Appunti di Microbiologia - Tipi di Microscopi e preparazione dei campioni

ARETE DEI GRAM

La parete dei gram+ è costituita da una componente predominante, il peptidoglicano, che forma uno strato

molto spesso. Altre componenti sono:

 Gliaciditeicoici, ovvero dei polimeri formati da unitá di ribitolo o glicerolo unite da legami

fosfodiestere.

 Gli acidilipoteicoici, che prendono contatto con la membrana plasmatica.Gli acidi teicoici

hanno molteplici funzioni: facilitano l'assunzione di cationi, hanno funzione strutturale,

funzione patogenica (come LTA degli streptococchi che media l'adeisivitá alle superfici delle

mucose), o ancora, funzione di immunogenicitá.

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 Gli aciditeucouronici, caratterizzati dall'assenza del legame fosfodiestere, sono costituiti da

subunitá alternate di: NAG + uno fra ac. glucuronico, ac. amminoglucuronico o ac.

amminomannuronico. In alcuni batteri sono sintetizzati al posto dei teicoci quando in carenza

di fosfato.

4.2. P -

ARETE GRAM

Hanno uno strato di peptidoglicano più sottile. La struttura procede oltre il peptidoglicano,

formando anche una membrana esterna. Fra membrana esterna ed interna troviamo lo

spazio periplasmico.

Il foglietto esterno della membrana esterna è composto diversamente da quello interno,

specialmente perché troviamo intercalati dei lipo-polisaccaridi. Inoltre,troviamo

un'ancora lipoproteica fra il foglietto interno e il peptidoglicano (lipoproteinamureinica)

e le porine.

Lo spazio periplasmico come potrebbe sembrare non è affatto uno spazio inerte, infatti questo “ambiente”

svolge diverse funzioni come: l'acquisizione di nutrienti mediante i sistemi di trasporto, la generazione di

energia mediante i sistemi di trasporto, la sintesindel peptidoglicano, la biogenesi della membrana esterna e

altri componenti (pili e flagelli), la presenza di enzimi che inattivano antibiotici e di chaperonineper il

ripiegamento delle proteine della membrana esterna.

Il lipopolisaccaride come già detto è uno dei componenti della membrana esterna. La parte più esterna è

chiamata antigenesomatico o antigene O. Poi troviamo un outercore e un innercore, infine troviamo il

lipideA. La catena laterale O si interfaccia con il sistema immunitario ed è molto variabile, infatti serve sia

per distinguere le specie che i ceppi all'interno di una specie:contiene unitá ripetute di zuccheri comuni e

inframezzate da alcuni zuccheri non comuni, come l'abequosio. Il lipide A invece è formato da un dimero di

NAG fosforilata con una catena di acidi grassi: è fondamentale nella tossicitá dei batteri, infatti è causa dell

shock endotossico (una volta lisate le cellule batteriche, viene libersto questa tossina).

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5. PEPTIDOGLICANO E TOSSINE

Il peptidoglicano è formato da una ripetizione di NAM e NAG, ovvero acido N-acetilmuramico e N-

acetilglucosammina. Il NAM è l'etere lattico del NAG, poiché ha un lattato sul C3. La porzione peptidica del

peptidoglicano è formata da 4 AA. Questo tetrapeptide non è formato dai ribosomi, poiché troviamo

aminoacidi insoliti. In ordine:

1. L-alanina

2. D-glutammato

3. Acido meso-diaminopimelico nei Gram- e L-lisina nei Gram+

4. D-alanina

Questo tetrapeptide è legato al NAM e due tetrapeptidi si legano fra loro fra l'AA in posizione 3 e quello in

posizione 1. Nei Gram+ questo avviene grazie a un ponte pentaglicinico, mentre nei Gram- è diretto. Quindi

il 3° aminoacido forma 3 legami peptidici in totale.

