzionano sovrapponendo due lastre, fissano dei

punti di riferimento costanti, ex proteine costitutive, e

li ricercano nelle varie lastre per vedere le differenze.

Come evidenzio le molecole che ho separato con elettroforesi?

Ci sono una serie di coloranti che scelgo in base a cosa voglio vedere

Le più comuni colorazioni sono:

• Blue di comassie→ colorante si lega alle proteine, creando nel gel bande di colore blu. È

una colorazione abbastanza sensibile ma non tantissimo.

• Se ho pochissime proteine posso usare la colorazione con nitrato di argento, che è

sensibile ma poco specifico in quando l’intensità delle bande formate non è

proporzionale alla quantità di proteina che c’è.

• Per evidenziale glicoproteine uso un acido periodico e reattivo di Schiff per evidenziare

la parte glucidica Appunti di Metodologie biochimiche

• Per le lipoproteine come il colesterolo, uso colorante che evidenzia lipidi, detto Sudan

nero

• Per gli acidi nucleici uso bromuro di etidio che si intercala tra le basi

L’elettroforesi condotta su un supporto dà il vantaggio di poterla accoppiare ad altre tecniche

analitiche come il→ BLOTTING

BLOTTING

Tecnica con cui trasferisco le molecole separate su gel, su un altro supporto immobilizzante che

mi permette di effettuare ulteriori analisi.

3 tipologie:

• Northern blot→RNA

• Southern blot→DNA

• Western blot→PROTEINE

Western blot

supporto di nitrocellulosa su cui blocco le mie proteine, grazie a legami irreversibili dovuti a

interazioni idrofobiche, e effettuo nuove analisi come ad esempio rilevare una proteina che lega

uno specifico anticorpo.

Inserisco anticorpo e poi evidenzio legame con ad esempio un secondo anticorpo legato a un

sistema di rilevazione.

Oppure se cerco una proteina che catalizza una razione posso mettere il suo substrato

direttamente con un colorante.

Due tipi di Western blotting

1. Capillarity Blotting→ supporto con

tampone carta per cromatografia, poi gel,

con sopra filtro di nitrocellulosa, carta da

cromatografia e peso.

→

2. Electroblotting lastra elettroforesica

poi foglio di nitrocellulosa e due spugnette

imbevute di tampone in cui si crea una

differenza di potenziale?

Appunti di Metodologie biochimiche 19/04/18

ELETTROFORESI CAPILLARE

La separazione delle molecole viene effettuata utilizzando dei capillari in quarzo fuso, di

diametro estremamente ridotto (20-200 micron) e lunghi da 50 a 100 cm. Questo vuol dire che

c’è un elevato rapporto superficie/volume e si ha una grande dispersione del calore.

Il diametro ridotto del capillare fa sì che sia molto alto il rapporto superficie/volume e ciò

aumenta la dispersione di calore riducendo i moti convettivi e la diffusione degli analiti: non c’è

quindi bisogno di mezzo di supporto e l’elettroforesi capillare è un’elettroforesi in fase libera.

Accoppiando questo efficiente eliminazione di calore con un impianto di raffreddamento, ci

permette di usare correnti elevate.

Due tipi di capillare:

• uncoated: non rivestiti, in cui la superficie interna di quarzo non ha rivestimento

il quarzo contiene gruppi silanoici che a pH intorno a 3, sono deprotonati sotto forma di SiO-,

rivestendo la sup interna del capillare di cariche negative

Il flusso elettroendoosmotico→ il flusso di tampone con ioni positivi si disporranno in

corrispondenza delle cariche negative

Applicando una corrente, le cariche +si muoveranno verso il polo negativo, in modo più veloce

rispetto alle molecole cariche negativamente, perché la migrazione elettroforetica e il flusso

elettroendoosmotico hanno la stessa direzione; anche le molecole neutre, pur prive di carica, si

muovono verso il catodo trascinate dal flusso elettroendoosmotico.

La velocità con cui ci arrivano dipende dalla carica della molecola, quelle + sono e più veloci

perché si combinando due effetti (flusso elettroendoosmotco + corrente), poi le neutre e poi le

negative.

Il fenomeno dell’elettroendoosmosi è dovuto alla presenza di gruppi carichi sul mezzo di

supporto; nei capillari “uncoated” sulla superficie interna del capillare sono presenti gruppi

silanolo, -SiOH, che a valori di pH superiori a 3, sono deprotonati. Ciò genera uno strato di

cariche negative che trattiene uno strato di carche positive dell’elettrolita (regione di

separazione di carica). Quando viene applicata una differenza di potenziale, i cationi

dell’elettrolita vicini alla parete migrano verso il catodo, trascinando con sé la soluzione

dell’elettrolita.

Il flusso elettroendoosmotico ha velocità più elevata della velocità di migrazione degli analiti in

soluzione, per cui questi ultimi, indipendentemente dalla loro carica, si spostano tutti verso il

catodo.

Questo è valido per i capillari uncoated, usati per separare molec