Appunti Fisica per la bioingegneria

Sommario

Fluorescenza ...................................................................................................................................................... 1

Microscopio ottico ............................................................................................................................................. 8

Dark, Bright field e fluorescenza ................................................................................................................. 11

WIDE FIELD, MICROSCOPIA LASER .................................................................................................................. 14

MICROSCOPIA OTTICA NON LINEARE .............................................................................................................. 19

Microscopia, generazione di seconda armonica ............................................................................................. 23

Microscopia Raman ......................................................................................................................................... 28

Microscopia CARS ........................................................................................................................................ 32

Total Internal Reflection microscopy (TIRF) .................................................................................................... 34

Microscopia Fret .............................................................................................................................................. 35

Lifetime fluorescence microscopy FLIM .......................................................................................................... 36

Microscopia con deconvoluzione .................................................................................................................... 37

Microscopia 4pi ............................................................................................................................................... 38

Microscopie a super risoluzione ...................................................................................................................... 39

Illuminazione strutturata ............................................................................................................................. 39

STED: Stimulation Emission Depletion ........................................................................................................ 43

Localizzazione .............................................................................................................................................. 44

Molecole fotoattivabili (Palm e Storm) ....................................................................................................... 45

Appunti di Fisica per la bioingegneria, mancano le prime due lezioni. La Microscopia a foglio di luce è alla

fine e sono le informazioni usate nella relazione.

Fluorescenza

La fluorescenza è la capacità che hanno alcuni oggetti o minerali di assorbire una

luce di un particolare colore e di emettere luce a un colore diverso. In sostanza è la

capacità di far cambiare il colore della luce.

Il concetto di fluorescenza fu formalizzato per la prima volta da Stokes, esso fece un

esperimento ingegnoso all'interno di una chiesa con dei vetri colorati. Lui scelse

delle finestre di colore blu e quindi, la luce che attraversava queste finestre veniva

filtrata facendo entrare nella chiesa solo una luce blu. Utilizzò poi una soluzione con

del chinino e si posizionò a 90 gradi. Osservò la soluzione attraverso dei bicchieri di

vino fatti in vetro giallo e in questo modo filtrava tutte le lunghezze d'onda al di

sotto dei 400. La luce blu non riusciva a passare dal suo bicchiere di vino e quindi

guardando la soluzione di chinino dal suo bicchiere, notava che emetteva luce, ma

non era la stessa luce perché aveva un colore diverso a causa del suo bicchiere. Si

accorse che la lunghezza d'onda emessa dalla soluzione era maggiore rispetto la

lunghezza d'onda incidente. C'è quindi uno spostamento della lunghezza d'onda tra

la lunghezza d'onda di eccitazione e la lunghezza d'onda di fluorescenza,

quest'ultima è sempre maggiore della lunghezza d'onda di eccitazione. Questo

spostamento si chiama Stokes Shift. In termini energetici vuol dire che la luce di

fluorescenza è composta da fotoni a meno energia. In questo caso i fotoni venivano

assorbiti dalla chinina.

Come fa la chinina ad assorbire i fotoni? Possiamo approssimare la molecola di

chinina come un sistema a due livelli, un primo livello energetico che chiamiamo

Ground State e un

livello energetico che

chiamiamo Banda

Eccitata. Ovviamente

una approssimazione

di questo tipo non può

giustificare lo Stoke

Shift. Un sistema a

due livelli funziona in

questo modo:

• Nel momento in

cui investiamo il

sistema con un fotone, che ha una energia uguale al gap energetico tra un

livello e l'altro, succede che il sistema può assorbire energia attraverso una

transizione elettronica che si chiama α.

• Quando l'elettrone si trova nel sistema eccitato, ha due scelte cioè o un

decadimento spontaneo kr, cioè riemette un fotone spontaneamente, oppure

abbiamo un decadimento stimolato cioè sfrutta l'arrivo di un altro fotone per

stimolare il suo rilascio energetico.

Un sistema di questo tipo non può spiegare lo Stoke shift perché abbiamo le stesse

energie e perché questa è anche una approssimazione.

