Appunti Microbiologia

Microbiologia

La microbiologia è una scienza giovane, solo nella seconda metà del XIX secolo fu possibile iniziare a studiare i microrganismi in laboratorio. Le dimensioni degli organismi microbici ne impediscono l'osservazione ad occhio nudo, però possiamo vederli in forma aggregata come nel caso dei corpi fruttiferi dei funghi oppure in biofilm o su alimenti avariati. Noi ce ne cibiamo, ci aiutano a produrre cibi e bevande ma possono anche farci ammalare. Si intende per microorganismi batteri, lieviti e funghi, i virus sono entità.

La prima rivoluzione tecnologica

Si ha l'avvento del microscopio nel XVII secolo, che fu una tappa fondamentale nella scoperta del mondo microbico. Robert Hooke nel 1665 pubblicò l'esatta descrizione di un microscopio con una sola lente e disegni di corpi fruttiferi di funghi che aveva osservato.

Leeuwenhoek fu un commerciante di stoffe a Delft in Olanda, e fu il primo a descrivere batteri, lieviti e protozoi. Egli era appassionato a costruire microscopi che potevano raggiungere ingrandimenti di circa 50-300 volte. Egli disegnò e descrisse nel 1676 le cellule di alcuni “animalcules” acquatici, batteri e lieviti. Dopo queste scoperte iniziali, l'esplorazione del mondo microbico si è arrestata per circa 100 anni.

Il microscopio che mise a punto è un microscopio a singola lente all'interno di una piastra metallica, con convessità per ingrandire ciò che si osservava, e un piccolo spillo che permetteva di analizzare campioni piccoli e due viti, che permettevano di osservare il campione sia in verticale che in orizzontale.

Ferdinand Cohn studiò le alghe unicellulari e il batterio Beggiatoa. Paul Ehrlich sviluppa nel 1881 la colorazione vitale dei batteri con blu dimetilene. Nel 1884, Hans Christian Gram, medico e farmacologo danese, sviluppò un metodo di colorazione differenziale che da lui prese il nome di colorazione di Gram.

La teoria della generazione spontanea

L'idea della generazione spontanea di organismi viventi è antica, semplice. Si pensava che gli organismi potessero nascere spontaneamente dal cibo in putrefazione, come le larve di insetti, oppure dalle acque stagnanti e perfino topolini dalle derrate alimentari. Il dibattito scientifico e filosofico sulla generazione spontanea è durato fino alla fine del XIX secolo. La sua confutazione ha richiesto lo sviluppo della teoria cellulare e della biogenesi.

Il medico Francesco Redi nel 1668 fece uno dei primi tentativi di confutazione della teoria della generazione spontanea. La generazione spontanea di organismi di grandi dimensioni veniva confutata. Egli mise un pezzo di carne in un contenitore aperto all'aria e dopo qualche giorno vedeva la formazione di larve, insetti. Se il contenitore era chiuso, non si notava la comparsa di organismi, quindi confutò l'ipotesi. Fece un terzo esperimento con un contenitore coperto da garza, che non permettesse il passaggio di cose molto piccole e notò che le larve non potevano formarsi. L'ultimo esperimento prevedeva che la garza precedentemente sul contenitore venisse posizionata sulla carne e il contenitore chiuso si nota lo sviluppo di larve e insetti, quindi la garza contiene qualcosa che possa favorire lo sviluppo di insetti. Rimaneva il problema dell'origine dei microorganismi.

Spallanzani osservò che in un brodo di carne sottoposto a bollitura prolungata non si osservava crescita se si sigillava la fiasca in cui era stato bollito. L'obiezione fu che la bollitura distruggeva la forza vitale.

Un secolo dopo Louis Pasteur confutò definitivamente la teoria della generazione spontanea attraverso una serie di esperimenti. Egli utilizzò una fiasca in cui si versava brodo e modificò la fiasca in modo tale che avesse una curvatura a cigno, facendo depositare il materiale polveroso dell'aria. Se sterilizzo il contenitore e lo divido in due abbiamo due possibilità: se il contenitore rimane dritto, il brodo rimane sterile in quanto le forme viventi rimangono nella parte terminale del collo, se il contenitore viene inclinato e il brodo viene a contatto con la polvere nel collo, il liquido va incontro a putrefazione e viene popolato da microorganismi. Nell'aria quindi sono presenti microorganismi che non si vedono ma che a contatto con cibo possono crescere.