5.1. B IOSINTESI DEL PEPTIDOGLICANO

In presenza di penicillina in una coltura di S. aureus si osservava la presenza di una molecola, ovvero UDP-

NAM-pentapeptide, che venne chiamata nucleotidediPark. C'è quindi un AA in più e questo è dovuto al

fatto che al momento della genesi del peptide, all'acido meso-diaminopimelico viene aggiunto un dimero di

D-alanina. La sua idrolisi verrá sfruttata per fornire energia nella formazione del legame crociato. Il processo

biosintetico è il seguente:

  

F-6-P + glutammina glucosammina-6-P + acetil-CoA N-acetilglucosammina-6-P (isomerasi) NAG-

 

1-P Entra UTP, esce PPi, quindiUDP-NAG Entra PEP, quindi UDP-NAM

Il nucleotide di Park viene trasportato dal

bactoprenolo, una molecola che possiede 11 catene

isopreniche legate a un PP, che tramite un

movimento flip-flop trasporta all'esterno il

nucleotide. Questo trasporto segue diverse tappe:

1. Defosforilazione del bactoprenolo

(questa tappa è target di alcuni

antibiotici), reazione con UDP-

NAM, con fuoriuscita di UMP.

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2. UDP-NAG reagisce con NAM, esce UDP. Quindi si è formata l'unitá del peptidoglicano.

3. Flip-flop e ri-formazione del bactoprenolo-PP che viene defosforilato tornando nuovamente

disponibile

4. La transglicosidasi forma il legame beta-1,4-glicosidico fra le unitá NAM-NAG. La

transpeptidasi forma invece il legame fra L-lisina (nei Gram+) o meso-diaminopimelico (nei

Gram-) e D-alanina.

Letranspeptidasi hanno una forte affinitá per gli antibiotici beta-lattamici e per questo vengono chiamate

penicilline bindingprotein (PBP). La transglicosidasi e la transpeptidasi possono essere presenti su enzimi

bifunzionali: mentre tutte le PBP hanno attivitátranspeptidasica, alcune PBP hanno anche

attivitátransglicosidasica.

Della parete degli Archea sono stati caratterizzati i componenti ma non come sono organizzati.

5.2. A UTOLISI DEL PEPTIDOGLICANO

Questo processo avviene ad opera di enzimi chiamati autolisine. Queste sono divise in diverse famiglie, a

seconda di quale legame vanno a rompere:

 Muramidasi: tagliano legame beta-1,4 fra NAG e NAM

 Amidasi: tagliano legame fra NAM e L-alanina, separando quindi glicano e peptide

 Endopeptidasi: tagliano legami peptidici interni

 Carbossipeptidasi: rimuovo l'ultima D-alanina

Le funzioni delle autolisine sono svariate e vanno dall'accrescimento cellulare, al turnover del

peptidoglicano, alla separazione delle cellule figlie, alla creazione di spazi per le strutture esterne (flagelli),

alla sporulazione e germinazione della spora.

5.3. T OSSINE BATTERICHE

Quando un batterio viene ucciso dal sistema immunitario

dell’ospite e lisa, i suoi componenti strutturali vengono

liberati. Il lipide A, essendo parte integrante della

struttura del batterio è definito endotossina, mentre le

esotossine sono sostanze che vengono secrete

all'esterno.Esistono sostanziali differenze fra eso ed

endottosine, riportate nella tabella di fianco. 9

L'endotossina (lipide A) viene riconosciuto dal sistema immunitario una volta che il batterio è stato lisato e

questo segue un determinato meccanismo. Le cellule danneggiate inviano chemochine (IL-8); vengono

attivati i neutrofili (che producono chemochine MIP proteine infiammatorie dei macrofagi); vengono

attivati i macrofagi (chemochine, prostaglandine, trombossani, PAF). Il lipide A interagisce con una proteina

extracellulare (LBP) che va a legarsi sul recettore CD14 dei macrofagi. Una volta legata al recettore LBP

viene rilasciata. Al complesso recettore-lipideA si lega un corecettoretoll-like e da qui parte una cascata che