Gli spettri delle molecole sono molti complessi, una molecola può assorbire energia

non solo per transizioni energetiche elettroniche, ma anche vibrando (accumulo per

vibrazione) oppure con una rotazione. Abbiamo delle bande rotovibrazionali molto

fitte. Quindi le transizioni energetiche possiamo vederle come l’insieme di

transizioni elettroniche che sono quelle grandi, ma accompagnate a queste abbiamo

delle bande rotovibrazionali. Un sistema di questo tipo può generare lo Stoke Shift.

La prima banda del livello rotovibrazionale la chiamiamo S e la seconda banda del

0

primo livello elettronico eccitato S . Supponiamo che un elettrone si trova a fondo

1

banda quindi, quando mandiamo ed eccitiamo la molecola con un fotone, che ha

una energia uguale a una transizione energetica garantita tra i livelli S e S la

0 1,

molecola si può eccitare. Una volta eccitata quello che avviene è un rilassamento

rotovibrazionale, cioè la molecola perde energia arrivando a fondo banda del primo

livello elettronico eccitato (questo succede per scambi termici con le molecole

vicine). A seguito di questo

rilassamento che è

estremamente veloce

(picosecondi), la molecola

quindi ha due modi per

decadere, o radiativo kr e

cioè rilascia un fotone

emettendo luce oppure

tramite un decadimento

non radiativo non emettendo luce knr (per esempio per collisioni termiche, chimica).

Questo processo può spiegare l'emissione dei fotoni kr, che hanno una energia

minore. La perdita di energia è dovuta proprio a quella fase di rilassamento che fa

quindi rilasciare un fotone ad energia minore ma a lunghezza d'onda maggiore.

Chiamo S (t) e S (t) la probabilità di trovare un elettrone nelle due bande. La somma

0 1

deve essere sempre uguale a 1.

Se faccio la derivata rispetto al tempo:

Il primo termine è col segno -αS poiche vado da S a S , il secondo termine è la

0 0 1

somma dei kr e knr per S . Ci sarà in un momento, una fase stazionaria in cui ci

1

saranno molecole che escono e tante molecole che entrano, questo momento lo

trovo ponendo a zero.

Possiamo risolvere adesso l'equazione sostituendo a S il valore 1-S .

0 1

τ è detto tempo di vita media del sistema eccitato.

Andiamo a quantificare S perché così posso quantificare i fotoni di fluorescenza.

1

Infatti, così so quale è la probabilità che avvenga l'evento kr. Kr moltiplicato per S1

mi rappresenta proprio il rate che avvenga la transizione:

ma se questa transizione induce la fuoriuscita di un fotone, il rate della transizione è

anche uguale al rate di fotoni, cioè a quanti fotoni escono fuori. Questo rate di

fotoni che escono fuori lo posso scrivere uguale alla potenza di fluorescenza (w)

diviso quanto è l'energia del singolo fotone di fluorescenza. Ottengo alla fine

l'equazione per la potenza d fluorescenza.

Possiamo avere due regimi:

Il primo regime è dove ατ è molto minore di 1 che equivale a dire che α è molto

minore di kr e knr. Quindi questa molecola ha una probabilità in uscita verso S 0

molto minore della probabilità in ingresso da S . Posso quindi determinare alfa.

1

Ricordo inoltre a quanto fosse uguale la potenza grazie alla sezione d'urto e mi trovo

il valore della potenza. q è per definizione definito kr /(kr +knr). Il fattore q ha un

senso fisico importante si chiama quantum yield, potenza quantica. Essa

rappresenta quanto è grande kr rispetto ai canali di uscita. Se kr, ad esempio, è

uguale a zero significa avere una pessima molecola fluorescente. Se kr fosse 1

avremmo il caso opposto. È ovvio che questa equazione ci dice che più è forte

l'intensità della luce più abbiamo fluorescenza, in più è

proporzionale alla sezione d'urto di assorbimento perché deve saper assorbire, e

infine proporzionale a q.

Se consideriamo adesso α molto maggiore di 1, significa che alfa è molto maggiore

di kr+knr e che quindi il canale di uscita è molto più probabile di quello di ingresso.

