Appunti Fisica per la bioingegneria

WIDE FIELD, MICROSCOPIA LASER

La microscopia a wide field è quella più usata ed è detta a campo largo. Abbiamo una sorgente luminosa, un sistema di illuminazione di kohler, avendo a che fare con una sorgente estesa. Abbiamo lo specchio dicroico, il campione assorbirà poi la luce di eccitazione. Lo stesso obbiettivo prenderà poi la luce e ripasserà nello specchio dicroico, abbiamo poi un filtro per la fluorescenza ecc.

Il problema di questo sistema è che non abbiamo modo di sezionare il campione in 3 dimensioni. È come se tutti i contributi dei vari piani di eccitazione messi a fuoco venissero schiacciati sul sensore mentre gli altri li vedremo sfocati.

Quando utilizziamo una illuminazione di kohler, quello che succederà, è che il piano a fuoco del sistema 4f andrà a formare una immagine, ma anche i piani sopra e sotto essendo illuminati verranno proiettati nel piano immagine ma fuori fuoco. La microscopia wide field

è incapace di sezionare il campione e la si utilizza quando non ab-biamo campioni tridimensionali.

Introduciamo un metodo per effettuare una microscopia in 3d. Parliamo quindi di microscopia confocale. Prendiamo la sorgente estesa che può essere una lampada o un led e la rim-piazziamo con una sorgente collimata ad esempio un laser ( i fotoni sono coerenti tra di loro), infatti all'uscita del laser si riesce a selezionare dei fotoni estrema-mente collimati. Quando il laser incontra il dicroico viene riflesso e trova l'obbiet-tivo, esso si ritrova un fascio collimato e andrà a focalizzare tutto il contributo di luce nel suo piano focale. Così non ab-biamo risolto la cosa, cioè è vero che ab-biamo nel fuoco la densità massima dei fasci, ma nei vari piani avremo una luce meno densa. Anche in questo caso eccitiamo molecole fuori fuoco e se saranno ec-citate daranno contributi. Il trucco è che avendo a che fare con un singolo punto

Nella parte di illuminazione possiamo mettere un filtro spaziale chiamato pin hole nel piano immagine (un buchino piccolissimo). Questo filtro permette di far passare solo il contributo di fluorescenza proveniente dal fuoco, mentre i punti di fluorescenza che si trovano al di sopra o al di sotto del fuoco vengono schermati e si focalizzano in un punto più lontano.

Inoltre, ci sarà un detector che raccoglie la luce, ma in questo caso non sarà planare, ma andrà a prendere le informazioni di luce. Possiamo quindi fare una scansione del fascio laser (laser scanning). Scansionando piano per piano, si riesce a ricostruire l'immagine spostando l'obiettivo per ottenere le informazioni tridimensionali e creare una bit map che poi il software ricostruisce.

Il campione non viene spostato, ma si sposta il fascio. Basta inclinare il fascio sull'asse ottico e il fuoco si sposta. Il pin hole è posto dopo il sistema di scansione.

Il laser, prima di entrare nell'obbiettivo, passa prima dal dicroico e poi da un altro specchio (oscillating) che inclina il fascio rispetto all'asse ottico principale e così sposta la posizione del fuoco nel piano di fuoco. Quindi, una volta arrivato al campione, il fascio uscirà fuori comunque con la stessa inclinazione verso lo specchio oscillante e quindi si raddrizzerà il fascio di illuminazione. Tutto ciò è velocissimo, infatti, la scansione sarà velocissima. Rispetto alla risoluzione di un wide field, questo in teoria ha il doppio di risoluzione. Questo perché quando si va ad eccitare, focalizziamo un fascio con una lente e non troviamo un punto matematico ma una psf. Essa ha delle dimensioni fisiche (0,68lamda ecc) quindi il nostro fascio di eccitazione quando noi andiamo con fascio collimato dentro una lente mi formerà una pfs secondo quella formula. Nella microscopia con focale però è anche presente il pin hole.

Anche in questo caso, il buchino infinitesimo non lo dobbiamo vedere come un punto matematico. La probabilità che un fotone si trovi in un punto raccoglibile dal detector è uguale alla probabilità che venga eccitato e seguirà la psf in verde in basso, maggiore siamo vicini all'asse ottico maggiore sarà la probabilità di eccitazione perché maggiore sarà l'intensità di luce e quindi man mano che ci allontaniamo la probabilità calerà. La probabilità di eccitazione segue la psf di eccitazione mentre la probabilità che passi nel buchetto è la psf del buco perché anche lui ha una psf quindi sarà proporzionale alla psf di eccitazione per quella di rilevazione. Il prodotto di due psf nel caso sia una gaussiana è una gaussiana più stretta, cioè il sigma della gaussiana si riduce di una radice di due. Questo microscopio supera il limite di Abbe in teoria.

