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FASI DI MICROINIEZIONE
Super ovulazione di femmine, dobbiamo avere tanti zigoti• su cui effettuare la microiniezione, alla fine gli zigoti dacui nascono gli animali sono circa meno il 10% di zigotisu cui viene fatta la microinizezione. La stimolazionedella superovulazione viene fatta con iniezione di dueormoni ovvero il Follino e Corulon e fatte a temporegolari, cioè il primo viene fatto 3,5 giorni prima dellainiezione, e l’altro a 1,5 prima della iniezione.Successivamente gli animali vengono messi inaccoppiamento, faccio accoppiare con maschi fertili, eportano a un numero alto di zigoti fecondatiLa procedura si vede nel disegno, si tratta con ormoni lafemmina fertile, fatta accoppiare con un maschio fertili, e poi daqueste femmine vengono presi zigoti fecondanti che di solitosono circa 25-30 per femmina. Contemporaneamente si fannoaccoppiare femmine dette Foster con maschi vasectomizzati,da questo accoppiamento non abbiamo nascita di cuccioli maserve a preparare
quelle femmine ad accogliere una gravidanza, sono quelle su cui si rimpiantano gli zigoti Alessandro Giramondi Quindi si ottiene da una parte degli zigoti, ed dall’altra delle femmine che sono psudogravide. Il trapianto viene fatto su oociti, in particolare su quello più grande. Inoculo va a buon fine quando vediamo un piccolo gonfiore nel nucleo. Dopo la microiniezione le cellule vengono lasciate per tutta la notte in incubatore, così da poter distinguere le cellule sopravvissute all'iniezione da quelle morte in seguito al trattamento, si selezionano quelle che sopravvivono e poi rimpiantate nell'infundibulo delle femmine foster. L'utero nei topi è fatto a V, è fatto con 2 braccia che termina nell'ovidotto e ovaio. Infundibulo è vicino all'ovidotto. Dopo 230 giorni nascono i cuccioli che dovranno essere valutati per vedere se c'è il transgene. Il metodo più usato per caratterizzare il transgene è southner blotting,
ma che è più lungo. Si usa anche PCR, la quale non ci permette di determinare il numero esatto di copie. L'altro metodo per produrre transgenici è il metodo di iniziazione nelle cellule staminali: questo metodo prevede la trasformazione di cellule staminali embrionali murine e la loro iniezione in blastocisti murine. Il Metodo principale è quello di inserire un frammento genico nel gene che si vuole attivare, di solito si usa il gene per la resistenza della neomicina che viene inserito nel gene target. Il vettore in questo caso ha ai lati del gene 2 regioni di omologia, omologhe rispetto al gene che si vuole interrompere in modo che il gene della neomicina poi venga inserito nel gene target. Si usa il gene della resistenza alla neomicina in modo da avere una selezione positiva dei cloni delle cellule staminali in cui viene fatto iniezione, inoltre la metodica prevede una soluzione negativa, cioè inserzione ai lati il gene della timidina chinasi, che mi va amodificare un farmaco che è ganciclovir, che non è tossico, ma lo diventa se modificato dalla timidina. Se mi si inserisce il gene della neomicina all'interno del mio gene che voglio inattivare, allora il gene non avrà il frame corretto per la sua sintesi, dando neomicina muoiono tutte le cellule staminali in cui il gene della neomicina non è inserito, ma siccome può succedere che se metto regioni di omologia per indirizzare l'inserimento che il gene delle neomicina si inserisca nel genoma, in questo caso mettendo un gene per la selezione negativa, se la ricombinazione avviene correttamente allora non si integra, se invece si inserisce in maniera casuale nel genoma allora ho anche il gene della timidina chinasi, allora le cellule moriranno. Le cellule staminali sono quelle che derivano dalle blastocisti murine, sono totipotenti, si arricchisce la popolazione di cellule che hanno integrato in maniera corretta, e poi dopo qualche settimana sono.ri-iniettate nelle blastocisti murine, le quali sono impiantate in una femmina. In questo caso abbiamo inserito nelle blastocisti delle cellule esogene di un altro topo, magari di un ceppo diverso, transgeniche che formano vari organi. Ci sono sempre due iniezioni dei due ormoni. Le blastocisti poi vengono reimpiantate nell'utero, quindi il reimpiantamento è più semplice. Alessandro Giramondi Quelli che nascono non sono transgenici, nasce un topo che deriva da una blastocisti murina in cui sono state iniettate delle cellule knock out, i topi che nascono sono delle chimere perché alcuni tessuti derivano da cellule che erano della blastocisti altri tessuti derivano da staminali che sono state modificate geneticamente, di solito si usa ceppi diversi di topo, in modo che le chimere abbiano chiazze di colore diverso, come bianco e nero, nero e marrone. La blastociste ospite era di un topo bianco, le cellule transgeniche erano di un topo nero, queste chimere vengono fatte.riaccoppiare con partner di ceppo uguale alla blastocisti su cui abbiamo staminale, se le staminali transgeniche sono di topo nero, la chimera viene fatta accoppiare con topo bianco, perché se la linea germinale della chimera deriva da cellule transgeniche trasmette il suo patrimonio genetico alla generazione successiva. Questi sono i due metodi più usati, ma hanno dei problemi, se ad esempio modifico e vado a bloccare o inserire un gene che ha caratteristiche tossiche per embrioni oppure inattivo un gene fondamentale per lo sviluppo allora il topo non nasce ma è transgenico, oppure posso se blocco p53 usando un promotore forte però di tessuto non specifico rischio che il topo sviluppi malattie in più organi, o è fertile quindi si ha la necessità di evitare l'espressione del transgene o inattivazione di un gene. Per questo si usano transgenici condizionali, il più conosciuto è quello che sfrutta riarrangiamento TET e quelli che usano.Il riarrangiamento del testo è il seguente:
Sono entrambi binari, usano un substrato ed effettore. Il sistema TET viene usato per attivare o spegnere un gene in un periodo della vita dell'animale, voglio attivare un gene quando il topo ha due mesi di vita, uso questo sistema.