Quindi in questo caso la potenza della saturazione deriva da tutte componenti

costanti, questo spiega semplicemente la saturazione. Immaginiamo che io aumento

l'intensità e inizio a sparare fortissimo i fotoni, ad un certo punto i fotoni non

avranno più tempo di andare in ingresso a S . Rimangono intrappolati in S , poiché

0 1

prima di decadere loro si trovano su S e l'ordine di vita è dei nanosecondi quindi, se

1

mando un fotone prima che lui sia sceso in S il fotone non serve a nulla. Quindi se

0

ho popolato tutto S sono vincolato da kr. Non ha senso mandare tanta energia

1

perché poi si raggiungerà la saturazione.

Tutte queste considerazioni non corrispondono alla realtà. Gli elettroni si

accoppiano con spin antiparalleli, stato di singoletto. Questo ci serve per capire

come si dispongono i vari elettroni negli strati di energia. Il problema è che quando

eccitiamo la molecola non c'è più il principio di esclusione, quindi, non devono per

forza stare nello stato di singoletto ma si possono accoppiare in diverse

configurazioni.

Possiamo avere lo stato di singoletto, oppure lo stato tripletto.

Quando siamo in S gli spin sono accoppiati in modo antiparallelo per avere la

0

risultante di momento angolare uguale a zero. Quando noi eccitiamo la molecola

non c'è più alcun principio di esclusione che tenga, quindi questi due si possono

accoppiare in vari modi, o stato di singoletto oppure stato di tripletto dove il

momento è diverso da zero. Lo stato di tripletto lo abbiamo a causa delle interazioni

tra gli spin elettronici e nucleari e non ha una banda energetica uguale.

Uno spettro molecolare è questo:

Possiamo avere anche uno stato di tripletto cioè un altro livello rotovibrazionale

quasi uguale a S ma con una energia più bassa in cui però la configurazione dei due

1

spin è in uno stato di tripletto diverso da S . A causa di urti con le molecole si può

1

generare intersisting crossing, cioè l'urto fra le molecole crea uno scambio di spin,

questo intersisting è di una grandezza di millisecondi e rispetto a kr e knr ha una

tempistica diversa. È poco probabile quindi entrarci ma è anche poco probabile

uscirci. Quindi la molecola che poi genera uno strato di tripletto rimane

intrappolata nel suo stato (dark) e la probabilità che poi ne esca è comunque bassa.

Questo genera il photo blinking, nel grafico sono quelle perturbazioni in basso.

Quindi questo per dire che la molecola genera una potenza che è sempre la metà di

quella che potrebbe offrire perché metà della vita lo passa nello stato dark.

Può succedere che la molecola può andare in uno stato irrecuperabile k bleaching e

quindi non è in grado di generare fluorescenza. Lo hanno scoperto perchè hanno

notato proprio che dopo un po’ la fluorescenza perdeva di intensità. A volte,

comunque, il tripletto può generare un kt che è radiativo e può emettere luce. In

questo caso si parla di fosforescenza.

La fluorescenza serve per marcare determinate cellule e tessuti in modi diversi.

Ovviamente è difficile inserire delle sonde nelle cellule e ci sono diversi metodi.

Grazie alla scoperta di questa medusa fosforescente si è scoperta una proteina

fluorescente capace di assorbire luce blu e illuminarsi di verde. Questa proteina è

chiamata GFP (Green Fluorescence Protein) e ha rivoluzionato la microscopia. Basta

quindi fare una manipolazione genetica per far in modo che la cellula la produca,

posso anche scegliere il dove nella cellula.

Microscopio ottico

Questo è un microscopio ottico, è costituito da un corpo chiamato stativo che è la

parte meccanica del microscopio. È molto complessa da un punto di vista mecca-

nico, questo perché c’è il bisogno di una stabilità che è proporzionale al livello risolu-

tivo. Abbiamo due tipi di microscopio, dritto o invertito. Il primo, il microscopio

dritto ha l'obbiettivo verso l'alto rispetto al campione, quindi il sistema di illumina-

zione con il condensatore che convoglia la luce è posto sotto. Sono comodi perché il

campione viene messo a testa in su. Tutto il sistema di acquisizione però è sbilan-

ciato rispetto al resto del sistema. Possiamo al massimo avere meno precisione per-

ché la stabilità meccanica può essere compromessa. Il microscopio invertito invece

ha una configurazione opposta, cioè il condensatore e il sistema di illuminazione è

verso l'altro e il campione verso il basso. È più stabile, però il campione viene messo

a testa in giù.