Trovavano quindi pieno sviluppo la teoria cellulare e la teoria della biogenesi. La teoria della biogenesi postula che ogni cellula deriva da un'altra cellula, ogni organismo vivente è generato da un altro organismo vivente. Le contraddizioni di questa teoria stavano per essere affrontate attraverso lo sviluppo delle teorie evoluzioniste di Lamarck e Darwin e dagli studi sull'origine della vita.

Robert Koch sviluppò un metodo per coltivare i microorganismi su terreno solido attraverso l'uso di gelatina o l'uso di fette di patata sulla cui superficie potevano crescere microorganismi formando delle specie di colonie. Walter Hesse introdusse l'uso dell'agar come agente solidificante per i terreni di crescita. Julius Petri nel 1887 introdusse l'uso di scatole di vetro, le capsule o piastre di Petri.

Le malattie infettive

Nel 1546 Girolamo Fracastoro di Verona pubblicò “De contagionem”, alcune malattie causate da forme viventi invisibili che si potevano trasmettere per contatto diretto attraverso oggetti inanimati a distanza. Davaine dimostrò che Bacillus anthracis, poteva causare il carbonchio, una malattia negli animali. Lister sviluppò una tecnica di antisepsi chirurgica. La teoria microbica delle malattie è dovuta al lavoro di Robert Koch e Louis Pasteur. Koch isolò per la prima volta un microorganismo causa di malattia e dimostrò che Bacillus anthracis è l'agente eziologico del carbonchio. Koch isolò Mycobacterium tuberculosis e il vibrione del colera. Sviluppò i criteri generali/sperimentali per definire se un determinato agente biologico è causa di una malattia, postulati di Koch. Nel 1905 fu insignito del premio Nobel per la medicina.

Postulati di Koch

• Il sospetto patogeno deve ritrovarsi in tutti i casi di malattia ed essere assente in animali sani. Gli strumenti utilizzati sono microscopio e colorazione per evidenziarlo e isolarlo dal sangue di animali malati.
• Il sospetto patogeno deve poter crescere in coltura pura. Si crea quindi una coltura di laboratorio dopo averlo isolato.
• Le cellule provenienti da una coltura pura del sospetto patogeno devono indurre malattia in animali sani. Si utilizzano cavie a cui si iniettano i patogeni.
• Il sospetto patogeno deve poter essere nuovamente isolato e se ne deve poter dimostrare l'identità con l'originale, attraverso un nuovo isolamento in laboratorio e coltura.

Sono valide ancora oggi, ma si conoscono patogeni che non possono essere coltivati e possono anche non causare malattia nei soggetti asintomatici.

I postulati di Koch molecolari

• Il gene implicato nella patogenicità o virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una data specie ed essere assente nelle specie non patogene.
• L'inattivazione selettiva del gene deve portare a una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.
• La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità o virulenza. Parimenti, l'introduzione del gene in un ceppo non patogeno lo trasforma in un patogeno.

Luis Pasteur, oltre al contributo per la confutazione della teoria della generazione spontanea, fu molto attivo nello sviluppo di vaccini. Nel 1885 somministrò per la prima volta a un uomo il vaccino contro la rabbia. Il grande successo ottenuto portò alla fondazione dell'Istituto Pasteur di Parigi.

La lotta alle malattie infettive

Con l'aumentare delle conoscenze relative alla patogenicità dei microorganismi, iniziò lo sviluppo di antibiotici. Fleming, un medico scozzese che faceva ricerche presso il St. Mary’s Hospital di Londra, scoprì la penicillina nel 1929, sostanza prodotta da un fungo del genere Penicillium. Nel 1930, Domagk, che lavorava alla Bayer Chemical Company in Germania, scoprì i sulfamidici. Da allora sono state scoperte una ventina di classi di antibiotici, diverse per meccanismo di azione, prodotte da batteri e da funghi e sviluppate per uso medico.

La scoperta della diversità microbica

Beijerinck e Vinogradskij furono tra i primi grandi microbiologi a studiare i microorganismi dell'ambiente. Beijerinck sviluppò la tecnica delle colture di arricchimento ed isolò numerosi batteri con specifici metabolismi come: azoto fissatori, solfato riduttori, zolfo ossidanti, lattici. Vinogradskij introdusse il concetto di chemiolitotrofia e coniò il termine autotrofia. Le scoperte della grande variabilità microbica portarono alla necessità di definire metodi di classificazione dei microorganismi. Inizialmente esisteva un grosso gruppo dei protisti che comprendeva la maggior parte dei microorganismi. Questo poi è stato suddiviso, si ha quindi il dominio dei batteri, archea e eucarioti.

