Appunti di Microbiologia - Tipi di Microscopi e preparazione dei campioni

Introduzione

Nascita della microbiologia

Il primo microscopio risale al 1684, grazie al Leeuwenhoek che ne costruì uno con potere di ingrandimento 270x. All’inizio si pensava che quando, ad esempio, il cibo andava in putrefazione ci fosse una generazione spontanea di organismi, micro e non. Furono condotti diversi esperimenti atti a confutare questa ipotesi:

• Esperimento di Redi (contenitori con carne tappati)
• Esperimento di Spallanzani (brodo di coltura)
• Esperimento di Pasteur (palloni a collo di cigno)

Sulla Terra ci sono all’incirca 4-6*10³⁰ procarioti. Nel solo organismo umano se ne contano 10¹³ contro un totale di 10¹⁴ di cellule umane!

Microscopia ottica ed elettronica

L’occhio umano ha un potere risolutivo di 0.1mm, che sarebbe la distanza minima fra due punti distinti in modo da discriminarli come tali. Esiste per l’occhio inoltre il punto prossimo, equivalente a 250mm, distanza al di sotto della quale il cristallino non si accomoda più.

Il microscopio semplice è composto da una lente di ingrandimento, un portavetrino e uno specchio e può ingrandire fino a un max di 10x, mentre il microscopio composto può ingrandire fino a un max di 1000x (10x dell’oculare moltiplicato per 100x dell’obiettivo). A minore distanza focale corrisponde un maggiore potere risolutivo, tuttavia esiste un limite intrinseco: il potere risolutivo è collegato alla λ della luce impiegata. Per aumentare la risoluzione possiamo usare λ minori (UV).

La luce bianca che attraversa i campioni biologici non subisce variazioni, quindi questi risultano invisibili, tuttavia se usassimo la colorazione per visualizzarli questa li ucciderebbe. Per poter osservare i campioni in vivo si può ricorrere a due microscopi:

• Microscopio a contrasto di fase: sfrutta le differenze degli indici di rifrazione fra campione e mezzo, che modificano velocità e direzione della luce. Prende i raggi emergenti dal vetrino e genera un terzo raggio detto raggio diffratto, che permette di osservare ad esempio la motilità dei batteri, oppure spore all’interno della cellula madre.
• Microscopio in campo oscuro: i raggi che attraversano il mezzo vengono deviati, quindi si vede il campione su fondo oscuro.

Preparazione campioni in campo chiaro

Fissazione: con un’ansa preleviamo il campione dal terreno e lo mettiamo sul vetrino dove era stata messa una goccia di soluzione fisiologica. Stemperiamo (spargiamo) i batteri sul vetrino, lo lasciamo asciugare all’aria e in seguito fissiamo il campione facendo passare il vetrino su una fiamma, permettendo la conservazione delle strutture biologiche.

Colorazione: i coloranti sono molecole con gruppi cromofori, che emettono il colore, e con gruppi auxocromi, che legano le strutture del materiale da colorare. Troviamo diversi tipi di coloranti: coloranti ionici (acidi o basici), coloranti covalenti (colorante di Feulgen per DNA), coloranti idrofobici (nero Sudan per strutture lipidiche). Una colorazione importante è la Colorazione di Gram, che consiste in diverse fasi:

• Colorazione primaria con cristalvioletto, che lega la parete batterica
• Aggiunta di un mordente (Lugol), come ioduro di potassio e iodio, che rafforza il legame fra cristalvioletto e parete batterica.
• Decolorazione tramite lavaggio con etanolo, e da qui già individueremo i gram negativi poiché a causa della loro parete più lassa perderanno il colorante
• Colorazione di contrasto con safranina che colorerà di rosso i gram negativi per poterli evidenziare

Un altro tipo di colorazione è la Colorazione per acido-resistenza (Ziehl-Neelsen), utilizzata nel caso dei micobatteri, poiché questi presentano sullo strato esterno della parete acidi micolici (a lunga catena ramificati) che impediscono la colorazione di Gram. Ne sono un esempio i micobatteri della tubercolosi e della difterite. Si effettua aggiungendo dapprima un colorante primario, la fucsina basica fenicata per 3-5 min a caldo col vetrino poggiato su beaker con acqua scaldata (il trattamento con acido fenico serve a facilitare l’ingresso del colorante). Si procede poi con decolorazione e lavaggio a caldo con HCl 3% in etanolo per 1 min. Infine si farà una colorazione di contrasto con blu di metilene. Quindi i micobatteri appariranno rosa (fucsina) su uno sfondo blu pallido, mentre altri batteri non resistenti alla decolorazione risulteranno blu (blu di metilene).