In microscopia o usiamo la tecnica di assorbimento o quella di diffusione.

Per fare questo si utilizzano delle radiazioni, usiamo infatti delle lampade alogene al

tugsteno. Abbiamo una lampada ad alta potenza e un sistema di ventilazione per

evitare che esploda. Abbiamo poi una lente di collettore che serve per raccogliere la

luce e spedirla verso il microscopio.

Per creare una illuminazione uniforme, si porta inizialmente il filamento ad alte tem-

perature, quindi con emissione da corpo nero con uno spettro accettabile. La luce

deve essere convogliata, in questo caso non abbiamo una sorgente puntiforme, in-

fatti, se avessimo una sorgente puntiforme potremmo mettere la sorgente al fuoco

di una lente convergente in modo che i fasci che escono dalla sorgente e che usci-

ranno dalla lente saranno collimati, e, quindi avremo una propagazione di onda

piana e un fronte d'onda omogeneo. In questo caso invece non abbiamo una sor-

gente puntiforme ma un filamento di una lampadina con le sue dimensioni. Il trucco

è come sfruttare tutta la luce del filamento per fare una illuminazione uniforme. Per

prima cosa potremmo utilizzare un sistema che riproduce l'immagine del filamento

dove c'è il nostro oggetto. Così

avremo una alta efficienza di tra-

sferimento della luce però ab-

biamo un’immagine non uniforme.

Un approccio utilizzato è l’illumi-

nazione di Kohler. Si mette una

lente di collettore in prossimità

della lampada, questa lente convergente è posta a una distanza f rispetto al fila-

mento; quindi, i punti luminosi distribuiti lungo il filamento vengono raccolti con an-

goli diversi ed escono dalla lente collimati con angoli diversi dall'altro. Utilizzo un'al-

tra lente detta field lens che va a riformare l'immagine del filamento in una certa po-

sizione e, in prossimità del filamento

viene posto un condensatore. Il conden-

satore è una lente ad alta apertura nu-

merica che focalizza estremamente la

luce. Si crea quindi una immagine sulla

lente ed essa si comporterà come la

prima lente, i fasci così usciranno colli-

mati. L 'idea è quella di mettere il cam-

pione nel fuoco della lente del condensatore. Nel secondo fuoco del condensatore

quello che abbiamo sono tutti i punti del fascio collimati che andranno a convo-

gliarsi. Abbiamo il punto di massima illuminazione ed è estremamente uniforme. Il

condensatore è una lente complessa dove abbiamo diverse lenti all'interno. Infatti,

le lenti semplici presentano le aberrazioni ottiche. Esse sono di due tipi, monocro-

matiche e cromatiche. Sono una sorta di “difetti”. Le prime sono delle aberrazioni

che riguardano una singola lunghezza d'onda dove la lente non si comporta come ci

saremmo aspettati. La seconda invece riguarda i colori cioè ci accorgiamo che i co-

lori si comportano in maniera diversa. La più grande forma di aberrazione si chiama

sferica, in genere si dice che le aberrazioni sono dei difetti ma non è cosi, la lente

esegue il suo compito, nella realtà però alcune approssimazioni che si fanno non

corrispondono a verità. In particolare, una lente biconvessa in condizione standard

ha un punto di fuoco che convoglia tutti i fasci che si propagano paralleli all'asse ot-

tico, essa segue questa formula che dipende dalla geometria della lente:

Quindi qualunque fascio va a cadere nel fuoco. In realtà non è così, i fasci che sono

più vicini all'asse ottico principale, vengono focalizzati in un punto di fuoco che è più

distante rispetto ai fasci che sono più di-

stanziati r