La filogenesi molecolare

A partire dagli anni '60 si cominciarono a sviluppare metodi basati sull'analisi e la comparazione del materiale genetico come mezzo per determinare le relazioni filogenetiche tra organismi diversi. Woese applicò il concetto di filogenesi molecolare all'analisi delle sequenze nucleotidiche dell'RNA ribosomiale (rRNA 16S, marcatore del mondo degli eucarioti) e propose il nuovo phylum degli Archea, diverso ma correlato filogeneticamente sia ai batteri sia agli eucarioti. I procarioti sono batteri e archea che si differenziano da eucarioti. Tramite l'analisi dell'rRNA 16S si è elaborato un albero, la quale distanza dalla radice agli organismi indica la distanza, o la distanza tra due microorganismi, rappresentano le distanze filogenetiche tra questi, quindi essere classificati. La microbiologia può essere divisa in tante branche ed è una scienza di base e applicata.

Jan Kluyver definì la moderna concezione di unitarietà nelle reazioni biochimiche. Avery nel 1944 dimostrò che il DNA è la sede del materiale ereditario. Nel 1943, con esperimenti condotti su Neurospora crassa, Beadle e Tatum formularono l'ipotesi che ogni gene codifica per una proteina. Furono scoperti negli anni '40 la coniugazione e la trasduzione e Mullis nel 1985 sviluppa la tecnica della reazione a catena della polimerasi, nota come PCR. Dopo il 2000 è stato caratterizzato il sistema CRISPR-Cas.

Evoluzione della vita

La Terra si è formata circa 4.5 miliardi di anni fa, sulla base di analisi di isotopi radioattivi a lento decadimento. Un'ipotesi sostiene che la vita possa aver avuto origine ben al di sotto della superficie terrestre, a sorgenti idrotermali sul fondo dell'oceano, dove l'abbondante disponibilità di energia sotto forma di composti inorganici ridotti: idrogeno (H₂) e idrogeno solforato (H₂S). Qualche forma di chimica prebiotica deve aver facilitato lo sviluppo dei primi sistemi auto-esplicanti, i precursori della vita cellulare si pensava fossero gli RNA, la vita è iniziata in un mondo di RNA, che hanno anche capacità catalitica. Alla fine, si è stabilito il DNA, una molecola che è intrinsecamente più stabile dell'RNA e quindi un miglior repository di informazioni genetiche (codificanti). L'ultimo antenato universale comune (LUCA) deve essere esistito a 3,8-3,7 miliardi di anni fa, l'ultimo antenato che ha portato la vera e propria suddivisione tra batteri e archea.

Si è passati da un mondo a RNA a uno a DNA. Il metabolismo energetico delle cellule primitive sarebbe stato esclusivamente anaerobico. Durante questo periodo, la CO₂ potrebbe essere stata la principale fonte di carbonio per le cellule, l'H₂ era un combustibile importante per il metabolismo energetico delle cellule primitive, lo zolfo elementare potrebbe essere stato uno dei primi accettori di elettroni. Queste prime forme di metabolismo chemolitotrofico guidate da batteri hanno supportato la produzione di composti organici dalla fissazione autotrofica di CO₂. Questo avveniva a livello di sorgenti idrotermali sotto l'oceano. In questo ambiente le cellule cominciano a specializzarsi producendo amminoacidi, lipidi, acidi nucleici e organizzandosi con membrane.

L'ambiente era favorito poiché ricco di idrogeno, un elemento importante per il metabolismo dei primi organismi. Una idrogenasi primitiva trasforma lo zolfo, utilizzato come donatore di elettrone, in H₂S in una reazione di ossidoriduzione. Questo permetteva attraverso un ATP sintasi primitiva la produzione di energia tramite flusso di elettroni e protoni attraverso la membrana.

Le prime forme di fotosintesi erano anossigeniche, usando donatori di elettroni come l'H₂S e generando zolfo elementare (S₀) come prodotto di scarto. Da 2,5-3,3 miliardi di anni fa, gli antenati degli odierni cianobatteri hanno evoluto un fotosistema capace di fotosintesi ossigenica generando O₂ come prodotto di scarto. In questo modo l'ossigeno prodotto ha poi determinato la comparsa di altri organismi e metabolismi che sfruttano l'ossigeno, uno dei composti ossidanti più importanti. Abbiamo evidenza della comparsa degli eucarioti, oltre alla comparsa dell'ozono a protezione dell'atmosfera, fino ad arrivare all'era cambriana dove compaiono gli animali.