Microscopio a fluorescenza

Composizione: viene utilizzata una lampada a vapori di mercurio che produce luce UV; segue un filtro di eccitazione, che seleziona solo il passaggio di luce UV a una determinata lunghezza d'onda (monocromatica); un condensatore in campo oscuro, che genera uno sfondo su cui risaltano gli oggetti fluorescenti; un filtro di sbarramento, che evita danno agli occhi e riduce il contrasto dell'immagine. Si utilizzano fluorocromi per colorare il campione in esame. Questi fluorocromi tuttavia sono generalmente mutageni perché sono in grado di legare il DNA. A volte vengono invece usati anticorpi fluorescenti, come nel caso della tecnica FISH (fluorescence in situ hybridization).

Microscopio laser a scansione confocale

Un raggio laser focalizzato colpisce un punto del campione, solitamente trattato con fluorescenti. La luce emessa dal punto illuminato viene raccolta su un piano, bloccando la luce fuorifuoco, ottenendo immagini nitide 3D. Il laser effettua una scansione del campione e per questo si può ottenere la tridimensionalità.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Così chiamato perché le zone trasmettono la luce in modo diverso a seconda della densità dei corpi colpiti. Se il batterio è di circa 1 micron e il potere risolutivo del microscopio ottico è max 0,17 micron con luce UV, noi potremo apprezzarne solo la struttura esterna. Utilizzando invece fasci di elettroni (λ = 0.005nm) potenzialmente si potrebbe avere un ingrandimento 1000x rispetto a quello ottico, per un totale di 1.000.000x; in realtà si ottengono 150.000-200.000x, poiché subentrano limitazioni pratiche. Il fascio di elettroni è generato da un filo di tungsteno e viene concentrato sul campione da un condensatore. Si usano lenti elettromagnetiche poiché gli elettroni non sono in grado di attraversare il vetro. Inoltre, si deve generare un vuoto spinto nella colonna affinché gli elettroni non collidano con le particelle presenti nell'aria. Una volta colpito il campione, gli elettroni vengono dispersi a seconda della densità dei corpi che colpiscono: le zone scure saranno quelle a maggior densità poiché sullo schermo arriveranno meno elettroni.

La preparazione del campione per TEM segue diverse fasi:

• Il prelievo del campione viene eseguito il più rapidamente possibile
• La fissazione può essere fisica, con T molto alte o molto basse, o chimica, generalmente usando formaldeide
• La disidratazione avviene facendo passare il campione in concentrazioni via via crescenti di alcol fino ad alcol assoluto
• L'inclusione, ovvero la sostituzione dell'acqua con resine o paraffine, materiali duri e omogenei
• Il taglio, usando un ultramicrotomo, creando fette di 20-100 nm
• La colorazione, al fine di esaltare le differenze di densità, grazie a OsO₄ o citrato di Pb

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Gli elettroni trasmessi sono quelli trasmessi dalla superficie dell'oggetto. Quando il fascio primario colpisce una particolare area, gli atomi della superficie emetteranno una piccola quantità di elettroni, detti secondari, che vengono raccolti da un rivelatore, amplificati e convertiti in immagine. La preparazione del campione è più semplice rispetto al TEM e prevede: prelievo, fissazione, disidratazione, essiccamento, montaggio.

Membrane e trasporti

Membrana plasmatica

Fra i procarioti che hanno una particolare membrana plasmatica troviamo i metanotrofi e i micoplasmi, che hanno una membrana particolarmente ricca in steroli, dal momento che non sono dotati di parete cellulare. Negli archeobatteri la membrana può essere formata da:

• Dietere di glicerolo, ovvero il glicerolo ha legati sul C1 e sul C2 due catene isopreniche a 20C con un legame etere (fitanile). La disposizione è sempre bilaminare.
• Tetraetere di di-glicerolo, ovvero le due catene isopreniche sono unite che le due catene isopreniche del foglietto opposto, creando di fatto un'unica grande molecola (bifitanile). Questo è utile per sopportare grossi stress fisici ai quali alcuni archeobatteri sono sottoposti.