porta all'attivazione del fattore di trascrizione NFkB: questo induce la trascrizione di proteine

infiammatorie.La risposta generale che provoca questa cascata di eventi è: attivazione macrofagi; rilascio

radicali liberi battericidi; coagulazione per localizzare l'infezione; incremento della permeabilitá vasale. Se

l'infezione diventa sistemica si va incontro a quello che si chiama shock endotossico, che consiste in:

vasodilatazione generalizzata; coagulazione intravasale disseminata (CID), insufficienza multiorgano,

radicali liberi che danneggiano l'ospite, febbre elevata non controllabile.

Esistono due modi per verificare la presenza di endotossine in un campione:

 Test pirogeno del coniglio

 Saggio del limulus nell'emolinfa di questo crostaceo troviamo un solo tipo cellulare,

gliamebociti. Prelevata l'emolinfa facciamo pellettare gli amebociti, li lisiamo e li

liofilizziamo. L'endotossina, se presente nel campione da noi aggiunto, attiva un pro-enzima,

una coagulasi. La coagulasi converte il coagulogeno in coagulina e la soluzione diventa solida.

6. STRUTTURE ED APPENDICI ESTERNE DEI BATTERI

Oltre alla parete batterica possono essere presenti anche due altri tipi di strutture esterne: queste sono lo

strato S e la capsula. Questi sono fondamentali nella adesione alle superfici e nella protezione dai macrofagi,

poiché vengono mascherate le parti antigeniche del batterio.

6.1. S S

TRATO

È uni strato proteico che puó essere glicosilato che poggia sullo strato di peptidoglicano nei Gram+, mentre

nei Gram- poggia o sulla membrana esterna o sulla membrana plasmatica. Può svolgere varie funzioni,

ovvero: barriera, setaccio molecolare, adesione, forma e rigiditá, protezione dai macrofagi

6.2. C APSULA

Molti batteri secernono uni strato polisaccaridico, chiamato glicocalice. Quando

questo è ben strutturato e adeso alla parete viene chiamato capsula, altrimenti viene

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chiamato semplicemente strato mucoso.Esempio: il meningococco di tipo B presentava la capsula con acido

sialico, che è tipico degli eucarioti. Questi strati possono essere visualizzati al microscopio ottico utilizzando

inchiostro di china, che non colorerà il batterio poiché è presente la parete. Funzioni di capsula e strato

mucoso: conferiscono adesivitá (placca dentale è un biofilm fatto da Streptococcusmutans, che produce

destrano); ostacolano fagocitosi; proteggono da virus, sostanze tossiche o essiccazione.

6.3. F LAGELLI

Sono stutture rigide e sottili, con una lunghezza fino a 15-20 micron e diametro di circa 20 nm. La subunitá

che costituisce il flagello è la flagellina.Anche i batteri non dotati di flagelli possono muoversi in acqua

seguendo movimenti browniani. Questo è stato osservato prendendo dei tubuli da inoculo e mettendo terreno

di agar molle 0.7%. Con un'ansa preleviamo un pezzetto di coltura e penetriamo l'agar molle con l'ansa. Se

osserviamo dopo un giorno quelli mobili saranno vicili alla linea di infissione.

I flagelli si possono disporre in modo diversi e vengono definiti: monotrico, lofotrico, anfitrico, peritrico. Il

flagello puó essere visto anche al microscopio ottico: questo sipuó fare ispessendo il flagello con dei

mordenti come l'acido tannico o l'allume di potassio che precipitano sul flagello, seguendo con una

colorazione con fucsina basica. Il mordente fa da ponte fra struttura e colorante.

Struttura: si ancora a livello della membrana

plasmatica con l'anello C (rotore); a questo

sono associate le proteine MotA e MotB, che

sfruttano i gradienti di Na+ o H+ per muoversi.

Il corpo basale deve inserirsi nei vari livelli e

questo lo fa gr