Formazioni microbiche fossili chiamate stromatoliti (rocce stratificate) possono essere trovate in rocce che hanno 3,5 miliardi di anni, fornendo le prime prove conclusive della vita sulla Terra, dimostrando quindi che questi organismi sono esistiti. L'ossigeno diventa fondamentale per la successiva evoluzione. Il metabolismo dei cianobatteri ha prodotto O₂ che ha ossidato i minerali ridotti contenenti Fe²⁺, agli ossidi di ferro contenenti Fe³⁺. Con l'accumulo di O₂ sulla Terra, l'atmosfera è gradualmente passata da anossica ad ossigenata. L'atmosfera di ossigeno ha creato le condizioni per l'evoluzione di vari nuovi schemi metabolici, come l'ossidazione del solfuro o la nitrificazione. I microorganismi che hanno sviluppato la capacità di respingere l'O₂ hanno ottenuto un enorme vantaggio energetico a causa dell'elevato potenziale di riduzione O₂/H₂O.

Man mano che la Terra diventava più ossica, sorsero microorganismi eucariotici contenenti organelli. L'ipotesi endosimbiontica spiega come si sono originati gli organelli degli eucarioti e in particolare afferma che i mitocondri degli eucarioti moderni, nacquero dall'incorporazione stabile di un batterio che respira in altre cellule, e che i cloroplasti si formarono in modo simile dall'incorporazione di un organismo simile a un cianobatterio che eseguì la fotosintesi ossigenata. A prova di questo abbiamo che questi organelli possiedono RNA ribosomiale simile a quello batterico, contengono un proprio DNA circolare con marcatori genetici simili a quelli dei batteri e ne richiamano la morfologia.

Vi sono due teorie su come ciò è accaduto:

• La prima ipotesi indica che l'evento di endosimbiosi a dare il mitocondrio è avvenuto dopo un evento di biforcazione, in cui una linea ha dato origine agli Eukaria e l'altra agli Archea. Questa ipotesi non spiega però come mai la loro membrana è molto simile. Si ha un ancestore in comune che da origine a entrambi da una diramazione, e gli eukaria si originano dal ramo principale a causa di un evento di endosimbiosi di un batterio che respira nella cellula.
• La seconda ipotesi vede l'evento di endosimbiosi prima della diramazione che porta a Eukaria e Archea. Sembra che si abbia la fagocitosi da parte di cellule di batteri che respirano, e la divisione delle due linee sia avvenuta successivamente. Questo giustificherebbe lo stesso tipo di membrana tra i due. Gli eucarioti hanno poi dato origine alle cellule animali (animali, funghi e protisti) con mitocondri e a quelle vegetali (piante e alghe) con mitocondri e cloroplasti.

Filogenesi molecolare

Il primo tentativo di descrivere una storia evolutiva comune di tutte le cellule viventi fu pubblicato da Ernst Haeckel nel 1866. Poiché i microorganismi non condividono alcun tratto morfologico con piante e animali, era impossibile creare un robusto quadro evolutivo che includesse i microorganismi, quindi non era possibile determinarne una classificazione. Quando il DNA è stato scoperto, è stato riconosciuto che la storia evolutiva è registrata nella sequenza del DNA. Carl Woese ha realizzato negli anni '70 che la sequenza delle molecole di rRNA e dei loro geni poteva essere utilizzata per dedurre le relazioni evolutive tra organismi. A questo punto è stato possibile determinare una classificazione per i microorganismi e disegnare la storia evolutiva, analizzando le sequenze e l'evoluzione dell'rRNA.

I geni dell'rRNA sono eccellenti candidati per l'analisi filogenetica perché sono:

• Universalmente distribuiti, tutti i procarioti li possiedono
• Funzionalmente costanti, il loro numero è costante
• Altamente conservati
• Di lunghezza adeguata per fornire una visione profonda dell'evoluzione delle relazioni evolutive.

Uno dei geni utilizzati è il gene che codifica per l'rRNA 16S per i procarioti o 18S per gli eucarioti, che codificano questi piccoli rRNA utilizzati per la sintesi del ribosoma. La maggior parte della molecola è conservata ma troviamo 9 regioni che corrispondono a 9 regioni variabili da batterio a batterio. In base alla variazione di queste regioni è possibile confrontare i vari batteri e identificare a quale queste appartengono. Woese ha confrontato le sequenze di molecole di rRNA (SSU rRNA) di subunità di piccole dimensioni come RNA 16S.