È importante ricordare che negli archea il glicerolo è L, mentre nei batteri è D. Per quanto riguarda gli steroli, negli Eubatteri troveremo l'opanoide mentre negli Archea lo squalene.

Sistemi di membrane interni

Nei procarioti non troviamo organuli, ma possiamo trovare dei sistemi membranosi che possono avere svariate funzioni. Ad esempio, i mesosomi sono invaginazioni della membrana plasmatica che formano vescicole, tubuli o lamelle e sono tipici dei batteri con elevata attività respiratoria o fotosintetica. Con protoplasma invece si intende tutta la porzione che comprende citoplasma, citoscheletro e nucleoide: quest'ultimo è costituito per il 60% da DNA, per il 30% da RNA e per un 10% da proteine (un'eccezione sono i Plantomiceti che posseggono una doppia membrana nucleare). Poi troviamo i ribosomi che nei procarioti sono 70S, formati dalla 50S (rRNA 23S+5S) e dalla 30S (rRNA 16S). Infine, possiamo trovare dei corpi di inclusione come i granuli di riserva per varie molecole come polisaccaridi, polifosfato, poli-idrossibutirrato (riserva di C), cianoficina (riserva N), zolfo. Alcuni corpi di inclusione sono specifici come:

• Microcompartimenti cellulari: sono poliedrici e rivestiti da gusci proteici e contengono enzimi funzionalmente correlati. Ad esempio, i carbossisomi contengono RuBisCO e anidrasi carbonica.
• Magnetosomi: contengono Fe sotto forma di magnetite, greigite o pirite. Sono utili per dirigersi verso e lungo la crosta terrestre, infatti sono tipici di batteri acquatici che vivono nella colonna d'acqua.
• Vescicole gassose: sempre tipiche dei batteri acquatici per spostarsi verticalmente e cambiare le condizioni di luce e ossigeno. Sono formate da 2 proteine, le GvpA che formano nastri paralleli e le GvpC che formano legami crociati fra gli anelli.

Sistemi di trasporto transmembrana

La diffusione di ioni e piccole molecole nel periplasma è possibile grazie alla presenza di proteine canale, dette porine. Oltre a canali non specifici esistono canali specifici, come LamB che permette l'ingresso di maltosio e maltodestrine in E. Coli.

I procarioti liberano nell'ambiente circostante esoenzimi ed altre proteine, col meccanismo della secrezione proteica. Questo meccanismo nei Gram- è più difficoltoso poiché posseggono un'altra membrana. In entrambi troviamo un sistema di trasportatori che vanno sotto il nome generale di sistema SEC. La proteina che deve essere estrusa ha sull'N-terminale una sequenza leader. La prima proteina con cui si interfaccia il peptide è la proteina SecB, appartenente alla classe delle chaperonine: questa serve a svolgere le strutture secondarie e terziarie. Il canale attraverso cui passano le proteine è formato dalle proteine YEG, e il passaggio attraverso questo canale è possibile grazie all'energia fornita dalle SecA che idrolizzano ATP. Questo sistema trasporta proteine ancora non ripiegate, mentre esiste un sistema, chiamato TAT (Twin Arginin Transport) che interviene nel trasferimento di proteine già ripiegate.

Nei Gram- sono stati identificati 5 meccanismi di secrezione proteica per attraversare la seconda membrana che possono essere sec-dipendenti (II e V) o sec-indipendenti (I, III e IV). Alcuni formano un intero canale fra citoplasma e ambiente esterno. Vedendoli in dettaglio:

• Sistema di secrezione di tipo II (sec-dipendente): è usato sia da molti patogeni che non. La proteina viene estrusa una volta ripiegata nel periplasma
• Sistema di secrezione di tipo V (sec-dipendente): detto anche sistema di autotras...