Lo fa in teoria perché il buchino non lo possiamo stringere all'infinito perché la probabilità che un fotone entri sarà zero. Solo in teoria il confocale può essere un qualcosa che può risolvere la microscopia standard. Ma di fatto non lo è perché per far passare la luce il buchino lo dobbiamo aprire. Se vediamo il rapporto segnale rumore in funzione dell'apertura della focale, quando andiamo a stringere crolla a zero (sono i grafici in basso). Vediamo nel grafico a destra come crolla l'intensità, nel wide field è sempre costante perché colleziona tutto; invece, in quella confocale quello che succede è che man mano che ci distanziamo dal fuoco perdiamo luce acquisita che è quello che vogliamo; quindi, andiamo di fatto a illuminare un volume grosso ma abbiamo trovato un trucco per estrarre informazioni da un volume più piccolo. Per quanto riguarda la scansione, la prima cosa chesi fa è la scansione del fascio. Abbiamo l'obbiettivo a destra, noi dobbiamo inclinare l'angolo rispetto all'asse ottico, abbiamo un sistema quattro f dove noi mettiamo la pupilla dell'obbiettivo di ingresso nel fuoco della seconda lente e il sistema di scansione nel fuoco della prima lente. Il fascio non deviato è quello in grigio chiaro, quando cambio la direzione ho il grigio scuro però il sistema me lo ripresenta sempre sulla pupilla di ingresso dell'obbiettivo con angolo variato. Questo in direzione x, quindi solo per un angolo. Posso farlo per due angoli, mettendo due specchi molto vicini l'uno con l'altro (galvanometrico) dove uno specchio fa la scansione in una direzione e una in un'altra. Quindi metto questo sistema a due assi nella parte SS del primo grafico. È molto utilizzato ma ha dei problemi. Se noi vogliamo tenere sempre il fascio di ingresso nell'obbiettivo in pupilla c'è bisogno che

il sistema di scansione sia sempre nel fuoco di f1, mase noi abbiamo due specchi fisicamente separati cosa mettiamo?Ad esempio, possiamo mettere uno specchio che mi fa la scansione lungo un assepoi un sistema 4f che mi risistema il fascio su un secondo specchio e poi uso un altrosistema 4f che mi riplotta il fascio sulla pupilla sull'obbiettivo. Questo è proprio ilcore di un sistema confocale, perchè io eseguo delle scansioni, non formo immaginie quanto siamo veloci dipende da questi specchi.Il detector pure è importantissimo perchè dobbiamo acquisire i fotoni, usiamo in-fatti i fotomoltiplicatori. Il funzionamento è semplice, se metto al pin hole un detec-tor normale, un semiconduttore, arrivano i fotoni e inserisco un mezzo di conver-sione (fotocatodi). I fotoni vengono trasferiti in elettroni e un qualunque sensore ot-tico non sarà mai in grado di leggere 100 elettroni ( se ho una efficienza del 100%).Quindi faccio un sistema di elettromoltiplicazione,

arriva la luce, ho il fotocatodo che mi genera gli elettroni, l'elettrone trova un sistema di accelerazione cioè viene tenuto il potenziale ad un potenziale maggiore del fotocatodo fino a sbattere nel primo diodo accelerato. L'elettrone ha acquisito energia cinetica, questa energia crea altri elettroni cioè da 1 ne genera 3, questi 3 ne generano altri 3 perché vengono accelerati. Vengono raccolti tutti dall'anodo e sono sufficienti per essere visti. I più performanti sono i gasp con una efficienza quantica alta. Quello che faccio è eccitare la molecola fluorescente, prendere il quantitativo di elettroni (tempo di parcheggio) e mi sposto in un altro tempo facendo la scansione del piano. Il segnale di corrente, quindi, poi viene integrato e poi c'è un amplificatore. Sono importanti tempi di scarica del condensatore.

MICROSCOPIA OTTICA NON LINEARE

Il microscopio con focale, di fatto utilizza un laser che va a focalizzare in un

puntodel campione. Abbiamo un filtro spaziale che va a selezionare il contributo della fluorescenza che proviene esclusivamente dal piano focale. Il trucco è eccitare il campione con un volume di eccitazione molto grosso in particolare in Z, però poi andiamo ad estrarre informazioni da un volume piccolo. Il costo è il photogliching o fotodanneggiamento. Quando acquisiamo il segnale e ci spostiamo sui vari piani per ricostruire l'immagine tridimensionale di fatto i piani sono stati già eccitati quindi possono essere andati incontro a quei fenomeni. Non si può ridurre il volume di eccitazione perché è dato dalle caratteristiche del fascio focalizzato che radialmente non è puntiforme ma è caratterizzato da una PFS e assialmente avrà la geometria definita dal cono. Questo però vale con un singolo fotone. Questo è lo schema a singolo fotone, abbiamo un fotone che vada S0 a S1, la fluorescenza e così via.

Il volume di eccitazione, quindi sappiamo da cosa deriva. Le cose cambiano se utilizziamo due fotoni di energia più bassa e lunghezza di onda maggiore che, sommando le due, riescono a portare la molecola nello stato di eccitazione. Questo fenomeno non dovrebbe essere permesso. Dove c'è la linea tratteggiata non esiste un livello energetico. Esiste però un principio, detto di indeterminazione di Heisenberg, che dice che l'energia può anche non essere conservata se questa si verifica in tempi molto brevi. In teoria quindi quella transizione non potrebbe avvenire, però se in qualche modo arriva il primo fotone e porta la molecola in questo livello che chiamo virtuale, (qui siamo già al di fuori della conservazione dell'energia), e se in un istante molto molto breve arriva subito un altro fotone che lo porta nello stato eccitato, a quel punto l'energia si conserva. Quindi questa transizione può avvenire a patto che i due fotoni arrivino.