Esistono due varianti:
- TET OFF
- TET ON
Il sistema sfrutta la resistenza alla tetraciclina di Escherichia coli e ha due componenti:
- tetR, che è il recettore della tetraciclina
- TRE che si trova nel promotore in cui si lega il recettore della tetraciclina
In presenza di tetraciclina deve essere espresso il gene della resistenza, in assenza di tetraciclina il recettore è legato al promotore e blocca la trascrizione, quando è presente la tetraciclina, il recettore si stacca dal promotore e parte la trascrizione.
Il primo sistema sviluppato è stato TET-OFF in cui si lega al recettore della tetraciclina una parte della activation domain di una proteina di herpes virus. Il recettore funziona da attivatore.
e solo quando abbiamo tetraciclina si blocca la trascrizione del gene. Quindi un transgenico è knock out con tetraciclina. È stato sviluppato TET ON in cui abbiamo mutazioni nel repressore, la tetraciclina deve attivare il gene, il recettore tetR si lega al promotore solo in presenza delle tetraciclina e siccome porta l'activation domain della proteina, quando si lega attiva i geni della resistenza. RICOMBINASI Cre è il più usato e prevede la presenza di doppi transgenici, sfrutta la ricombinasi Cre e taglia la doppia elica laddove abbiamo sequenze chiamate loxP, ed è abbastanza usato perché in base a come sono posizionati questi loop, si ottiene effetto diverso, se per esempio uso un gene che esprime ricombinasi Cre e lo accoppio con un topo che esprime un gene con ai lati loxP, inserito per esempio un gene p53 mutato, accoppiandosi con il topo avrò un topo che nel fegato ha l'enzima cre, e p53 mutato, per cui nel fegato si andrà aIn diagnostica e in medicina di ultrasuoni si è avuto nel 1900 con Dussik che ha fatto le prime ecografie per uso clinico. Ad oggi gli strumenti sono cambiati, e si fa ecografia perché non è invasiva, rapida, si diagnostica subito un trauma o problema. Sfrutta gli ultrasuoni cioè il suono che ha una frequenza maggiore di 2 megaHz.
L'ultrasuono colpisce gli oggetti allo stesso modo del suono e può esser riflesso, trasmesso, attenuato o scattering nelle varie direzioni e questo porta a capire le caratteristiche della materia che l'onda colpisce e in base all'onda riflessa, che è quella che ritorna alla sonda, si riesce ad avere una ricostruzione dell'immagine. Essendo un'onda sonora è definita dalla frequenza, dalla lunghezza d'onda e ampiezza. In particolare, ci interessa la frequenza, che è fondamentale per capire cosa vogliamo fare, maggiore è la frequenza maggiore è la risoluzione.
dell'immagine che si ottiene, ma minore è la capacità di penetrazione dell'ultrasuono. Nell'uomo si usano basse frequenze o medie, perché ci permettono di arrivare in organi profondi ma si ha minore capacità risolutiva, in pre clinica si usano sonde ad alta frequenza perché ci permettono di avere dettagli, più risoluzione ed essendo usati topi o ratti non si ha bisogno di grande prenotazione. Quando si parla di ultrasuoni si deve parlare delle varie modalità, la prima a usata è A-mode in cui si riesce ad individuare ostacoli che si hanno nella profondità, e si capisce che si ha un ostacolo, ad esempio se viene fatta per vedere l'occhio, allora il primo ostacolo è la parete posteriore e l'altro quella anteriore. Un altro metodo &
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